基于低共熔溶劑提取千斤拔多糖

熊蘇慧 夏伯候 雷思敏 李詩卉 謝明霞 李亞梅 林艷

〔摘要〕 目的 采用一種新型綠色溶劑低共熔溶劑（deep eutectic solvents， DESs）提取千斤拔多糖，并對(duì)其提取工藝及提取效率進(jìn)行考察。方法 采用響應(yīng)面法，優(yōu)化千斤拔多糖提取工藝，并以水提醇沉法評(píng)價(jià)DESs提取效率。結(jié)果 由氯化膽堿和1，3-丁二醇合成的低共熔溶劑最適合于千斤拔多糖的提取。經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后，在提取溫度70 ℃、水比例11%、提取時(shí)間41 min、液固比11 mL/g下，千斤拔多糖提取率可達(dá)2.47%，顯著高于水提醇沉后所得多糖（P<0.05）。結(jié)論 低共熔溶劑作為提取介質(zhì)具有高效和綠色的優(yōu)點(diǎn)，可用于千斤拔多糖的提取，同時(shí)本結(jié)果為DESs提取中藥活性成分提供新思路。

〔關(guān)鍵詞〕 低共熔溶劑；響應(yīng)面法；千斤拔；多糖

〔中圖分類號(hào)〕R284.2 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.008

〔Abstract〕 Objective To investigate the extraction of polysaccharides from Moghania macrophylla using new green deep eutectic solvents （DESs） and related extraction process and extraction efficiency. Methods The response surface method was used to optimize the extraction process for polysaccharides from Moghania macrophylla， and the water extraction and alcohol precipitation method was used to evaluate the extraction efficiency of DES. Results The DESs composed of choline chloride and 1，3-butanediol was most suitable for the extraction of polysaccharides from Moghania macrophylla. After optimization with the response surface method， an extraction temperature of 70 °C， a water ratio of 11%， an extraction time of 41 minutes， and a liquid-solid ratio of 11 ml/g achieved a yield of polysaccharides from Moghania macrophylla of 2.47%， which was significantly higher than the yield obtained by water extraction and alcohol precipitation （P<0.05）. Conclusion DESs has the advantages of high efficiency and being environment-friendly as an extraction medium and can be used for the extraction of polysaccharides from Moghania macrophylla. Meanwhile， the results of this study provides new ideas for the use of DESs in the extraction of active components of traditional Chinese medicine.

〔Keywords〕 deep eutectic solvent； response surface method； Moghania macrophylla； polysaccharide

中藥千斤拔Moghania macrophylla （WiWd.） O. Kuntze.含有多糖、黃酮、生物堿、β-谷甾醇等多種活性成分，具有祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋壯骨、活血解毒的功效[1]。其中千斤拔多糖類成分具有提高免疫力的作用[2]，可廣泛用于食藥品行業(yè)，因此，如何千斤拔中高效提取多糖具有重要意義。

近年來，“綠色化學(xué)”的提出促使離子液體（ionic liquids， ILs）、低共熔溶劑（deep eutectic solvents， DESs）等綠色溶劑的發(fā)展。隨著研究的進(jìn)行，ILs表現(xiàn)出高成本、潛在毒性和較差的可生化性等不足[3-4]，而DESs因其低成本、易合成、生物可降解性、高增溶作用、低毒性甚至非毒性等優(yōu)勢已成為科學(xué)研究的新寵。DESs由氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）組成，其熔點(diǎn)低于各個(gè)組成部分[5]，現(xiàn)已廣泛用于黃酮[6]、酚酸[7]、生物堿[8]等中藥活性成分的提取，但在多糖[9]提取方面卻相對(duì)較少。

因此，本研究選擇合適DESs提取千斤拔多糖，并利用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)千斤拔多糖的提取條件（溫度、時(shí)間、水比例、液固比）進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，篩選最佳提取條件，為今后DESs的研究及千斤拔多糖的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

千斤拔由千金藥業(yè)提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院龔力民副教授鑒定為豆科植物大葉千斤拔Moghania macrophylla （WiWd.） O. Kuntze.的干燥根。

超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（CP114，奧豪斯儀器（上海）有限公司）；酶標(biāo)儀（SN-268393，美國伯騰儀器有限公司）等；用于合成DESs相關(guān)試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 前處理

千斤拔樣品在40 ℃下干燥2 h至恒重，粉碎并過篩（80目），備用。HBD和HBA（氯化膽堿）在80 ℃下加熱攪拌，直至形成均勻的液體[7]。DESs組成如表1所示。

2.2 千斤拔多糖的提取

精密稱量千斤拔藥材粉末1.00 g置于離心管中，加入DESs 22 mL（含蒸餾水為11%），混合均勻，充分浸泡后，于70 ℃下恒溫超聲41 min，隨后溶液冷卻至室溫并補(bǔ)足重量，溶液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心30 min（3 000 r/min），取上清液4 mL置于離心管中，加入無水乙醇16 mL，靜置12 h后離心30 min （3 000 r/min），揮干乙醇溶液，加入蒸餾水4 mL，搖勻，離心（3 000 r/min）30 min，取出上清液，棄沉淀，即得千斤拔多糖粗提液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖15.0 mg，置25 mL的容量瓶中，加入蒸餾水溶解并定容至刻度，配制成濃度為0.6 mg/mL的葡糖糖對(duì)照品溶液。然后分別吸取此對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，即得。

2.4 最大吸收波長的確定

取上述“2.3”項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用苯酚-硫酸法顯色，在波長400～800 nm下進(jìn)行光譜掃描，測得最大吸收波長在490 nm處。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取“2.3”的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL，加入濃度為4%的苯酚溶液5 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸2.5 mL，在90 ℃水浴下加熱5 min，冷卻至室溫，在490 nm波長處測定吸光度。以1 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，縱坐標(biāo)為吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

A=0.010 7C+0.148 6，r=0.999 8（n=6）。

2.6 多糖含量的計(jì)算

精密稱取千斤拔多糖粗提液200 μL，加蒸餾水至1 mL，按“2.5”方法測定多糖吸光度值。將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對(duì)應(yīng)的多糖質(zhì)量濃度（μg/mL），再利用如下公式得到千斤拔多糖的提取率。

Y（%）=CVD/（M/1000 000）×100%

式中：Y（%）為千斤拔多糖的提取率；C為與標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的多糖質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為總提取液的體積（mL）；D為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量（g）。

2.7 不同DESs及提取方法考察

考察5種不同DESs（摩爾比1∶2），尋找最佳DESs后，考察6個(gè)不同摩爾比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7），選擇多糖提取率最大者作為最佳DESs。同時(shí)對(duì)4種不同提取方法（常溫?cái)嚢?、常溫超聲（P=79 W）、加熱攪拌（T=50 ℃）和加熱超聲（T=50 ℃、P=79 W）進(jìn)行考察。

2.8 單因素考察

在最佳DESs和提取方法下，考察不同提取溫度（20、30、40、50、60、70、80 ℃）、水與溶劑比（以下簡稱水比例）（0%、20%、40%、60%、80%）、提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、液固比（5.5、8.0、11.5、15.0、18.5 mL/g）對(duì)多糖提取率的影響，選擇最佳條件進(jìn)行Box-Behnken（BBD）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.9 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用三水平四因素BBD設(shè)計(jì)尋找千斤拔多糖提取條件最優(yōu)組合。選取提取溫度（X1），水比例（X2）、提取時(shí)間（X3）和液固比（X4）因素中影響最大的三水平，分別以-1、0、1編碼，因素與水平設(shè)計(jì)見表2。建立BBD模型方程式：

其中y為千斤拔多糖提取率；Xi、Xj為不同的因素；bo、bi、bii、bij分別為回歸方程的截距、單因素系數(shù)、二次項(xiàng)系數(shù)和因素交叉系數(shù)。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量數(shù)據(jù)用“x±s”表示，響應(yīng)曲面模型的回歸方程式和顯著性統(tǒng)計(jì)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行計(jì)算和分析，其中P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。模型的準(zhǔn)確性及顯著性由F值、回歸系數(shù)R2和失擬項(xiàng)決定，R2越接近1，模型越可靠。

3 結(jié)果和討論

3.1 不同DESs及提取方法對(duì)多糖提取率的影響

3.1.1 不同種類DESs對(duì)多糖提取率影響 擴(kuò)散度、溶解度、黏度、表面張力、極性和醇基位置等條件是DESs提取活性成分的重要因素[10]。探討5種DESs在加熱（T=50 ℃、t=30 min）條件下對(duì)千斤拔多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1（a）所示。多糖提取率大小排列順序?yàn)椋篋ESs-4>DESs-2>DESs-5>DESs-1>DESs-3，其中DESs-4多糖提取率高達(dá)1.53%，主要原因?yàn)椋喝軇ば院捅砻鎻埩π。?，3-丁二醇內(nèi)部空間足夠大且醇基分支少，且極性更適合多糖提取。

3.1.2 HBA與HBD不同摩爾比對(duì)多糖提取率影響 HBA與HBD之間摩爾比值降低，DESs的黏度和表面張力也隨著減低，可以增加多糖提取率。但比值過度的降低則會(huì)導(dǎo)致氯化膽堿濃度降低，從而影響多糖提取率。因此，選用合適的比值對(duì)多糖的提取效率具有很大的影響?？疾霥ESs-4不同摩爾比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1（b）所示。摩爾比從1∶2到1∶6的增加過程中，多糖提取率先增后減，在1∶5時(shí)，達(dá)最大值1.75%。

3.1.3 不同提取方法對(duì)多糖提取率影響 本實(shí)驗(yàn)研究常溫?cái)嚢琛⒊爻暎≒=79 W）、加熱攪拌（T=50 ℃）和加熱超聲（T=50 ℃、P=79 W）4種不同提取方法對(duì)千斤拔多糖提取率的影響。結(jié)果如圖1（c）所示，加熱超聲提?。?.76%）均比攪拌提?。?.51%）、加熱攪拌提?。?.36%）和常溫超聲提?。?.22%）的多糖提取率高。說明超聲和溫度均能影響DESs對(duì)多糖的提取效率。

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 不同提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 適當(dāng)?shù)脑黾訙囟饶芙档虳ESs的粘度、增加擴(kuò)散系數(shù)，破壞分子間的相互作用，從而提高活性物質(zhì)的溶解[11]。固定其余條件，考察DESs在不同溫度梯度下（20、30、40、50、60、70、80 ℃）對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2（a）所示。多糖提取率隨著溫度的升高，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值1.80%，之后溫度的升高對(duì)提取率變化不大且有降低趨勢。因此，確定60 ℃為最佳提取溫度。3.2.2 不同水比例對(duì)多糖提取率的影響 水比例是影響DESs提取效率的另一重要參數(shù)，具有調(diào)節(jié)DESs黏度和極性作用[12]。固定其余條件，考察DESs在不同水比例梯度（0%、20%、40%、60%、80%）對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2（b）所示。隨著水比例增加，多糖提取率先增后降，在20%處可達(dá)最大值2.01%。因此，確定20%為最佳水比例。

3.2.3 不同提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率有著重要的影響，研究表明[13]，在一定時(shí)間段內(nèi)，活性成分溶出率隨著時(shí)間的增加而增加，然而達(dá)到一定時(shí)間后，溶液體系滲透壓達(dá)到平衡時(shí)溶出率變化不大。固定其余條件，考察DESs在不同時(shí)間梯度（20、30、40、50、60 min）對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2（c）所示。多糖提取率隨著提取時(shí)間的增加在40 min達(dá)最大值2.19%，后期的超聲過程中，雜質(zhì)的析出對(duì)多糖提取率產(chǎn)生了影響。因此，確定40 min為最佳提取時(shí)間。

3.2.4 不同液固比對(duì)多糖提取率的影響 DESs的含量決定了藥材是否能充分浸潤、目標(biāo)化合物能否有效溶出，因此考察液固比對(duì)多糖提取率具有重要作用。固定其余條件，考察DESs在不同液固比梯度（5.5、8.0、11.5、15.0、18.5 mL/g）對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2（d）所示。隨著液固比的增加，多糖提取率不斷增加最大可達(dá)2.31%，再次增加液固比對(duì)提取率影響不大。因此，確定11.5 mL/g為最佳液固比。

3.3 響應(yīng)面（RSM）優(yōu)化提取條件結(jié)果分析

3.3.1 統(tǒng)計(jì)分析和模型擬合 本實(shí)驗(yàn)采用的BBD設(shè)計(jì)涉及到3個(gè)水平、4個(gè)因素，具有5個(gè)重復(fù)用于評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)變異性和穩(wěn)定性。BBD表格設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，回歸方程為：

Y=-5.726 93+0.111 1 X1+0.145 29 X2+0.060 793 X3+0.442 64 X4-1.312 5×10-3 X1X2-7.5×10-5 X1X3-2.071 43×10-3 X1X4-1.625 2×10-4 X2X3-1.821 43×10-3 X2X4+1.857 14×10-3 X3X4-8.966 67×10-4 X12-1.180 42×10-3 X22-1.034 17×10-4 X32-0.029 463×10-4 X42

由表4可知，模型因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.995 6），且P值小于0.01，方程的失擬項(xiàng)P值為0.959 9，R2Pred與R2Adj差異值小于0.2，精密度大于4，以上結(jié)果證明該模型可靠。一次項(xiàng)X1、X2和X4，交互項(xiàng)中的X1X2、X2X4以及二次項(xiàng)中的X12、X22、X32、X42對(duì)千斤拔多糖提取率的影響極為顯著（P<0.01）；X1X4、X3X4對(duì)千斤拔多糖提取率的影響顯著（P<0.05）。

3.3.2 RSM分析 響應(yīng)面三維圖和等高線圖被不僅可以解釋自變量之間的相互作用，而且可以反映變量間相互作用。通過觀察曲面的傾斜度確定兩者對(duì)響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡，說明兩者交互作用越顯著。提取溫度（X1）、水比例（X2）、提取時(shí)間（X3）和液固比（X4）對(duì)千斤拔多糖提取率的影響如圖3所示，四因素之間的交互曲面均具有較大的傾斜度，說明兩兩因素之間對(duì)千斤拔多糖提取率的影響較大。曲面圖結(jié)果與表4方差分析結(jié)果相符合（P<0.01）。因此，X1=70.00 ℃、X2=11.38%、X3=40.82 min、X4=10.91 mL/g時(shí)，千斤拔多糖提取率達(dá)到最大預(yù)測值2.51%。為了實(shí)驗(yàn)便利性，對(duì)4個(gè)因素實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行適當(dāng)修飾如下：X1=70 ℃、X2=11%、X3=41 min、X4=11 mL/g。利用改進(jìn)后的最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多糖提取率為（2.47±0.03）%，與預(yù)測值無明顯差異性（P>0.05）。

3.4 傳統(tǒng)方法提取千斤拔多糖

目前文獻(xiàn)報(bào)道的千斤拔多糖提取方法主要為水提醇沉法。為評(píng)判DESs提取千斤拔多糖效率，本研究將兩者進(jìn)行對(duì)比。采用文獻(xiàn)報(bào)道的最佳工藝[14]，在提取溫度70 ℃、超聲時(shí)間30 min、液固比40 mL/g、提取時(shí)間2 h下，千斤拔多糖提取率為（1.32±0.09）%，顯著低于DESs最優(yōu)條件下多糖提取率（2.47%，P<0.05）。

4 結(jié)論

本研究采用了一種新型綠色溶劑—低共熔溶劑（DESs）提取千斤拔多糖。在初步篩選單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用BBD設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化條件，發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)條件下，實(shí)際千斤拔多糖提取率在預(yù)測范圍之內(nèi)。 此外采用DESs提取千斤拔多糖優(yōu)于水提醇沉法。因此，DESs作為溶劑用于千斤拔多糖的提取，科學(xué)可行、高效環(huán)保。本研究的完成可為DESs提取植物多糖提供理論基礎(chǔ)以及有利于千斤拔的進(jìn)一步開發(fā)研究。

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（本文編輯 蘇 維）