冠心病血瘀證與DNA甲基化/羥甲基化關(guān)系及研究進(jìn)展

陳悅　李杰　陳伶利　王建國　吳航宇　高玉萍　曾雪芹　張湘卓　周俊鵬

〔摘要〕 冠心病是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而引起的多基因異常的復(fù)雜性狀疾病，血瘀證是其常見證型之一。隨著冠心病表觀遺傳學(xué)的研究發(fā)展，DNA甲基化和去甲基化作為表觀遺傳中重要的修飾形式之一，二者參與了多種疾病的病理生理改變，已有研究表明表觀遺傳學(xué)中DNA甲基化修飾與癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而DNA羥甲基化修飾作為DNA去甲基化修飾的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié)也同時(shí)參與了基因的表達(dá)調(diào)控，與癌癥和精神性疾病的發(fā)生有緊密聯(lián)系。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明：DNA甲基化修飾是冠心病血瘀證的發(fā)病機(jī)制之一，基于DNA甲基化與羥甲基化之間相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系，本文推測DNA羥甲基化修飾也與心血管疾病密切相關(guān)；冠心病血瘀證的發(fā)生和發(fā)展可能與5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶之間的轉(zhuǎn)化有緊密聯(lián)系。

〔關(guān)鍵詞〕 冠心?。谎鲎C；DNA羥甲基化；DNA甲基化

〔中圖分類號(hào)〕R259 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.025

〔Abstract〕 Coronary heart disease （CHD） is a complex disease with polygenic abnormalities caused by the interaction between genetic and environmental factors， and blood stasis syndrome is one of the most common syndromes of CHD. With the development of epigenetics of CHD， DNA methylation and demethylation are one of the important forms of modification in epigenetics and are involved in the pathophysiological changes of many diseases. Some studies have shown that DNA methylation in epigenetics is closely associated with the development and progression of cancer and atherosclerosis. As a key intermediate link of DNA demethylation， DNA hydroxymethylation is also involved in gene expression regulation and is closely associated with the development of cancer and mental diseases. The previous studies of our team have shown that DNA methylation is one of the pathogeneses of CHD with blood stasis syndrome. Based on the mutual transformation between DNA methylation and hydroxymethylation， DNA hydroxymethylation may also be closely associated with cardiovascular diseases； the development and progression of CHD with blood stasis syndrome may be closely associated with the transformation between 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine.

〔Keywords〕 coronary heart disease； blood stasis syndrome； DNA hydroxymethylation； DNA methylation

冠心?。╟oronary heart disease， CHD）是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而引起的多基因異常的復(fù)雜性狀疾病，家族和遺傳因素在其發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[1-3]。隨著冠心病表觀遺傳學(xué)的研究發(fā)展，DNA甲基化和去甲基化作為表觀遺傳中重要的修飾形式之一，二者參與了多種疾病的病理生理改變，在心血管領(lǐng)域日益成為研究的焦點(diǎn)[4-6]。因DNA甲基化中的修飾堿基5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）易被10-11易位家族蛋白（ten-eleven translocation，TET）氧化形成5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）[7]，此過程又稱為羥甲基化修飾，而DNA羥甲基化與甲基化相比有不同的功能：DNA羥甲基化不止是一種中間狀態(tài)，它還能重新激活被抑制表達(dá)的基因。人基因組CpG島甲基化與基因表達(dá)較低有關(guān)，而基因內(nèi)部羥基化則與基因表達(dá)較高有關(guān)[8]。羥甲基化修飾盡管在1952年就被發(fā)現(xiàn)存在于噬菌體DNA中[9]，但直到近幾年才逐漸得到重視[10]。本文將論述冠心病血瘀證與DNA甲基化/羥甲基化關(guān)系及研究進(jìn)展。

1 DNA甲基化的研究近況

近年來，DNA甲基化是研究的熱點(diǎn)。在人的發(fā)育過程中，DNA甲基化在基因組中的變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程的結(jié)果，涉及到DNA的去甲基化[11]。DNA甲基化是指S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）上的甲基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl transferase，DNMT）的催化下，與胞嘧啶的C5位結(jié)合形成5-甲基胞嘧啶（5 mC）的化學(xué)修飾過程[12]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（如DNMTs）與DNA去甲基化酶（如TET蛋白等）可調(diào)控基因組DNA序列甲基化的動(dòng)態(tài)變化。一般來說，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化可以使一些轉(zhuǎn)錄因子無法與DNA結(jié)合而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，而該區(qū)域的去甲基化則可以激活基因的轉(zhuǎn)錄[13]。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG異二核苷酸上，在人類基因組中出現(xiàn)的幾率較低，主要集中出現(xiàn)在CpG島上。CpG島是指由200 bp的堿基組成的DNA序列中GC含量占60%以上的一個(gè)區(qū)域，這個(gè)區(qū)域主要位于某些基因的啟動(dòng)子區(qū)。CpG島上DNA的甲基化是表觀遺傳學(xué)研究中的一個(gè)重點(diǎn)，其可改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)、影響鄰近基因的表達(dá)。高度甲基化的DNA與組蛋白結(jié)合緊密，能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄抑制因子、抑制轉(zhuǎn)錄激活因子與啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而達(dá)到抑制基因表達(dá)的目的；而DNA的低甲基化使得染色體結(jié)構(gòu)松散，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活因子和RNA多聚酶與靶序列的結(jié)合，從而促使相關(guān)基因的高表達(dá)。如卵巢癌的研究表明[14]，26個(gè)與卵巢癌多藥耐藥調(diào)控顯著相關(guān)的DNA甲基化基因中，至少一半以上的DNA甲基化基因直接或間接地通過調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路響應(yīng)耐藥調(diào)控。作為癌癥發(fā)生的早期事件，DNA甲基化檢測可以在宮頸癌前病變階段做出分子學(xué)診斷，分流出亟需臨床干預(yù)措施的人群，為宮頸癌的篩查和早診早治提供新的方法[15]。在大腸癌、胃癌組織中，miR-375基因DNA甲基化陽性率與PDK1蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈正性相關(guān)關(guān)系，miR-375基因可能通過作用于3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）蛋白從而發(fā)揮抑癌基因作用[16]。DNA甲基化與口腔鱗狀細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌也具有明顯相關(guān)性[17-18]。由此可知，DNA甲基化是腫瘤抑制基因功能失活和轉(zhuǎn)錄抑制的關(guān)鍵機(jī)制之一，且在某些情況下可能是唯一的機(jī)制[15]。在心血管疾病中，動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病的始動(dòng)病因。有研究表明[19-20]，DNA的異常甲基化與AS的發(fā)生密切相關(guān)。DNA甲基化在AS的早期病變起到一定作用，它與影響AS的危險(xiǎn)因素具有一定相關(guān)性[21-22]。Zhuang等[23]學(xué)者表明，DNA甲基化的陰陽動(dòng)力學(xué)是平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換和血管重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。因此，AS的形成是多個(gè)基因甲基化以及不同基因不同甲基化水平聯(lián)合作用的結(jié)果[24]，可以認(rèn)為，在癌癥和AS疾病中，異常DNA甲基化狀態(tài)可能是此類疾病明確發(fā)生的前奏[25]。

2 DNA甲基化是羥甲基化的研究基礎(chǔ)

在研究DNA甲基化的同時(shí)，DNA羥甲基化的研究也逐漸開始。由于DNA甲基化中的修飾堿基5-甲基胞嘧啶（5 mC）易被10～11易位（TET）家族的酶氧化而形成的5-羥甲基胞嘧啶（5 hmC），這一過程稱為DNA羥甲基化，而5 hmC作為新發(fā)現(xiàn)的一種的修飾堿基，也稱為第六個(gè)堿基，以低水平存在于哺乳動(dòng)物的多種細(xì)胞類型中[26]，在基因的打開和關(guān)閉中起著重要的作用。5 mC修飾和5 hmC修飾都與基因表達(dá)密切相關(guān)[8]。但它們有不同的功能，CpG島5 mC修飾可抑制基因表達(dá)，且基因量較少[27]，而在胸腺嘧啶DNA糖基化酶（thymine DNA glycosylase，TDG）和去甲基酶（demethylase）的共同作用下，5 hmC可進(jìn)一步通過堿基切除修復(fù)繼而逆轉(zhuǎn)5 mC修飾，因此5 hmC是DNA去甲基化修飾的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié)[28-29]。可以認(rèn)為，DNA甲基化與DNA羥甲基化之間相互轉(zhuǎn)化的過程，可作為DNA羥甲基化的研究基礎(chǔ)。

3 DNA羥甲基化的研究近況

最近的羥甲基化研究主要集中在癌癥和精神性疾病[12]，5 mC氧化為5 hmC可能是幾種活性DNA去甲基化途徑中的一步，也可能對(duì)癌癥的發(fā)生和發(fā)展起重要作用[30]。研究表明，在器官成熟和藥物誘導(dǎo)反應(yīng)過程中，5 hmC分析可以作為細(xì)胞狀態(tài)的指標(biāo)，并為非基因毒性致癌物暴露提供了新的表觀遺傳特征[31]；而甲基化和羥甲基化標(biāo)記的動(dòng)態(tài)富集模式，可能使我們能夠識(shí)別與前列腺癌發(fā)生有關(guān)的不同表觀遺傳修飾的靶基因[32]。通過綜合分析腫瘤和正常組織中的總DNA甲基化和羥甲基化情況，可篩選出結(jié)直腸癌相關(guān)基因[33]。對(duì)精神分裂癥的研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子近端CpG島在DNA甲基化和DNA羥甲基化修飾之間是處于動(dòng)態(tài)平衡的[34]，而5 mC和5 hmC的改變也與阿爾默海茨病的發(fā)生密切相關(guān)[35]。也有研究顯示TET2的突變可引起血管平滑肌細(xì)胞分化，進(jìn)而向動(dòng)脈內(nèi)膜轉(zhuǎn)移并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而啟動(dòng)AS的進(jìn)程[36]。Peng等[37]發(fā)現(xiàn)TET2介導(dǎo)5 mC 轉(zhuǎn)化5 hmC，TET2的缺失與晚期AS病變有關(guān)。由此可知，5 hmC通過改變DNA甲基化狀態(tài)來阻止抑制基因和凋亡基因失活，5 hmC水平的降低使得基因缺乏保護(hù)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，這同樣對(duì)心腦血管疾病有著提示作用。

4 冠心病血瘀證的遺傳研究進(jìn)展

血瘀證是中醫(yī)理論傳統(tǒng)證候的重要組成部分，是中醫(yī)臨床各科常見的一種證候，也是CHD最常見的證型之一[38-39]。在中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進(jìn)程中，近年來大量研究從表觀遺傳學(xué)水平來探討CHD血瘀證的證候?qū)嵸|(zhì)，主要涉及DNA甲基化修飾、非編碼RNA（ncRNA）調(diào)控、組蛋白修飾和DNA羥甲基化等層面，這為研究中醫(yī)學(xué)證候本質(zhì)提供了新的思路與方法，已成為目前研究的熱點(diǎn)[38，40]。當(dāng)前國內(nèi)對(duì)CHD血瘀證病因和病機(jī)等方面，已經(jīng)進(jìn)行了深入的客觀化研究[41]，主要方面有：血管與血管內(nèi)皮相關(guān)的研究；血液指標(biāo)的客觀化研究；其他方面客觀指標(biāo)研究；CHD血瘀證的基因組學(xué)等分子生物學(xué)方面的研究。特別是隨著基因組學(xué)研究的迅猛發(fā)展，把基因組學(xué)融入中醫(yī)學(xué)在不斷深入。如陳光等[42]發(fā)現(xiàn)：單核苷酸多態(tài)性（SNP）與血瘀證相關(guān)性的研究，應(yīng)結(jié)合血瘀證形成的相關(guān)機(jī)制探討，如找出與血液高凝狀態(tài)、血栓形成、血小板活化和黏附聚集等相關(guān)基因來進(jìn)一步探討調(diào)節(jié)通路的上下游關(guān)系；而血瘀證基因表達(dá)譜可以描繪特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息。宋曙霞等[43]研究發(fā)現(xiàn)，CHD血瘀證患者的嚴(yán)重程度與ACE基因D型及I/D型呈正相關(guān)性，揭示了CHD血瘀證血管病變支數(shù)與ACE基因多態(tài)性存在一定的關(guān)系。郭環(huán)宇等[44]研究表明，老年CHD氣虛血瘀證患者PCI術(shù)后存在血管內(nèi)皮損傷及血小板活化，氣虛血瘀證和CYP2C19*2基因型突變有關(guān)，且這種表現(xiàn)在女性患者中更有意義。這些研究逐步揭示證的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，有助于提高中醫(yī)辨證的準(zhǔn)確性，有助于“治未病”。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[45]，甲基雙加氧酶TET2在參與5 mC和5 hmC之間的轉(zhuǎn)化、DNA的修復(fù)、基因組的穩(wěn)定方面起著重要作用，TET2可能是AS的理想的表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記物以及防治的靶點(diǎn)。隨著檢測技術(shù)的改進(jìn)，5 hmC有望成為新的用于疾病早期診斷的表觀遺傳標(biāo)志[46]。

5 冠心病血瘀證與DNA 羥甲基化的相關(guān)性

目前，國內(nèi)外并無對(duì)CHD血瘀證與DNA羥甲基化修飾之間相關(guān)性的研究。

但本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)DNA甲基化的研究表明：DES、CTNNB1、ZEB2、CHL1、ER-α、GP6、AGTRAP的DNA甲基化修飾可能是CHD血瘀證的易感危險(xiǎn)因素，其中DES、ZEB2、ER-a、GP6、AGTRAP基因的甲基化修飾是CHD血瘀證的發(fā)病機(jī)制之一，可能導(dǎo)致了CHD血瘀證的發(fā)生和發(fā)展[47-49]。結(jié)合當(dāng)前對(duì)DNA甲基化修飾與癌癥、AS等疾病的相關(guān)性研究，以及DNA羥甲基化對(duì)DNA甲基化和去甲基化的轉(zhuǎn)化作用，可推測DNA羥甲基化修飾也與心血管疾病密切相關(guān)；CHD血瘀證的發(fā)生和發(fā)展可能與5 mC和5 hmC之間的轉(zhuǎn)化有緊密聯(lián)系。

由于CHD是多因素疾病，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。目前的研究針對(duì)單一因素的表達(dá)及其調(diào)控研究（如單個(gè)基因的DNA甲基化研究）較多，而對(duì)單個(gè)基因的羥甲基化研究或多基因的甲基化/羥甲基化研究較少，難以從表觀遺傳學(xué)內(nèi)環(huán)境角度來闡釋CHD血瘀證的發(fā)生和發(fā)展。那么，當(dāng)前對(duì)CHD血瘀證與DNA甲基化和羥甲基化之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系是否具有相關(guān)性的研究思路將為我們今后的研究提供一定方向。

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（本文編輯 匡靜之）