益氣活血復(fù)方對慢性心衰大鼠Na⁺—K⁺—ATP酶、Ca²⁺—ATP酶及線粒體蛋白的影響

寧鑫　張艷

〔摘要〕 目的 研究益氣活血復(fù)方對慢性心衰大鼠心肌Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶及線粒體蛋白的影響。方法 SD大鼠隨機(jī)選取10只為正常對照組，其余大鼠以結(jié)扎冠脈前降支聯(lián)合力竭式游泳及饑餓等手段造成慢性心衰模型。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組，曲美他嗪組，益氣活血復(fù)方低、中、高劑量組，每組10只。各組相應(yīng)予以生理鹽水，曲美他嗪和益氣活血復(fù)方低、中、高劑量連續(xù)灌胃7周后，取心肌組織和血清。利用線粒體分離方法測定Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶及線粒體蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與正常對照組比較，模型組心肌Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性和線粒體蛋白濃度顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，曲美他嗪組、益氣活血復(fù)方組Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性及線粒體蛋白濃度顯著上升（P<0.05）。結(jié)論 益氣活血復(fù)方可能通過促進(jìn)心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的增強(qiáng)和提高線粒體蛋白濃度，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的能量代謝過程，來發(fā)揮其治療心力衰竭的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 心力衰竭；益氣活血復(fù)方；Na+-K+-ATP酶；Ca2+-ATP酶；線粒體蛋白

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.007

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of compound Yiqi Huoxue prescription on Na+-K+-ATPase， Ca2+-ATPase， and mitochondrial protein in the myocardium of rats with chronic heart failure. Methods Ten Sprague-Dawley rats were randomly selected as normal control group. A rat model of chronic heart failure was established by ligation of the anterior descending branch of the coronary artery combined with exhaustive swimming and hunger. After modeling， the rats were divided into model group， trimetazidine group， and low-， middle-， and high-dose compound Yiqi Huoxue prescription groups， with 10 rats in each group. These groups were treated by normal saline， trimetazidine， and low-， middle-， and high-dose compound Yiqi Huoxue prescription， respectively， by gavage for 7 consecutive weeks， and then the myocardial tissue and serum were harvested. The mitochondrial separation method was used to measure the expression of Na+-K+-ATPase， Ca2+-ATPase， and mitochondrial protein. Results Compared with the normal control group， the model group had significant reductions in the concentrations of Ca2+-ATPase， Na+-K+-ATPase， and mitochondrial protein in the myocardium （P<0.05）； compared with the model group， the trimetazidine group and low-， middle-， and high-dose compound Yiqi Huoxue prescription groups had significant increases in the concentrations of Ca2+-ATPase， Na+-K+-ATPase， and mitochondrial protein in the myocardium （P<0.05）. Conclusion Compound Yiqi Huoxue prescription plays an important role in the treatment of heart failure by promoting the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase， increasing the concentration of mitochondrial protein， and participating in the regulation of energy metabolism of cardiomyocytes.

〔Keywords〕 heart failure； compound Yiqi Huoxue prescription； Na+-K+-ATPase； Ca2+-ATPase； mitochondrial protein

慢性心衰的治療已經(jīng)取得重大突破，但其患病率和住院率仍呈上升趨勢。近年來發(fā)現(xiàn)，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、線粒體蛋白與慢性心衰關(guān)系密切，引起高度關(guān)注。當(dāng)Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、線粒體蛋白三者活性或合成量下調(diào)時(shí)，心肌能量代謝則發(fā)生障礙，心臟功能大幅下降，導(dǎo)致心室重構(gòu)甚至心衰的發(fā)生[1]。益氣活血復(fù)方是張艷教授20多年來治療慢性心衰的常用方，臨床療效顯著[2]。本實(shí)驗(yàn)從心肌能量代謝的角度出發(fā)，觀察益氣活血復(fù)方對Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、線粒體蛋白的調(diào)控機(jī)制，為益氣活血復(fù)方在治療心衰方面提供科學(xué)依據(jù)與策略。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選擇SPF級健康的SD雄性大鼠，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0001，體質(zhì)量（240±20）g。

1.2 藥品

益氣活血復(fù)方（YQHXFF）由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑科生產(chǎn)。處方組成：黃芪40 g，太子參10 g，丹參30 g，益母草20 g，紅花15 g，葶藶子10 g，茯苓25 g。水煎3次，時(shí)間分別為45、60、90 min，合并煎煮液后過濾濃縮至低（含生藥量0.4 g/mL）、中（含生藥量0.8 g/mL）、高（含生藥量1.6 g/mL）3種藥物濃度。鹽酸曲美他嗪片（根克通），由瑞陽制藥有限公司生產(chǎn)，20 mg/片，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20066534。

1.3 試劑與儀器

超微量ATP酶Na+-K+測試盒，產(chǎn)品批號：20170305，南京建成；超微量ATP酶Ca2+測試盒，產(chǎn)品批號：20170111，南京建成；組織線粒體分離試劑盒，產(chǎn)品型號：ZR0246，上海朝瑞技術(shù)有限公司；蛋白濃度測定試劑盒，產(chǎn)品編號：P0011，碧云天生物Beyotime； ACUSON X150彩色超聲多普勒診斷儀，西門子公司；RM6240E/EC多道生理信號采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠；DW-3000S 型雙通道小動物呼吸機(jī)，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 動物模型的制備

大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg），麻醉后進(jìn)行背位固定，通過氣管插管連接小動物呼吸機(jī)，設(shè)定呼吸頻率為80次/min，潮氣量為0.8 mL。連接多道生理信號采集處理系統(tǒng)，監(jiān)測II導(dǎo)聯(lián)，記錄正常心電圖。胸部備皮、消毒，然后沿胸腔左側(cè)3、4肋間隙做橫向切口，切口長度為1.5～2.5 cm。用鑷子逐層分離肌肉組織，經(jīng)3、4肋間隙進(jìn)入胸腔，迅速的用眼科鑷子夾住心包膜，借助小剪子剪開心包膜，充分暴露心臟。眼科鑷子提起左心耳，在左心耳和肺動脈圓錐中間找到左冠狀動脈前降支主干，使用6號可吸收縫線在距離左冠狀動脈前降支起點(diǎn)處2～3 mm的位置進(jìn)行快速穿線、結(jié)扎，結(jié)扎處心肌顏色變蒼白。心電圖示波器顯示標(biāo)II導(dǎo)聯(lián)S-T段明顯抬高（在2 mm以上），T波異常?？焖訇P(guān)閉胸腔，并用3號縫線逐層縫合胸壁肌肉。縫合完畢后，在創(chuàng)口縫合處，敷用青霉素鈉，肌內(nèi)注射青霉素鈉，每天2×106 U/kg，連續(xù)3 d，以防創(chuàng)口感染。先進(jìn)行5 d常規(guī)喂養(yǎng)，于第2周將正常飼料量減到一半，引起大鼠饑餓。然后配合力竭式游泳（游泳時(shí)間按照大鼠的身體狀態(tài)而定），1次/d，共4周。此時(shí)，大鼠可表現(xiàn)出活動減少，精神疲憊，毛色欠光澤，掉毛，甚至能夠聞及哮鳴音等表現(xiàn)。慢性心力衰竭造模成功以第4周彩色超聲多普勒診斷儀測定的左心室射血分?jǐn)?shù)（EF）≤60%、心臟指數(shù)（CI）≤180 mL（min·kg）為依據(jù)[3]。

2.2 分組和干預(yù)

選擇90只SD雄性大鼠，隨機(jī)選取10只為正常對照組，其余大鼠造模成功后，再隨機(jī)分為模型組，曲美他嗪組，益氣活血復(fù)方高、中、低劑量組，每組10只。各組動物飼養(yǎng)條件一致。等容量的生理鹽水對正常對照組和模型組進(jìn)行灌胃，1次/d。益氣活血復(fù)方各組分別給予益氣活血復(fù)方10.8 g/（kg·d）、5.4 g/（kg·d）、2.7 g/（kg·d）。曲美他嗪組予以曲美他嗪5.4 mg/（kg·d）（結(jié)果按動物與人藥物等效劑量的方法計(jì)算）。在成功造成慢性心衰模型后對各組大鼠進(jìn)行7周的灌胃相應(yīng)干預(yù)。

2.3 心衰大鼠線粒體蛋白、Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶測定

相應(yīng)干預(yù)7周后，禁食但不禁水12 h，先麻醉后處死。取材部位為大鼠左心室，對線粒體分離采用線粒體分離試劑盒，檢測線粒體蛋白應(yīng)用蛋白濃度試劑盒，操作過程嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，按每小時(shí)每毫克心肌組織內(nèi)ATP酶催化ATP時(shí)所釋放的1 μmoL無機(jī)磷作為單個(gè)ATP酶的計(jì)量單位。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用“x±s”表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析（one-way AONVA），組間兩兩比較時(shí)，方差齊則采用LSD法，方差不齊則采用Dunnett's法，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 心肌Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性比較

與正常對照組比較，模型組心肌Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性顯著降低（P<0.05），表明造模成功；與模型組比較，曲美他嗪組和益氣活血復(fù)方高、中、低劑量組心肌Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性顯著上升（P<0.05）；曲美他嗪組與益氣活血復(fù)方高、中、低劑量組心肌Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3.2 心肌線粒體蛋白濃度比較

與正常對照組比較，模型組心肌線粒體蛋白濃度降低（P<0.05）；與模型組比較，曲美他嗪組、益氣活血復(fù)方3個(gè)劑量組心肌線粒體蛋白濃度升高（P<0.05）；曲美他嗪組與益氣活血復(fù)方3個(gè)劑量組心肌線粒體蛋白濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

4 討論

在慢性心力衰竭發(fā)病過程中，能量代謝方面的改變是其發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。曲美他嗪作為調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝的主要藥物，在臨床上已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，它對線粒體中的3酮酰輔酶A硫解酶（3-KAT）發(fā)揮選擇性的抑制作用，引起游離脂肪酸β氧化減低，加速了葡萄糖氧化過程，使ATP生成增加，從而調(diào)節(jié)了心肌的能量代謝[4]。

慢性心力衰竭歸屬于中醫(yī)學(xué)“心水”“喘癥”“心悸”“水腫”“心痹”等范疇[5]。歷代醫(yī)家對慢性心衰的認(rèn)識觀點(diǎn)各異，但普通認(rèn)為慢性心力衰竭為本虛標(biāo)實(shí)之證。其發(fā)生與心氣虧虛、血脈瘀阻、痰濁水停密切相關(guān)[6]。針對心衰的以上病因病機(jī)，益氣活血復(fù)方中丹參、紅花活血化瘀，黃芪、太子參補(bǔ)氣，益母草活血、利水，葶藶子、茯苓消腫利水。諸藥合用，以益氣活血、利水消腫之功，達(dá)標(biāo)本同治之效[7]。唐斌等[8]證實(shí)，黃芪甲苷通過改變心肌細(xì)胞能量代謝異常，阻止了慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的發(fā)展；丹參素可提高心肌能量代謝率，下調(diào)心肌脂肪酸氧化，保護(hù)缺血再灌注區(qū)的心肌組織[9-11]；紅花黃色素能夠增加心肌三磷酸腺苷（ATP）儲備，降低乳酸脫氫酶（LDH）活性，減輕缺血心肌的損傷[12]；太子參、益母草同樣具有保護(hù)缺血心肌的功能[13]。由此可見，方中各味藥物功效的總和是益氣活血復(fù)方參與心肌能量代謝調(diào)控的科學(xué)依據(jù)。

心臟作為高耗能器官，需要消耗大量的能量來維持本身的收縮和舒張功能[14]。研究證明，在慢性心衰發(fā)病過程中，心肌能量代謝的改變起主導(dǎo)作用，當(dāng)心臟發(fā)生功能障礙時(shí)，心肌能量產(chǎn)生障礙，甚至衰竭[15]。ATP是心肌組織可直接利用的能量物質(zhì)，它在心肌中表達(dá)的量與心臟功能呈正相關(guān)。Ca2+-ATP酶即鈣泵，其中心肌肌漿網(wǎng)鈣泵（SERCA），參與約2/3的Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，心肌細(xì)胞發(fā)生興奮時(shí)，SERCA通過分解ATP時(shí)所產(chǎn)生的能量，逆濃度梯度對鈣離子進(jìn)行主動跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。SERCA功能的發(fā)揮需要大量的ATP，對ATP的消耗量僅亞于肌球蛋白。因此，當(dāng)ATP生成的數(shù)量減少時(shí)，SERCA功能下調(diào)，心肌肌漿網(wǎng)重新攝取鈣離子的能力減低，引起心肌收縮功能降低[16]。研究還證實(shí)，在人的衰竭心臟中，肌漿網(wǎng)鈣泵的功能下調(diào)，心肌舒張弛緩[17-18]。鈉泵即 Na+-K+-ATP酶，是一種廣泛存在于各器官、組織細(xì)胞膜表面的酶蛋白，通過水解ATP時(shí)所釋放的能量，將2個(gè)鉀離子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的同時(shí)又將3個(gè)鈉離子轉(zhuǎn)出到細(xì)胞外，以維持細(xì)胞內(nèi)外電及化學(xué)梯度平衡。有研究證實(shí)，在發(fā)生心力衰竭的大鼠模型中，Na+-K+-ATP酶活性減低[19]。作為心肌細(xì)胞能量產(chǎn)生的中心，線粒體在調(diào)節(jié)能量代謝方面起到關(guān)鍵作用，發(fā)生心衰的心肌細(xì)胞中，線粒體（mt）DNA突變率增長，發(fā)生突變的mtDNA的連續(xù)集聚，干擾了線粒體蛋白的合成和呼吸鏈相關(guān)復(fù)合體的活性，進(jìn)而引起了線粒體的功能紊亂及慢性心衰的發(fā)生、發(fā)展[20]。Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶及線粒體蛋白與心肌細(xì)胞能量代謝的過程密切相關(guān)，通過對Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性及線粒體蛋白濃度的檢測，觀察心肌細(xì)胞的能量代謝的機(jī)制和運(yùn)行是否正常，所以加深對Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶及線粒體蛋白的系統(tǒng)研究意義重大。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性及線粒體蛋白濃度降低，表明心衰時(shí)，存在線粒體蛋白合成減少，心肌能量供應(yīng)不足，引起Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性減弱。曲美他嗪組、益氣活血復(fù)方組Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性及線粒體蛋白濃度增高明顯，表明曲美他嗪、益氣活血復(fù)方可增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性并提高線粒體蛋白濃度，從而改善心肌的能量代謝。

綜上所述，益氣活血復(fù)方能夠改善慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性及線粒體蛋白濃度，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的能量代謝過程，促進(jìn)了心臟功能的恢復(fù)，其具體作用機(jī)制仍需深入研究。

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（本文編輯 楊 瑛）