UPLC—MS/MS法同時測定垂盆草總黃酮中8種成分的含量

王雪 蔣志濤 嚴(yán)國俊 邵珠瑩 馮星月 潘金火

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1222-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.17

摘 要 目的：建立同時測定垂盆草總黃酮中金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素含量的方法。方法：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜柱為ZOBAX SB C18，流動相為甲醇-5 mmol/L甲酸銨水溶液（45 ∶ 55，V/V），流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2 μL；離子化模式為電噴霧電離，離子源溫度為400 ℃，脫溶劑溫度為300 ℃，脫溶劑流速為600 L/h，毛細(xì)管電壓為3 000 V，霧化氣壓力為45 psi，工作模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式，檢測方式為負(fù)離子模式。采用建立的方法測定3批垂盆草總黃酮中8種成分的含量。結(jié)果：金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為10.0～640.0、0.5～32.0、4.5～288.0、8.0～512.0、50.0～3 200.0、2.0～128.0、12.5～800.0、25.2～1 612.8 ng/mL（r≥0.991 4），檢測限分別為5.0、0.25、2.25、4.0、25.0、1.0、6.25、12.6 ng/mL，定量限分別為10.0、0.5、4.5、8.0、50.0、2.0、12.5、25.2 ng/mL；精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均≤4.3%（n=6），加樣回收率為95.9%～100.6%，RSD為1.5%～3.8%（n=6）。3批垂盆草總黃酮中金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素的含量分別為507.88～560.37、42.95～50.36、63.52～71.80、1 695.10～1 753.27、10 569.28～10 612.99、25.76～30.13、2 795.22～2 877.43、4 869.55～4 971.30 μg/g。結(jié)論：建立的方法可用于垂盆草總黃酮中8種成分含量的同時測定。

關(guān)鍵詞 垂盆草；總黃酮；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of hyperoside， quercitrin， luteoloside， kaempferol， quercetin， rutin， luteolin and isorhamnetin in total flavanones of Sedum sarmentosum Bunge. METHODS： UPLC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on ZOBAX SB C18 column with mobile phase consisted of methanol-5 mmol/L ammonium formate aqueous solution （45 ∶ 55， V/V） at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 2 ?L. The electrospray ionization source （ESI） was used； ion source temperature was 400 ℃； desolvation temperature was 300 ℃； desolvation gas flow was 600 L/h； capillary voltage was 3 000 V； nebuliser pressure was 45 psi； the work mode was multiple reaction monitoring mode； detection mode was negative ion mode. The established method was used to determine the contents of 8 components in 3 batches of total flavanones of Sedum sarmentosum Bunge. RESULTS： The linear ranges of hyperoside， quercitrin， luteoloside， kaempferol， quercetin， rutin， luteolin and isorhamnetin were 10.0-640.0， 0.5-32.0， 4.5-288.0， 8.0-512.0， 50.0-3 200.0， 2.0-128.0， 12.5-800.0 and 25.2-1 612.8 ng/mL （r≥0.991 4）， respectively. The limits of detection were 5.0， 0.25， 2.25， 4.0， 25.0， 1.0， 6.25 and 12.6 ng/mL， respectively. The limits of quantitation were 10.0， 0.5， 4.5， 8.0， 50.0， 2.0， 12.5 and 25.2 ng/mL， separately. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were no more than 4.3% （n=6）. The recoveries were 95.9%-100.6%， and RSDs were 1.5%-3.8% （n=6）. The contents of hyperoside， quercitrin， luteoloside， kaempferol， quercetin， rutin， luteolin and isorhamnetin in 3 batches of total flavanones of Sedum sarmentosum Bunge were 507.88-560.37， 42.95-50.36， 63.52-71.80， 1 695.10-1 753.27， 10 569.28-10 612.99， 25.76-30.13， 2 795.22-2 877.43 and 4 869.55-4 971.30 μg/g， respectively. CONCLUSIONS： The established method can be used for simultaneous determination of 8 components in total flavanones of Sedum sarmentosum Bunge.

KEYWORDS Sedum sarmentosum Bunge； Total flavanones； UPLC-MS/MS； Content determination

中藥垂盆草，又名石指甲、狗牙半支、狗牙瓣、佛指甲等，為景天科植物垂盆草的新鮮或干燥全草[1]，具有利濕退黃、清熱解毒、排膿生肌的功能，用于治療癰腫瘡瘍、小便不利、濕熱黃疸[2]等。垂盆草主要含有黃酮類、氰苷、生物堿類、三萜類、甾醇類等化合物[3-4]，具有保肝、抗腫瘤、改善急性胰腺炎肺損傷、抗炎、抗氧化、抗腎纖維化、增強(qiáng)肌力等[5-12]多種活性。垂盆草總黃酮是垂盆草中重要的保肝降酶活性成分之一[13]，課題組前期進(jìn)行了其保肝降酶試驗(yàn)，確證了其功效。本試驗(yàn)前期采用高效液相色譜-紫外檢測（HPLC-UV）法測定垂盆草總黃酮中的成分，但槲皮苷、木犀草苷、蘆丁等成分含量較低，無明顯的響應(yīng)信號，難以檢測。且該檢測方法靈敏度低、操作復(fù)雜、耗時長、干擾大，不能同時測定垂盆草總黃酮中的金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素8種成分。因此，研究建立一種快速、準(zhǔn)確、簡便的同時測定垂盆草總黃酮中多種化學(xué)成分的分析方法顯得尤為重要。與常用的HPLC-UV法[14-15]比較，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法具有極大的優(yōu)勢，該法檢測快速，抗干擾能力強(qiáng)，不要求被測成分完全分離，能夠極大地縮短樣品的保留時間，有利于保證樣品的穩(wěn)定性[16]。一方面節(jié)省了分析時間，另一方面節(jié)約配制流動相所需的有機(jī)試劑，以較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性提高了工作效率[17]。鑒于此，筆者采用UPLC- MS/MS法同時測定垂盆草總黃酮中金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素的含量，以期為垂盆草總黃酮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1290超高效液相色譜儀，包括API 4000三重四級桿質(zhì)譜、Analyst 1.4.2色譜工作站（美國Agilent 公司）；Biosafer SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)[賽飛（中國）有限公司]；AE240十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；Allegra X-30R 冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Drict-Q5超純水機(jī)（法國Millipore公司）。

1.2 試劑

對照品金絲桃苷（批號：PRF7102522）、槲皮苷（批號：PRF7051141）、木犀草苷（批號：PRF8030242）、山柰酚（批號：PRF7081242）、槲皮素（批號：PRF15122403）、蘆丁（批號：PRF8012042）、木犀草素（批號：PRF7061023）、異鼠李素（批號：PRF7101401）均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度均>98%；替硝唑（批號：100336-200402），購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

垂盆草藥材購于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，采自江蘇省宿遷市沐陽縣垂盆草種植基地，批號：160820010，經(jīng)張家港市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科余輝主任中藥師鑒定為景天科植物垂盆草（Sedum sarmentosum Bunge）的干燥全草。垂盆草總黃酮（由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生王雪提?。喝∵m量垂盆草藥材，加8倍質(zhì)量的80%乙醇回流提取2次，提取液減壓濃縮為1 ∶ 1。經(jīng)石油醚脫脂后，揮干石油醚，調(diào)節(jié)藥液濃度以及pH。用大孔樹脂和聚酰胺聯(lián)用法，進(jìn)行上樣、洗脫。洗脫液經(jīng)減壓濃縮后，冷凍干燥得垂盆草總黃酮藥粉備用，采用紫外分光光度計進(jìn)行測定，得到藥粉中垂盆草總黃酮的純度約為58.36% ，批號：20170318、20170406、20170520）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZOBAX SB C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相：甲醇-5 mmol/L甲酸銨水溶液（45 ∶ 55，V/V）；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子化模式：電噴霧電離；離子源溫度：400 ℃；脫溶劑溫度：300 ℃；脫溶劑氣流以及霧化器均采用氮?dú)猓∟2），脫溶劑流速：600 L/h；毛細(xì)管電壓：3 000 V；霧化氣壓力：45 psi；工作模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；檢測方式：負(fù)離子模式。各成分的檢測離子、質(zhì)荷比、去簇電壓及碰撞能量見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為1 mg/mL的單一對照品溶液，保存于冰箱中（-4 ℃），備用。取上述各單一對照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為640.0、32.0、288.0、512.0、3 200.0、128.0、800.0、 1 612.8 ng/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 取替硝唑?qū)φ掌愤m量，置于10 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.096 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。取內(nèi)標(biāo)貯備液適量，置于10 mL量瓶中，使用50%甲醇定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為5.48×104 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 供試品溶液 取垂盆草總黃酮粉末（過40目篩）約0.5 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶ 1，V/V）混合溶液100 mL，稱質(zhì)量，水浴加熱回流1 h，放冷后，再稱定質(zhì)量；用甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶ 1， V/V）混合溶液補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻并濾過。取濾液1 mL，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻；經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取100 μL續(xù)濾液，加入內(nèi)標(biāo)液10 μL，混勻，即得。

2.2.4 空白對照溶液 以50%甲醇作空白對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下空白對照溶液、混合對照品溶液以及供試品溶液各2 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.1.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1。

結(jié)果顯示，供試品色譜圖中，金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素與對照品的保留時間一致；而空白對照色譜圖在相同保留時間內(nèi)無干擾峰出現(xiàn)。結(jié)果表明，樣品測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，用50%甲醇逐級稀釋，得到7種質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液，金絲桃苷（10、20、40、80、160、320、640 ng/mL）、槲皮苷（0.5、1、2、4、8、16、32 ng/mL）、木犀草苷（4.5、9、18、36、72、144、288 ng/mL）、山柰酚（8、16、32、64、128、256、512 ng/mL）、槲皮素（50、100、200、400、800、1 600、3 200 ng/mL）、蘆丁（2、4、8、16、32、64、128 ng/mL）、木犀草素（12.5、25、50、100、200、400、800 ng/mL）、異鼠李素（25.2、50.4、100.8、201.6、403.2、806.4、1 612.8 ng/mL），分別加入“2.2.2”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，得待測溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.1.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，分別精密吸取各濃度的混合對照品溶液2 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，以對照品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比（y）為縱坐標(biāo)、對照品的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸運(yùn)算，得回歸方程與線性范圍， 結(jié)果見表2。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，依次稀釋成梯度質(zhì)量濃度溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.1.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析測定。以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10分別計算檢測限和定量限。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素的檢測限分別為5.0、0.25、2.25、4.0、25.0、1.0、6.25、12.6 ng/mL，定量限分別為10.0、0.5、4.5、8.0、50.0、2.0、12.5、25.2 ng/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取金絲桃苷（12.8、256、512 ng/mL）、槲皮苷（1、16、25.6 ng/mL）、木犀草苷（9、144、230.4 ng/mL）、山柰酚（19.2、307.2、435.2 ng/mL）、槲皮素（120、1 920、2 560 ng/mL）、蘆?。?、64、102.4 ng/mL）、木犀草素（30、250、640 ng/mL）、異鼠李素（60.48、302.4、1 290.24 ng/mL）低、中、高3種濃度的混合對照品溶液適量，按 “2.1.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.1.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，每次2 μL，記錄峰面積。結(jié)果，金絲桃苷峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD分別為4.3%、3.5%、3.6%（n=6），槲皮苷的RSD分別為2.6%、3.2%、4.1%（n=6），木犀草苷的RSD分別為2.3%、1.1%、2.1%（n=6），山柰酚的RSD分別為2.7%、1.8%、3.7%（n=6），槲皮素的RSD分別為3.9%、2.1%、4.1%（n=6），蘆丁的RSD分別為2.6%、3.0%、3.9%（n=6），木犀草素的RSD分別為3.1%、2.4%、1.7%（n=6），異鼠李素的RSD分別為2.3%、1.4%、3.8%（n=6），表明本方法的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號為20170520的樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制成供試品溶液后，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.1.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.6%、2.1%、3.0%、2.5%、2.9%、1.4%、2.6%、1.8%（n=6），與0 h比較，含量的差異小于±3.2%，表明樣品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號為20170520的樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制成供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.1.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素含量分別為106.89、9.22、13.67、344.31、2 117.75、5.59、558.21、975.08 ng/mL（n=6）；各成分含量的RSD分別為1.9%、2.3%、2.8%、1.5%、1.1%、2.6%、1.8%、2.0%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號：20170520）0.10 g，共6份，分別置于500 mL圓底燒瓶中，加入金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素對照品溶液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制成供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.1.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素的平均加樣回收率分別為97.8%、100.2%、95.9%、100.6%、95.9%、98.6%、99.3%、97.6%，RSD值分別為1.9%、3.7%、2.3%、2.9%、2.1%、3.8%、1.5%、2.8%（n=6），顯示8種成分的加樣回收率為95.9%～100.6%，RSD值為1.5%～3.8%（n=6），表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

2.10 樣品含量測定

分別取3批垂盆草總黃酮，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別進(jìn)樣2 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.1.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)行測定分析，計算得到各批樣品中8種成分的含量。結(jié)果，各批垂盆草總黃酮中金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素含量分別為507.88～560.37、42.95～50.36、63.52～71.80、1 695.10～1 753.27、10 569.28～10 612.99、25.76～30.13、2 795.22～2 877.43、4 869.55～4 971.30 μg/g，表明3批垂盆草總黃酮藥粉之間含量差異較小，見表3。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在進(jìn)行色譜條件的選擇時，筆者比較了不同規(guī)格超高效液相色譜柱對色譜分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用ZOBAX SB C18色譜柱（150 mm×2.1 mm， 5 μm）所得峰較好。同時，依據(jù)8種成分分離的相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]，筆者還分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-5 mmol/L甲酸銨水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-5 mmol/L甲酸銨水溶液等度洗脫法。結(jié)果顯示，采用甲醇-5 mmol/L甲酸銨水溶液等度洗脫法時各個峰的分離效果較好。因此，選擇甲醇-5 mmol/L甲酸銨水溶液為流動相。

3.2 質(zhì)譜條件的考察

在質(zhì)譜分析中，筆者對離子檢測模式進(jìn)行了考察，分別考察了正、負(fù)離子模式對檢測的響應(yīng)情況。結(jié)果顯示，金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，故采用負(fù)離子檢測模式對8種成分進(jìn)行同時檢測。為了提高垂盆草總黃酮中8種成分測定的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測定。筆者根據(jù)以往試驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)，首先選擇了替硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)替硝唑響應(yīng)良好，不受試樣中其他組分峰的干擾，比較穩(wěn)定，所以最終選擇替硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)物質(zhì)。

3.3 小結(jié)

本試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS對3批垂盆草總黃酮中8種成分的含量同時進(jìn)行測定，由于方法靈敏度高，檢測穩(wěn)定性略差于液相，RSD值也略大，造成精密度試驗(yàn)中個別RSD值有偏差。但是，在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，精密度接受范圍和回收率限度可適當(dāng)放寬，分別控制在RSD≤4% 、回收率85%～110%范圍內(nèi)即可[20]，所以該方法下的線性關(guān)系、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率均符合要求。

綜上所述，本研究建立的方法可用于垂盆草總黃酮中金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、山柰酚、槲皮素、蘆丁、木犀草素、異鼠李素含量的同時測定。

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（收稿日期：2018-01-10 修回日期：2018-03-25）

（編輯：余慶華）