無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC—7721增殖和凋亡的影響

劉玉強(qiáng) 管美玉 孫建之 才謙

中圖分類(lèi)號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）09-1252-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.24

摘 要 目的：研究無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響，為明確其抗腫瘤作用機(jī)制提供參考。方法：采用MTT法考察低、中、高質(zhì)量濃度的無(wú)梗五加果實(shí)乙醇提取物（0.92、1.84、3.68 mg/mL）、粗多糖提取物（0.06、0.12、0.24 mg/mL）和精多糖提取物（0.04、0.08、0.16 mg/mL）分別作用24、36、48 h后對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖抑制作用；采用流式細(xì)胞術(shù)考察1.84 mg/mL乙醇提取物、0.24 mg/mL粗多糖提取物和0.16 mg/mL精多糖提取物分別作用24 h后對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。以上試驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照（只加細(xì)胞不加藥物）。結(jié)果：與陰性對(duì)照比較，無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物均可顯著抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖（P<0.01），顯著降低G0/G1、G2/M期細(xì)胞的百分率（P<0.01），顯著升高S期細(xì)胞的百分率（P<0.01），顯著升高細(xì)胞凋亡率（P<0.05），其中以無(wú)梗五加果實(shí)乙醇提取物的作用最為明顯。結(jié)論：無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物均能抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖，阻滯其細(xì)胞周期于S期，誘導(dǎo)其凋亡。

關(guān)鍵詞 無(wú)梗五加果實(shí)；乙醇提取物；粗多糖提取物；精多糖提取物；人肝癌細(xì)胞SMMC-7721；增殖；凋亡

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of 3 extracts of Acanthopanax sessiliflorus fruits on the proliferation and apoptosis of human hepatocarcinoma cells SMMC-7721， and to provide reference for confirming the mechanism of anti-tumor effect. METHODS： MTT assay was adopted to investigate the effects of low-mass concentration， medium-mass concentration and high-mass concentration of ethanol extract （0.92， 1.84， 3.68 mg/mL）， crude polysaccharide extract （0.06， 0.12， 0.24 mg/mL） and refined polysaccharide extract （0.04， 0.08， 0.16 mg/mL） from A. sessiliflorus fruits on the proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells after treated for 24， 36， 48 h， respectively. Flow cytometry was used to investigate the effects of 1.84 mg/mL ethanol extract， 0.24 mg/mL crude polysaccharide extract and 0.16 mg/mL refined polysaccharide extract on cell cycle and cell apoptosis after treated for 24 h. The above tests were all negative control （only adding cells without drugs）. RESULTS： Compared with negative control， 3 extracts of A. sessiliflorus fruits could significantly inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells （P<0.01）， could significantly decrease the percentage of SMMC-7721 cells in G0/G1 and G2/M phase （P<0.01）， could significantly increase the percentage of SMMC-7721 cells in S phase （P<0.01） and the apoptosis rate of SMMC-7721 cells （P<0.05）； especially the effects of ethanol extract from A. sessiliflorus fruits were the most obvious. CONCLUSIONS： Three extracts of A. sessiliflorus fruits can inhibit the proliferation of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells， block SMMC-7721 cells in S phase and induce the apoptosis of SMMC-7721 cells.

KEYWORDS Acanthopanax sessiliflorus fruits； Ethanol extract； Crude polysaccharide extract； Refined polysaccharide extract； Human hepatocarcinoma cells SMMC-7721； Proliferation； Apoptosis

無(wú)梗五加[Acanthopanax sessiliflorus（Rupr.et Maxim.）Seem]為五加科五加屬一種重要的藥用植物，主產(chǎn)于東北、河北、朝鮮等地[1]，其果實(shí)具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，主治肝腎虧虛、小兒行遲和筋骨痿軟等癥[2-3]，臨床上主要用無(wú)梗五加制劑治療白細(xì)胞減少癥和脾腎陽(yáng)虛型眩暈癥[4]。另有報(bào)道稱(chēng)，無(wú)梗五加果實(shí)中多糖成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤的藥理作用[5]。在本研究中，筆者擬采用MTT法考察無(wú)梗五加果實(shí)乙醇提取物、粗多糖提取物和精多糖提取物在不同給藥時(shí)間、不同濃度下對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖抑制作用，確定最佳作用時(shí)間和最佳給藥濃度。并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞周期和凋亡的影響，從而明確其體外抑瘤作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

SUNRISE 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；FACE Vantage SE 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；AE31倒置相差顯微鏡（德國(guó)Motic公司）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；FA1004電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

無(wú)梗五加果實(shí)購(gòu)自遼寧省丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為Acanthopanax sessiliflorus（Rupr.et Maxim.）Seem的干燥果實(shí)；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：KGA108）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；其他試劑均為分析純，細(xì)胞試驗(yàn)用水為三級(jí)純化水。

1.3 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

2 方法

2.1 無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC- 7721細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物的制備 （1）乙醇提取物的制備。取無(wú)梗五加果實(shí)粗粉1 kg，石油醚回流提取3次，每次2 h，藥渣晾干，加80%乙醇回流提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并提取液，濃縮，干燥得無(wú)梗五加果實(shí)乙醇提取物178.2 g，得率為17.82%。（2）粗多糖的制備。取無(wú)梗五加果實(shí)粗粉1 kg，用8倍量水提取3次，每次2 h，濾過(guò)，濾液減壓濃縮后，加入95%乙醇使含醇量達(dá)到50%，靜置24 h，將沉淀冷凍干燥，得粗多糖提取物12.1 g，得率為1.21%。（3）精多糖的制備。取無(wú)梗五加果實(shí)粗粉1 kg，按照上述粗多糖的制備方法制備得到粗多糖，再將粗多糖提取物用水溶解制成一定濃度的溶液，采用Sevage法進(jìn)行脫蛋白（Sevage試劑中氯仿和正丁醇的比例為3 ∶ 1，粗多糖溶液和Sevage試劑的比例為4 ∶ 1，混合振搖，以達(dá)到除去蛋白的目的）[6]，將除去蛋白的多糖溶液進(jìn)行減壓濃縮，冷凍干燥，得精多糖提取物8.0 g，得率為0.8%。

2.1.2 給藥溶液的制備 根據(jù)各提取物收率的不同，按生藥量均為5、10、20 mg/mL將3種提取物分別制備成不同質(zhì)量濃度的藥液：其中乙醇提取物給藥濃度分別為0.92、1.84、3.68 mg/mL，粗多糖的給藥濃度分別為0.06、0.12、0.24 mg/mL，精多糖的給藥濃度分別為0.04、0.08、0.16 mg/mL，微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 按照常規(guī)貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)方法將人肝癌細(xì)胞SMMC-7721接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在溫度為37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液并傳代1次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于研究。

2.1.4 MTT法檢測(cè) 選取培養(yǎng)了2～3 d、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1～2次，再用0.25% 的胰酶進(jìn)行消化傳代，等到細(xì)胞狀態(tài)趨于變圓的時(shí)候，使用培養(yǎng)液清洗，然后吹打細(xì)胞將其制成細(xì)胞懸液。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至5×104 個(gè)/mL的密度，然后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，將其置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁完全后，進(jìn)行試驗(yàn)分組。試驗(yàn)分為3種提取物的不同質(zhì)量濃度的給藥組（濃度設(shè)置見(jiàn)“2.1.2”項(xiàng)下）、陰性對(duì)照組（加細(xì)胞，但不加藥液）和空白調(diào)零組（只加培養(yǎng)液，供酶標(biāo)儀調(diào)零用） ，每組設(shè)立5個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、36、48 h后，分別在避光條件下每孔加入20 μL（5 mg/mL）MTT溶液，再次將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)4 h，吸凈孔內(nèi)上清液，然后每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），等到紫色的結(jié)晶充分溶解后，使用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描[1]，測(cè)定光密度（OD）值，計(jì)算無(wú)梗五加果實(shí)各提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖抑制率[6-8]：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-給藥組平均OD值/陰性對(duì)照組平均OD值）×100%。

2.2 無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC- 7721細(xì)胞周期和凋亡的影響

2.2.1 無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物給藥溶液的制備 根據(jù)前期MTT試驗(yàn)確定的各提取物抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞增殖的最佳濃度，將無(wú)梗五加乙醇提取物、粗多糖、精多糖分別加水溶解制備成質(zhì)量濃度分別為1.84、0.24、0.16 mg/mL的溶液，微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.2.2 無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC- 7721細(xì)胞周期的影響 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，用0.25%的胰酶消化，用滴管吹打至單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于6 孔板中，每孔1 mL。將試驗(yàn)分為無(wú)梗五加果實(shí)乙醇提取物組（1.84 mg/mL）、粗多糖組（0.24 mg/mL）、精多糖組（0.16 mg/mL）和陰性對(duì)照組，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，給藥組每孔分別給予無(wú)梗五加果實(shí)各提取物1 mL，陰性對(duì)照組每孔加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以802×g 離心5 min，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，然后以離心半徑為5 cm、3 000 r/min 離心5 min，去上清，加入400 μL 的碘化丙啶（PI），混勻，4 ℃避光反應(yīng)30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)488 nm波長(zhǎng)處的紅色熒光，ModFit細(xì)胞周期擬和軟件進(jìn)行分析。

2.2.3 無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行消化、接種、給藥、培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞及相應(yīng)的細(xì)胞上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，802×g離心5 min，去上清，加入熒光素FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ（FITC-Annexin Ⅴ）5 μL，混勻，再加入PI染液5 μL，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用Cell Quest 軟件分析細(xì)胞凋亡情況[9-14]。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。 P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果

無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC- 7721細(xì)胞的增殖均有一定抑制作用。與陰性對(duì)照組比較，在給藥24、48 h后各給藥組細(xì)胞的OD值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且乙醇提取物中濃度組和精多糖高濃度組細(xì)胞在培養(yǎng)36 h后的OD值顯著降低（P<0.05）。比較各給藥組細(xì)胞在給藥24、36、48 h后結(jié)果可知，在給藥48 h 后3種提取物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)。粗多糖和精多糖的給藥濃度越高，抑制作者用越強(qiáng)，存在一定的量效關(guān)系；而乙醇提取物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用則不存在量效關(guān)系，中濃度給藥時(shí)抑制作用最強(qiáng)，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，乙醇提取物組、粗多糖組和精多糖組G0/G1、G2/M期細(xì)胞百分率顯著降低（P<0.01），S期細(xì)胞百分率顯著增加（P<0.01），其中乙醇提取物的作用效果優(yōu)于粗多糖和精多糖。細(xì)胞周期檢測(cè)的流式圖見(jiàn)圖1，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，乙醇提取物組、粗多糖組和精多糖組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高（P<0.05），其中以乙醇提取物組細(xì)胞凋亡率最高。陰性對(duì)照組、乙醇提取物組、粗多糖組和精多糖組細(xì)胞總凋亡率分別為5.6%、50.2%、17.9%、20.8%，細(xì)胞凋亡檢測(cè)的流式圖見(jiàn)圖2。

4 討論

本研究首先采用MTT法檢測(cè)無(wú)梗五加果實(shí)乙醇提取物、粗多糖和精多糖的抗腫瘤活性，分別設(shè)立24、36和48 h這3個(gè)給藥時(shí)間，每種提取物設(shè)立高、中、低3個(gè)給藥濃度，通過(guò)對(duì)給藥時(shí)間和給藥濃度進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)乙醇提取物、粗多糖提取物和精多糖提取物均在48 h后藥效最強(qiáng)。在給藥劑量方面，發(fā)現(xiàn)粗多糖提取物和精多糖提取物都是在高濃度時(shí)藥效最強(qiáng)，而乙醇提取物則是在中濃度時(shí)藥效最強(qiáng)，故確定乙醇提取物、粗多糖和精多糖的最佳給藥濃度分別是1.84、0.24、0.16 mg/mL。在采用MTT法明確了無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用后，進(jìn)一步采用PI染色法和FITC-AnnexinⅤ/PI雙染色法分別觀(guān)察無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)，各提取物均可顯著降低G0/G1和G2/M期細(xì)胞的百分率，顯著升高S期細(xì)胞百分率，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

試驗(yàn)中之所以對(duì)粗多糖和精多糖分別進(jìn)行考察，是因?yàn)榇侄嗵桥c精多糖相比，主要區(qū)別是粗多糖含有一定量的蛋白質(zhì)。分別考察粗多糖和精多糖抗腫瘤作用的目的，主要就是排除蛋白質(zhì)的干擾，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選抗腫瘤有效部位及單體奠定基礎(chǔ)。

綜合分析以上試驗(yàn)結(jié)果，可初步推測(cè)無(wú)梗五加果實(shí)3種提取物的抗腫瘤作用可能是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生的。

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（收稿日期：2017-09-27 修回日期：2017-11-11）

（編輯：林 靜）