湖南省長沙市番茄黃化曲葉病毒的檢測與系統(tǒng)發(fā)育分析

魯清華 張宇 張松柏 彭靜 鄭立敏 張德詠 劉勇

摘要：【目的】對湖南省長沙市發(fā)生的疑似番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）樣本進(jìn)行檢測，明確TYLCV在湖南長沙的發(fā)生情況，為TYLCV的防控提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā?016年3和11月，在湖南長沙采集疑似TYLCV樣本48份，采用已發(fā)表的TYLCV不同株系的全基因組序列，利用DNAMAN進(jìn)行序列比對，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)特異性引物TY-T-F和TY-T-R、TY-P-F和TY-P-R對番茄樣本的DNA進(jìn)行PCR、Southern印跡雜交（Sourthern blotting）檢測和系統(tǒng)發(fā)育分析。對呈陽性條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收并送樣測序，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，利用系統(tǒng)發(fā)育分析TYLCV湖南長沙分離物與國內(nèi)外株系的相似性。【結(jié)果】采集的48份樣本中有42份樣本能擴(kuò)增出目的條帶，陽性檢出率為87.5%；將42個(gè)陽性克隆序列導(dǎo)入MEGA 7.0，得到27個(gè)分離物。對測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析、多重比對、聚類分析及進(jìn)化分析，結(jié)果顯示27個(gè)湖南長沙TYLCV分離物與我國其他省（市）分離物的相似性在98.5%～99.8%，與伊朗株系（AJ132711和GU076453）、墨西哥株系（FJ012358）、澳大利亞株系（GU178814）和葡萄牙株系（AF105975）的相似性分別介于90.7%～91.5%、95.4%～95.5%、98.6%～98.8%和99.3%～99.4%。【結(jié)論】TYLCV已在湖南長沙發(fā)生危害，需加強(qiáng)檢疫工作，防止從疫區(qū)調(diào)運(yùn)感病番茄，以控制病害擴(kuò)散蔓延。

關(guān)鍵詞： 番茄黃化曲葉病毒；番茄；檢測；湖南長沙

中圖分類號： S436.412.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1332-06

0 引言

【研究意義】番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是一種在全世界暴發(fā)的番茄病毒之一。最先在以色列報(bào)道發(fā)生（Picó et al.，1996），目前已逐步擴(kuò)展到熱帶和亞熱地區(qū)的多個(gè)國家（Segbefia et al.，2018），在我國江蘇（趙統(tǒng)敏等，2007；姜靜等，2018）、山東和安徽（余文貴等，2009）、天津（郝永娟等，2010；金鳳媚等，2011）、河北（李志勇等，2011）、四川（熊艷等，2011）、北京（宋晰等，2013）、湖北（湯亞飛等，2015）及河南（王浩權(quán)等，2016）等地區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重危害我國番茄等經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)。番茄是湖南省消費(fèi)量最大、栽培面積最廣的蔬菜作物之一，是農(nóng)民增收致富和出口創(chuàng)匯的重要經(jīng)濟(jì)作物，因此，對番茄黃化曲葉病害的檢疫及預(yù)防工作必須嚴(yán)格把關(guān)，以確保湖南省番茄生產(chǎn)的健康良性發(fā)展。【前人研究進(jìn)展】國內(nèi)外對TYLCV的研究主要集中在基因組結(jié)構(gòu)、傳毒介體、地理分布、癥狀和傳播途徑等方面。TYLCV屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）成員，為單組分雙生病毒，DNA-A組分大小2.7～2.8 kb，可用RNA干擾方法將植株體內(nèi)的病毒滴度降低（Ammara et al.，2015）。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing， VIGS）技術(shù)，SlMAPK3可調(diào)節(jié)水楊酸和茉莉酸的信號傳導(dǎo)，從而使番茄對TYLCV的耐受性增強(qiáng)（Li et al.，2017b）。根據(jù)生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)研究，在自然界中TYLCV經(jīng)煙粉虱持久性傳播（Kil et al.，2016；Li et al.，2017a；Zhao et al.，2018），目前已逐步擴(kuò)展到熱帶和亞熱帶地區(qū)的多個(gè)國家（Segbefia et al.，2018），并蔓延到印度洋海域和包括澳大利亞、新喀里多尼亞和毛里求斯等的太平洋海域（Mabvakure et al.，2016）。TYLCV侵染番茄的典型癥狀為上部新葉葉片黃化變小，葉緣卷曲，苗期染病可能導(dǎo)致絕收（Li et al.，2017a）。【本研究切入點(diǎn)】TYLCV是一種在全球范圍內(nèi)廣泛傳播的病毒，該病毒在我國多地被發(fā)現(xiàn)，極易隨種苗傳播，對番茄產(chǎn)業(yè)存在極大威脅。雖然該病毒的傳播介體煙粉虱在湖南省為害嚴(yán)重，但目前尚無TYLCV在湖南發(fā)生危害的報(bào)道。2016年3和11月，湖南長沙市陸續(xù)發(fā)現(xiàn)疑似TYLCV的番茄植株，本研究團(tuán)隊(duì)立即進(jìn)行大田采樣檢測，鑒定疑似該病毒的番茄幼苗及成苗，調(diào)查發(fā)生情況?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用TYLCV特異引物TY-T-F和TY-T-R、TY-P-F和TY-P-R對湖南長沙發(fā)生的疑似TYLCV番茄樣本的DNA進(jìn)行PCR和Southern印跡雜交（Sourthern blotting）檢測，以明確TYLCV在湖南長沙的發(fā)生情況，為TYLCV的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 樣本采集 于2016年3和11月從湖南長沙采集疑似TYLCV樣本48份，其中番茄幼苗15份、葉片33份（表1）。樣本用自封袋封口，寫好標(biāo)簽，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1. 1. 2 主要試劑和儀器設(shè)備 10×Buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA Marker和瓊脂糖購自北京全式金生物技術(shù)（Transgen Biotech）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒采用美國Axygen公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒；熒光染料SYBR系列購自Thermo Fisher生產(chǎn)的SYBR-GREEN系列；PCR儀為基因有限公司（Gene Company Limited）產(chǎn)品；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I購自Roche公司；BioDOC-IT凝膠成像系統(tǒng)為美國伯樂公司產(chǎn)品；陽性對照DNA由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，陰性對照為滅菌雙蒸水。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 番茄總DNA提取 采用CTAB法提取番茄葉片總DNA（Turaki et al.，2017）。番茄葉片在液氮中研磨成粉末，加入CTAB抽提緩沖液總DNA，經(jīng)氯仿∶異戊醇（體積比24∶1）純化，加入異戊醇沉淀DNA，加入ddH2O溶解，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已發(fā)表的TYLCV不同株系全基因組序列，利用DNAMAN進(jìn)行序列比對，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)特異性引物（TY-T-F：5'-CTCTGG AATGAAGGAACAGGCAT-3'，TY-T-R：5'-CCCACT

ATCTTCCTCTGCAATCCA-3'），由華大基因公司合成，預(yù)期條帶長800 bp，包含AV1及完整AC2和AC3區(qū)，分別編碼外殼蛋白（Coat protein，CP）、移動(dòng)蛋白（Movement protein，MP）及復(fù)制增強(qiáng)蛋白（Replication enhance protein，REn）。

1. 2. 3 PCR檢測 PCR反應(yīng)體系50.0 μL：10×Bu-ffer 5.0 μL、dNTP 200 μmol/L，上、下引物各1.0 μL，DNA模板0.1～2.0 μg，Taq DNA聚合酶1.0 μL，加ddH2O至50.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)果反應(yīng)。每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

1. 2. 4 電泳檢測 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和番茄總DNA用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在BioDOC-IT成像儀照像，將有特異條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。所得序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析。

1. 2. 5 Sourthern blotting檢測 根據(jù)1.2.4的測序結(jié)果設(shè)計(jì)Sourthern blotting特異性引物（TY-P-F：5'-CAGAATGTATCGAAGCCCTGATG-3'，TY-P-R：5'-TGCCTGTTCCTTCATTCCAGAG-3'），以總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段長約350 bp，回收后用Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I進(jìn)行地高辛標(biāo)記，獲得探針， -20 ℃保存。以番茄總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（0.8%濃度）、轉(zhuǎn)膜，雜交方法參照說明書。以健康番茄總DNA為陰性對照，接種TYLCV番茄總DNA作為陽性對照。

1. 2. 6 TYLCV擴(kuò)增片段序列分析 測序結(jié)果利用DNAMAN v6.0進(jìn)行序列處理，利用Seqman v7.1進(jìn)行序列同源性分析，利用MEGA 7.0進(jìn)行多重比對、聚類分析及進(jìn)化分析，采用鄰近（Neighbor-Joning）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)化樹可信度使用1000次自導(dǎo)復(fù)制驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2. 1 TYLCV在湖南長沙的發(fā)生率調(diào)查結(jié)果

分別以設(shè)計(jì)的引物對番茄樣本基因進(jìn)行PCR和Southern blotting檢測，結(jié)果分別擴(kuò)增出800（圖1和圖2）和350 bp（圖3）的片段，均與預(yù)期結(jié)果一致。表明湖南省長沙市采集的疑似感病番茄樣本均存在TYLCV侵染。

由表2可知，48份番茄樣本中有42份樣本檢測出TYLCV感染，檢出率為87.5%，其中2016年3月采集的番茄幼苗樣本TYLCV檢出率為100.0%；2016年11月采集的番茄葉片樣本TYLCV檢出率為81.8%。

2. 2 湖南長沙TYLCV分離物序列分析結(jié)果

利用DNAMAN v6.0對42個(gè)陽性序列進(jìn)行處理，同時(shí)用Seqman v7.1進(jìn)行序列同源性分析，利用MEGA 7.0進(jìn)行多重比對、聚類分析及進(jìn)化分析，結(jié)果得到27個(gè)分離物，27個(gè)TYLCV分離物的相似性在98.6%～100.0%，與我國其他省（市）分離物的相似性在98.5%～99.8%，與伊朗株系（AJ132711、GU076453）、墨西哥株系（FJ012358）、澳大利亞株系（GU178814）和葡萄牙株系（AF105975）的相似性分別介于90.7%～91.5%、95.4%～95.5%、98.6%～98.8%和99.3%～99.4%。

聚類分析結(jié)果（圖4）顯示，TYLCV可分為5個(gè)分支，TYLCV湖南長沙分離物與我國遼寧（KJ754193，KJ754194）、上海（GU434143和GU434144）和廣東（JQ867092）等?。ㄊ校┑腡YLCV分離物及澳大利亞（GU178814）、墨西哥（FJ012358）等TYLCV分離物聚類在同一分支。

3 討論

目前，TYLCV已在我國20多個(gè)?。ㄊ校┌l(fā)生并危害番茄生產(chǎn)，該病毒的傳播介體煙粉虱在湖南省為害嚴(yán)重，但尚未見在湖南省發(fā)生危害的報(bào)道。本研究對湖南長沙疑似感染TYLCV的番茄樣本進(jìn)行PCR、Sourthern blotting檢測和測序分析，結(jié)果表明湖南長沙已有TYLCV發(fā)生，是TYLCV在湖南長沙的首次報(bào)道。

從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）分析可知，湖南長沙27個(gè)TYLCV分離物的相似性在98.6%～100.0%，說明這些分離物毒源相同，番茄從同一地方調(diào)運(yùn)，11月采集的番茄樣本的毒源有可能來自3月采集的番茄；湖南長沙TYLCV分離物與我國其他?。ㄊ校┓蛛x物比較，相似性在98.5%～99.8%，從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可知，其分離物與廣東（JQ867092）、浙江（AM698117）和天津（GU563330）等株系相似性較高，與上海株系（GU434144）和遼寧株系（KJ754194）相似性最高，說明湖南地區(qū)的TYLCV最有可能來自上海或遼寧地區(qū)的番茄調(diào)運(yùn)；湖南長沙TYLCV分離物與國外分離物比較，與伊朗株系（AJ132711和GU076453）、墨西哥株系（FJ012358）、澳大利亞株系（GU178814）和葡萄牙株系（AF105975）的相似性分別介于90.7%～91.5%、95.4%～95.5%、98.6%～98.8%和99.3%～99.4%，說明湖南長沙TYLCV也有可能來自進(jìn)口自澳大利亞或葡萄牙的番茄。因此，湖南長沙TYLCV毒源可能來自澳大利亞和葡萄牙進(jìn)口的番茄，或來自遼寧和上海等地調(diào)運(yùn)的番茄。

據(jù)報(bào)道，TYLCV是一種在全世界暴發(fā)的番茄病毒之一，最先在以色列報(bào)道發(fā)生，已在中東地區(qū)蔓延（Picó et al.，1996），故而湖南長沙TYLCV分離物與中東地區(qū)伊朗株系（AJ132711和GU076453）具有90.7%～91.5%的相似性。目前TYLCV已逐步擴(kuò)展到熱帶和亞熱帶地區(qū)的多個(gè)國家（Segbefia et al.，2018），在我國江蘇（趙統(tǒng)敏等，2007；姜靜等，2018）、河南（王浩權(quán)等，2016）、山東和安徽（余文貴等，2009）、河北（李志勇等，2011）、北京（宋晰等，2013）、天津（郝永娟等，2010；金鳳媚等，2011）、四川（熊艷等，2011）和湖北（湯亞飛等，2015）等20多個(gè)地區(qū)也先后發(fā)生危害，總體趨勢是從沿海地區(qū)逐漸向內(nèi)陸乃至全國蔓延，嚴(yán)重危害我國的番茄生產(chǎn)。

目前，國內(nèi)外尚缺乏對TYLCV抗性較好的番茄品種。Mangal等（2017）分析對比辣椒和番茄的基因組，找到番茄抗性區(qū)域，雜交選育TYLCV抗性品種。Segbefia等（2018）通過對具有TYLCV抗性的野生番茄與栽培番茄回交雜交，選育出具有一定抗性的番茄品種。因此，在番茄生產(chǎn)上，選擇抗TYLCV品種非常重要。此外，在番茄苗期應(yīng)注意檢測和防治TYLCV發(fā)生危害，以防TYLCV在湖南省快速擴(kuò)展蔓延。

4 結(jié)論

對48份番茄樣本的PCR和Sourthern blotting檢測結(jié)果表明，TYLCV在湖南長沙已有發(fā)生。今后需加強(qiáng)檢疫工作，防止從疫區(qū)調(diào)運(yùn)感病番茄，以控制番茄黃化曲葉病毒病進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）