不同栽培年限川桔梗中桔?？傇碥蘸徒酃Ｔ碥誅的含量比較

李心怡 陳玲 馬逾英 鄧薇

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）09-1249-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.23

摘 要 目的：建立測(cè)定川桔梗中桔?？傇碥占敖酃Ｔ碥誅含量的方法，探索不同栽培年限川桔梗藥材中2種指標(biāo)成分的差異。方法：采用紫外-可見分光光度法測(cè)定川桔梗中桔梗總皂苷的含量；采用高效液相色譜法測(cè)定川桔梗中桔梗皂苷D的含量；比較一年生、兩年生及三年生各10份川桔梗藥材中桔?？傇碥占敖酃Ｔ碥誅的含量。結(jié)果：一年生、二年生、三年生川桔梗藥材中桔?？傇碥蘸康钠骄捣謩e為2.47%、3.01%、2.47%；桔梗皂苷D含量的平均值分別為0.23%、0.27%、0.33%；即一年生的樣品中2種指標(biāo)的含量均較低，二年生樣品的桔?？傇碥蘸孔罡?，三年生樣品桔梗皂苷D的含量最高。結(jié)論：不同栽培年限的川桔梗藥材的指標(biāo)性成分含量具有一定差異，但二者間并未呈現(xiàn)相關(guān)性，建議選用栽培年限為二年生或三年生的藥材。

關(guān)鍵詞 川桔梗；桔?？傇碥眨唤酃Ｔ碥誅；栽培年限；含量測(cè)定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for content determination of total saponins and platycodin D in Platycodon grandiflorum from Sichuan and investigate the difference of 2 indexes in P. grandiflorum from Sichuan of different cultivated years. METHODS： The content of total saponins in P. grandiflorum from Sichuan was determined by UV spectrophotometry. The content of platycodin D was determined by HPLC. The contents of total saponins and platycodin D were compared among each 10 samples of annual， biennial and triennial P. grandiflorum from Sichuan. RESULTS： Average contents of total saponins in annual， biennial and triennial P. grandiflorum from Sichuan were 2.47%， 3.01%， 2.47%， respectively； average contents of platycodin D were 0.23%， 0.27%， 0.33%， respectively. The contents of 2 indexes in annual P. grandiflorum from Sichuan were in relative low level， while the content total saponins in biennial P. grandiflorum from Sichuan was the highest； the content of platycodin D in triennial P. grandiflorum was the highest. CONCLUSIONS： The contents of indexes are different among P. grandiflorum from Sichuan of different cultivated years. But there is no correlation between them. It is suggested to select biennial and triennial P. grandiflorum from Sichuan.

KEYWORDS Platycodon grandiflorum from Sichuan； Total saponins； Platycodin D； Cultivated years； Content determination

桔梗為桔?？浦参锝酃Platycodon grandiflorum （Jacq.） A. DC.]的干燥根，為一常用中藥，具有宣肺、利咽、祛痰、排膿的功效[1]，同時(shí)其也在布依族、朝鮮族、仡佬族、蒙古族、苗族、納西族、土家族、瑤族、壯族等多個(gè)少數(shù)民族中廣泛使用[2]，是我國(guó)銷量最大的40種傳統(tǒng)常用中藥材之一[3]。桔梗還是一種藥食同源的藥材，其肉質(zhì)根是東北朝鮮族制作泡菜的重要原料[4]。故桔梗除藥用外，還廣泛用于食品、化妝品等領(lǐng)域[5]。

桔梗中含有大量的三萜皂苷，其是藥理活性中的主要成分[6]?，F(xiàn)已經(jīng)從桔梗中分離鑒別了四十多種單體皂苷[7-10]，桔梗皂苷D是其主要的活性成分[11]。四川省梓潼縣是桔梗的道地產(chǎn)區(qū)之一，具有栽培歷史悠久、栽培面積廣等特點(diǎn)。由于市場(chǎng)價(jià)格的影響，川桔梗的栽培年限存在差異，多以二年生為主，也會(huì)出現(xiàn)一年生和三年生的情況。那么不同栽培年限對(duì)其皂苷類成分的含量及其品質(zhì)有何影響，目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。筆者采用紫外法測(cè)定川桔梗中桔?？傇碥盏暮浚咝б合嗌V（HPLC）法測(cè)定桔梗皂苷D的含量，研究不同栽培年限對(duì)川桔梗品質(zhì)的影響，為其最佳采收年限的確定提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1200 HPLC儀，配二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；A580紫外-可見分光光度計(jì)（翱藝儀器有限公司）；BP121S萬分之一電子分析天平（德國(guó)賽多利斯股份公司）；SB-3200DTD超聲波清洗器（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）； HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SHB-III循環(huán)水式真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥材

本試驗(yàn)所用的30份藥材樣品均來自四川省梓潼縣自采的藥材，其原植物經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院馬逾英教授鑒定，為桔?？浦参锝酃！悠非逑锤蓛糁笾糜?0 ℃恒溫烘箱中干燥至恒質(zhì)量，中藥粉碎機(jī)粉碎，干燥密封保存于封口袋中，備用。樣品產(chǎn)地及栽培信息見表1。

1.3 對(duì)照品、試劑與其他

桔梗皂苷D對(duì)照品（北京中科儀友化工技術(shù)研究院，批號(hào)：151110，純度：≥98%）；甲醇和乙腈均為色譜純，香蘭素及其余試劑均為分析純，水為純水。

D-101大孔吸附樹脂、大孔樹脂色譜柱（長(zhǎng)度：30 cm，內(nèi)徑：3 cm）均來源于成都科龍化工試劑廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 桔?？傇碥盏臏y(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取桔梗粉末1.00 g，準(zhǔn)確加入70%甲醇40 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液20 mL，置于水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，上樣于已處理好的D-101大孔吸附樹脂中，反復(fù)上樣5次后用100 mL純水洗脫，棄去洗脫液，再用200 mL 的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取桔梗皂苷D對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每1 mL含1.135 mg的溶液， 即得。

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密移取供試品溶液和對(duì)照品溶液各200 μL置于試管中，70 ℃水浴條件下蒸干，加入10%香草醛試液0.5 mL、60%硫酸溶液5 mL，搖勻，60 ℃水浴加熱15 min，冰水浴冷卻3 min，隨行試劑做空白對(duì)照，立即在紫外-可見分光光度計(jì)中取供試品溶液（樣品編號(hào)：11）與對(duì)照品溶液于400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，供試品溶液與對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)均約為470 nm，故選取470 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取桔梗皂苷D對(duì)照品溶液40、80、120、160、200、240 μL置于試管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度（A）。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得到方程為A=0.009c+0.027 9（R2=0.996 6，n=6）；表明桔梗皂苷D的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為8.25～49.53 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液200 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，連續(xù)測(cè)定6次。計(jì)算其RSD值為0.04%（n=6），提示儀器的精密性較好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（樣品編號(hào)：11）200 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色后于1、5、10、15、20、25、30、40、50、60 min時(shí)分別測(cè)定其吸光度，計(jì)算其RSD值為1.13%（n=6），表明供試品溶液放置在室溫60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份桔梗藥材粉末6份（樣品編號(hào)：11），每份約1.00 g，準(zhǔn)確稱定，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液。精密移取各供試品溶液200 μL置于試管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度。結(jié)果，供試品的總皂苷平均含量為2.12%，RSD值為1.94%（n=6）。

2.1.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取已知含量的桔梗藥材粉末6份（樣品編號(hào)：11），每份約0.05 g，加入相應(yīng)量的桔梗皂苷D對(duì)照品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液。精密移取各供試品溶液200 mL置于試管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度。結(jié)果，加樣回收率為97.31%～101.18%，RSD為1.61%（n=6）。

2.1.9 測(cè)定方法 取各樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，再精密移取各供試品溶液200 mL置于試管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各樣品中桔梗總皂苷的含量。

2.2 桔梗皂苷D的測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為Diamonil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸水（乙腈：0→20 min，10%→15%；20→35 min，15%→28%；35→50 min，28%→28%；50→60 min，28%→40%）；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為30 ℃。

取“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（樣品編號(hào)：11）和對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，色譜圖見圖2。

由圖2可見，待測(cè)峰與鄰峰分離良好。理論板數(shù)以桔梗皂苷D峰計(jì)不低于3 000。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取供試品粉末2.00 g至錐形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），冷卻；再次稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，水浴蒸干，加20 mL純水微熱使溶解，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇層，減壓蒸干，用甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，搖勻，過0.45 μm濾膜，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取桔梗皂苷D對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1.4 mg的溶液，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取1.4 μg/μL的對(duì)照品溶液4、8、12、14、18、22 μL，分別注入色譜儀中測(cè)定，記錄色譜。以桔梗皂苷D的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=177.2x-50.542（R2=0.999 8），結(jié)果表明桔梗皂苷D檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為5.6～30.8 μg。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果其保留時(shí)間的RSD為0.07%（n=6）；峰面積的RSD為0.08%（n=6）。提示儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一桔梗藥材供試品（樣品編號(hào)：11），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果其保留時(shí)間的RSD為0.41%（n=6），峰面積的RSD 為2.18%（n=6）。表示方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（樣品編號(hào)：11）分別在室溫下放置0、4、8、12、16、24 h后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果其保留時(shí)間的RSD為0.58%（n=6），峰面積的RSD 為1.46%（n=6）。提示供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取已知含量的桔梗藥材粉末6份（樣品編號(hào)：11），加入相應(yīng)量的桔梗皂苷D對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得加樣回收率為97.57%～101.37%（RSD=1.51%，n=6）。

2.2.9 測(cè)定方法 取各樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各樣品中桔梗皂苷D的含量。

2.3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

各樣品含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2結(jié)果表明，一年生樣品總皂苷含量為2.12%～2.62%，其平均值為2.42%；桔梗皂苷D含量為0.13%～0.37%，其平均值為0.23%。二年生樣品總皂苷含量為1.83%～4.93%，其平均值為3.16%；桔梗皂苷D含量為0.11%～0.47%，其平均值為0.27%。三年生樣品總皂苷含量為1.65%～3.03%，其平均值為2.43%；桔梗皂苷D含量為0.25%～0.50%，其平均值為0.35%。在桔梗總皂苷含量方面，一年生與三年生相當(dāng)，均低于二年生樣品；在桔梗皂苷D含量方面，一年生<二年生<三年生，即一年生樣品無論是桔梗總皂苷還是桔梗皂苷D的含量均最低，桔梗總皂苷含量以二年生更高，桔梗皂苷D的含量以三年生更高。

3 討論

筆者在本試驗(yàn)前期測(cè)定桔?？傇碥蘸徒酃Ｔ碥誅過程中曾對(duì)不同的提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間以及料液比進(jìn)行了考察，以選取最優(yōu)條件進(jìn)行提取，最終建立了本文的供試品溶液制備方法。

筆者在本課題組前期的產(chǎn)地考察中發(fā)現(xiàn)，由于受到市場(chǎng)價(jià)格的影響，一些藥農(nóng)僅僅栽培一年就將桔梗采挖，但本試驗(yàn)結(jié)果表明，一年生的桔梗藥材無論是桔梗總皂苷的含量還是桔梗皂苷D的含量都最低，這可能是由于生長(zhǎng)年限較短致成分富集不完全造成的，故建議采挖時(shí)最好選用二年生或三年生的藥材。

將桔?？傇碥蘸徒酃Ｔ碥誅的含量綜合考慮來看，兩者的含量與生長(zhǎng)年限并未顯示出明顯的相關(guān)性，二年生和三年生藥材中有效成分的含量各有不同。因此，筆者建議不應(yīng)單獨(dú)用某一成分作為評(píng)價(jià)其質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)從各方面進(jìn)行綜合考慮。

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（收稿日期：2017-07-24 修回日期：2017-09-15）

（編輯：劉 萍）