不同溫度組合熱處理治療柑橘黃龍病的田間效果分析

姚林建 易龍 李雙花 陳毅群

摘要：【目的】研究不同溫度組合熱處理對柑橘黃龍病的控制效果，為柑橘黃龍病防治提供新思路。【方法】以12株感染柑橘黃龍病的紐荷爾臍橙為材料，設(shè)4個處理（處理1：對照，不作任何處理；處理2：套膜，薄膜中間不打孔；處理3：薄膜中間打10個半徑為1.5 cm的孔洞；處理4：薄膜中間打10個半徑為3.0 cm的孔洞），每處理4株病樹，分別于2017年8月6、12、19、25日和9月2日進(jìn)行5次熱處理試驗，熱處理時間為溫度較高的14：00～15：00，每隔5 min記錄一次溫度。處理前每組采集樣品作為參照組，5次熱處理后再次采集樣品，并通過實時熒光定量PCR（qPCR）定量分析5次熱處理后病菌含量相對其參照組的倍數(shù)，分析柑橘黃龍病菌在經(jīng)過熱處理后的變化趨勢?！窘Y(jié)果】處理2和處理3的平均溫度均超過38.0 ℃，最高溫度分別為49.3和42.3 ℃；5次熱處理后病樹體內(nèi)病菌含量顯著下降（P<0.05，下同）；病情指數(shù)明顯降低，病情明顯好轉(zhuǎn)；價值果產(chǎn)量下降較緩，平均損失率分別為17.71%和14.52%；但處理2的溫度過高，在治療的同時易對樹體造成傷害，樹冠部分出現(xiàn)萎蔫、焦黃等現(xiàn)象。處理4的最高溫度僅為37.3 ℃，未達(dá)到治療柑橘黃龍病的有效溫度，其病情指數(shù)上升，病情加重，病菌含量也有所上升，價值果平均損失率為41.18%。對照組病情持續(xù)加重，樹勢明顯衰退，病菌含量顯著升高；價值果產(chǎn)量下降最明顯，平均損失率為72.22%?！窘Y(jié)論】經(jīng)過5次熱處理后，處理3的柑橘黃龍病樹病情指數(shù)顯著降低，癥狀明顯減輕，樹體病菌含量明顯下降，樹勢明顯好轉(zhuǎn)，對柑橘黃龍病的治療效果最佳。在發(fā)病嚴(yán)重的柑橘園可通過該方式延長果樹的掛果周期，從而減少經(jīng)濟損失。

關(guān)鍵詞： 柑橘黃龍病；熱處理；實時熒光定量PCR

中圖分類號： S436.661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1346-05

0 引言

【研究意義】柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）屬細(xì)菌性病害，其病原為韌皮部桿菌屬中難培養(yǎng)細(xì)菌（Wang et al.， 2017； Hu et al.， 2018）。柑橘感染黃龍病后其樹體嚴(yán)重衰弱，從而降低了果實產(chǎn)量和質(zhì)量，給柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失（Qureshi and Stansly，2009）。柑橘生產(chǎn)大國，如中國、巴西、印度、墨西哥和美國等均受到黃龍病的嚴(yán)重威脅（Food and Agriculture Organization Corporate Statistical Database，2009），各柑橘生產(chǎn)大國均十分重視對該病的防控，投入了大量的人力、財力進(jìn)行研究。至今我國僅見柑橘黃龍病菌亞洲種的報道（Candidatus Liberbacter asiaticus）（Kong et al.，2000），該病原菌能侵染目前所有已知的橘類品種（Zhang et al.，2014）。感病柑橘樹田間主要表現(xiàn)為樹勢衰退，出現(xiàn)斑駁黃化型葉片，果實無味，出現(xiàn)“紅鼻果”等癥狀（羅志達(dá)等，2009）。目前，針對柑橘黃龍病的防控仍以防為主，尚無特效藥及抗病品種（Bove，2006）。因此，尋找適合大田防治柑橘黃龍病的方法，對保障我國柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】熱處理也稱熱療，是應(yīng)用較早的一種脫毒技術(shù)（Desvignes et al.，1999）。柑橘黃龍病熱處理技術(shù)的主要原理是利用外界的傳熱介質(zhì)，如光照、濕熱空氣、熱水或蒸汽等，向感染黃龍病的柑橘植株傳遞足夠熱量，在不影響其正常生長的前提下，使黃龍病病菌鈍化甚至死亡，黃龍病癥狀消失（Doud et al.，2014；Jumaill and Ehsani，2015）。Hoffman等（2013）在40.0～42.0 ℃的高溫下對感病的柑橘苗進(jìn)行熱處理試驗，經(jīng)實時定量PCR檢測，處理組柑橘黃龍病病菌含量顯著降低，甚至完全消失，而對照組仍保持高度的感病狀態(tài)。范國成等（2016）在夏秋季對40株感染柑橘黃龍病的柑橘樹進(jìn)行3次間歇性自然熱罩處理，3個月后病樹癥狀明顯減輕，病菌含量也顯著降低，平均降低80.00%以上，最高下降了99.98%，而對照組病菌含量則顯著增加，平均增加了20倍?！颈狙芯壳腥朦c】目前，利用熱處理方式對黃龍病樹進(jìn)行治療已有少量研究報道，但仍未得出最佳的溫度與時間組合治療方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)高溫可降低或消滅柑橘植株體內(nèi)黃龍病病菌的原理，利用夏秋季節(jié)的高溫，在感染柑橘黃龍病的果園選擇適合的病樹進(jìn)行熱處理試驗，通過實時熒光定量PCR（qPCR）定量分析不同組合熱處理對柑橘黃龍病的治療效果，從而尋找合適的溫度與時間搭配方式，為柑橘黃龍病防治提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗于2017年在江西省贛州市崇義縣關(guān)刀坪3～6年生紐荷爾臍橙園內(nèi)進(jìn)行。選取16株地理位置相近的臍橙樹，每株在標(biāo)記枝條上采集4張葉片，經(jīng)常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR檢測均感染黃龍病。

1. 2 試驗方法

試驗設(shè)4個處理，每處理4株病樹，處理1為對照（CK），其他3組用薄膜進(jìn)行相應(yīng)處理，其中處理2薄膜中間不打孔、處理3薄膜中間打10個半徑為1.5 cm的孔洞、處理4薄膜中間打10個半徑為3.0 cm的孔洞，以控制膜內(nèi)溫度。將聚乙烯薄膜套在試驗病樹上方自制的支架上，地面用泥土封實，對照組不作任何處理。選擇熱處理的時間為溫度較高的14：00～15：00。每組懸掛1個溫度計，每隔5 min記錄一次數(shù)據(jù)。每處理重復(fù)3次。試驗區(qū)除特別注意柑橘木虱的防治外其他按常規(guī)管理，處理組和對照組保持水肥、施藥一致。從2017年8月6日開始進(jìn)行熱處理，此后的處理時間分別為8月12、19、25日和9月2日（所選時間當(dāng)天最高溫度均超過30.0 ℃）。在第1次熱處理前及最后一次熱處理后各采集樣品一次，熱處理前樣品作為參照組。采樣方法：在病樹樹冠的前后左右中5個方位隨機采樣，各方位采集4片成熟葉片，為保證葉片病菌的含量不變，采集的葉片要盡快處理或置于4 ℃保存。

1. 3 柑橘黃龍病病癥評估方法

為更直觀地了解熱處理對病樹的影響，參考范國成等（2016）的評估方法，根據(jù)葉片病害嚴(yán)重程度共分為4個等級：0級，葉片上無斑駁黃化癥狀，樹勢良好；1級，葉片斑駁黃化面積少于1/3，樹勢一般；2級，葉片斑駁黃化面積在1/3～2/3，樹勢較差；3級，葉片斑駁黃化面積大于2/3，樹勢極差。在試驗組和對照組病樹上選取病癥直觀，存在較大級別差異的病枝，記錄并標(biāo)記20片葉片的病癥級別，在所有熱處理結(jié)束后再觀察一次，計算病情指數(shù)。

病情指數(shù)=∑（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×3）×100

1. 4 DNA提取及qPCR檢測分析

切取各葉片少許中脈，在液氮中研磨成粉末，用CTAB法提取DNA，用微量核酸濃度儀（NanoDrop One/OneC）測定各樣品的DNA濃度，并將其濃度稀釋至50 mg/L，置于超低溫冰箱中保存。

qPCR檢測引物和內(nèi)參引物分別為HLB-CQULas04F/HLB-CQULas04R（陳仕欽，2013）和UPL7-F/UPL7-R（盧占軍等，2016），引物均由華大基因公司合成。qPCR反應(yīng)體系20.0 μL，其中上、下游引物各0.5 μL，無菌水8.0 μL，稀釋的DNA模板1.0 μL，SYBR Master Mix 10.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，采集熒光信號，進(jìn)行40個循環(huán)；熔解曲線，95 ℃ 10 s，67 ℃ 5 s，每增加0.5 ℃ 5 s， 95 ℃ 15 s。每個樣品3個重復(fù)，每次擴增分別設(shè)1個陽性對照、1個陰性對照和1個清水對照。反應(yīng)在ABI Step-One上運行。

以qPCR檢測分析得到的循環(huán)閾值（Cycle thresho-ld，Ct）分別為目的基因和內(nèi)參基因的Ct。根據(jù)所得的Ct計算每次樣品相對參照組的倍數(shù)，從而得出柑橘黃龍病菌在經(jīng)過熱處理后的變化趨勢。qPCR檢測的Ct為3次檢測結(jié)果的平均值，參考Livak和Schmittgen（2001）的方法進(jìn)行計算。

1. 5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 12.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 各處理溫度檢測結(jié)果

由表1可知，對照組在5次熱處理中的最高和最低溫度分別為33.2和30.2 ℃；處理組平均溫度均高于對照組，其中以處理2的平均溫度最高，其最高和最低溫日與對照組的溫差分別為17.2和14.4 ℃；處理4的平均溫度相對較低，其最高和最低溫日與對照組的溫差分別5.8和4.6 ℃；處理3的平均溫度均在38.0 ℃以上，其最高平均溫度為42.3 ℃。差異顯著性分析結(jié)果表明，只有處理2與對照組存在顯著差異（P<0.05，下同），處理3和處理4與對照組差異不顯著（P>0.05，下同）。可見，覆膜處理可有效提高樹體周圍溫度，通風(fēng)口面積是影響膜內(nèi)溫度的重要因素。

2. 2 柑橘黃龍病病癥評估結(jié)果

由表2可知，帶病樹經(jīng)過5次熱處理后，處理3的癥狀有明顯好轉(zhuǎn)，病情指數(shù)明顯降低，較處理前降低27.73%，抽生了大量新梢，且葉片無明顯斑駁黃化癥狀，樹勢較處理前有明顯好轉(zhuǎn)；處理2的病情雖有明顯好轉(zhuǎn)，但因溫度過高對樹體造成傷害，樹冠部分出現(xiàn)萎蔫、焦黃等現(xiàn)象；對照組和處理4的斑駁黃化癥狀明顯加重，病情指數(shù)均高于處理前，部分葉片全部黃化出現(xiàn)木栓化?？梢姡瑴囟仁沁M(jìn)行田間熱處理的關(guān)鍵因素，處理4的最高溫度僅為37.3 ℃，未達(dá)到殺滅或抑制病菌的溫度，從而使病情加重，但相較于對照組其病情加重的速度較慢；而處理2和處理3的平均溫度均在38.0 ℃以上，熱處理效果顯著。

2. 3 柑橘黃龍病病菌含量變化分析結(jié)果

qPCR檢測結(jié)果（表3）表明，5次熱處理后，處理2和處理3的病菌含量相對其參照組有明顯降低，分別是其參照組的28.00%和30.67%倍，表明試驗樹的病情有明顯好轉(zhuǎn)；對照組經(jīng)過5次熱處理后病菌含量快速增加，是其參照組的6.5631倍；處理4的病菌含量相對其參照組有所上升，是其參照組的1.6301倍，但較對照組上升速度減緩?？梢?，未經(jīng)熱處理的感病柑橘樹在自然條件下病菌濃度上升極快，而經(jīng)過5次超過38.0 ℃的熱處理治療后病菌含量均有所下降，但平均溫度達(dá)49.3 ℃后會對樹體造成傷害。

2. 4 柑橘黃龍病樹價值果產(chǎn)量分析結(jié)果

如圖1所示，經(jīng)過5次熱處理后，柑橘黃龍病病樹的價值果（具有經(jīng)濟價值的商品果）總體產(chǎn)量均有所下降，其中，對照組價值果產(chǎn)量下降最明顯，價值果平均損失率為72.22%；處理4的熱處理溫度雖然較低，但對病情起到一定的延緩作用，價值果產(chǎn)量下降相對較慢，價值果平均損失率為41.18%；處理2和處理3的價值果產(chǎn)量下降較緩，價值果平均損失率分別為17.71%和14.52%?？梢姡行У臒崽幚硎共涞牟∏榈靡詼p輕，同時對病菌的復(fù)制起到抑制作用，有效地降低了價值果的損失率。

3 討論

目前報道我國柑橘黃龍病病原為耐熱型的亞洲種，其在35.0 ℃以下能正常增殖，但經(jīng)過38.0 ℃以上高溫處理后病菌濃度會明顯下降（Lopes et al.，2009）。在田間熱處理過程中，溫度過高會導(dǎo)致植株芽條焦死。研究表明，植株芽條致死溫度與黃龍病病菌殺滅溫度存在明顯差異（賈志成等，2015），因此，正確選取田間熱處理的溫度和時間，在有效熱處理殺滅病菌的同時不破壞樹體尤為關(guān)鍵。

本研究利用8～9月的夏秋高溫、強光照，用聚乙烯膜對感病柑橘樹進(jìn)行熱處理，處理2和處理3的平均溫度在38.0 ℃以上，均達(dá)到破壞黃龍病病菌亞洲種的有效溫度，在經(jīng)過5次熱處理后，病樹的病情指數(shù)較處理前有明顯降低，而對照組和處理4的病情指數(shù)明顯升高。處理3的樹勢有明顯好轉(zhuǎn)，新抽的枝條無斑駁黃化型葉片出現(xiàn)，處理后斑駁黃化葉片癥狀也相應(yīng)減輕。處理2整體樹勢有所好轉(zhuǎn)，病癥也相應(yīng)減輕，但由于熱處理的溫度過高，最高溫度達(dá)49.3 ℃，超過其正常生長溫度，對樹體造成傷害。對照組和處理4的平均溫度均在38.0 ℃以下，最高溫度分別為33.2 ℃和37.3 ℃，未達(dá)到破壞柑橘黃龍病病菌的有效溫度，病情加重，出現(xiàn)更明顯的斑駁黃化型葉片，樹勢逐漸變差，新梢抽生較少。

5次熱處理的結(jié)果表明，有效的熱處理后柑橘黃龍病病菌濃度明顯下降，處理2和處理3植株病菌含量較其參照組分別降低至26.00%和30.67%倍；對照組和處理4病菌含量明顯升高，病菌含量分別是其參照組的6.5631和1.6301倍。說明高溫有抑制病原菌增殖的作用，使樹體內(nèi)病原菌含量降低。

本研究結(jié)果顯示，在5次熱處理后感病柑橘樹雖然病情有所好轉(zhuǎn)，但仍可檢測出黃龍病菌，其原因可能是5次的熱處理不足以消除樹體內(nèi)的全部病菌，也可能是黃龍病菌在高溫時失去活性，在常溫下又得以恢復(fù)；此外，熱處理方法無法對病樹根部進(jìn)行處理，根部的病菌難以清除。鑒于熱處理方法無法根除病樹體內(nèi)的病菌，結(jié)合其他措施防治又會加大成本，因此，對于發(fā)病較輕的果園不宜使用該法處理感病柑橘樹，可及早挖除補種無病苗木，對于發(fā)病嚴(yán)重且周邊無其他柑橘園的病樹可采用熱處理方法以延長果樹掛果年限。

4 結(jié)論

田間感染柑橘黃龍病的病樹經(jīng)過5次熱處理后，薄膜中間打10個半徑為1.5 cm孔洞的處理能達(dá)到治療柑橘黃龍病的有效溫度，其病情指數(shù)顯著降低，癥狀明顯減輕，樹體病菌含量明顯下降，樹勢明顯好轉(zhuǎn)，對柑橘黃龍病的治療效果最佳。在發(fā)病嚴(yán)重的柑橘園可通過該方式以延長果樹的掛果周期，從而減少經(jīng)濟損失。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）