高效液相色譜法測(cè)定卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)

馮菊 任鳳英 楊晨 李江紅 汪錫佳 陳林 石克金

中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）09-1209-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.14

摘 要 目的：建立測(cè)定卡巴他賽注射液中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18，流動(dòng)相為水-乙腈-乙醇（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，進(jìn)樣量為20 μL。采用建立的方法測(cè)定3批卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果：卡巴他賽檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.039～11.60 μg/mL（r=0.999 8，n=7），檢測(cè)限為2×10-4 μg，定量限為8×10-4 μg；精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<10.0%（n=6）。3批樣品單雜量為0.07%～0.08%，總雜量為0.26%～0.29%。 結(jié)論：建立的方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)檢查。

關(guān)鍵詞 卡巴他賽注射液；高效液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)；梯度洗脫

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of related substances in Cabazitaxel injection. METHODS： HPLC method was used. The determination was performed on Agilent Eclipse XDB-C18 column with mobile phase consisted of water-acetonitrile-ethanol （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 35 ℃， and the detection wavelength was set at 230 nm. The sample size was 20 μL. Established method was used to determine related substances in 3 batches of Cabazitaxel injection. RESULTS： The linear relationship of cabazitaxel were 0.039-11.60 μg/mL （r=0.999 8， n=7）. The detection limit was 2×10-4 μg， and quantitation limit was 8×10-4 μg. RSD of precision and reproducibility tests were all lower than 10.0% （n=6）. The amount of single impurity in 3 batches of samples ranged 0.07%-0.08%， and total amount of impurities were 0.26%-0.29%. CONCLUSIONS： Established method is simple， accurate and reliable， can be used for the determination of related substances in Cabazitaxel injection.

KEYWORDS Cabazitaxel injection； HPLC； Related substance； Gradient elution

前列腺癌是臨床中較為常見(jiàn)的一種男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤。在我國(guó)隨著人們生活方式的改變、 人口老齡化、通過(guò)逐漸普及的前列腺特異抗原（PSA）篩查，發(fā)現(xiàn)前列腺癌發(fā)病率在逐年升高[1]。有研究[2-4]報(bào)道，卡巴他賽不僅對(duì)多西他賽敏感的腫瘤株有活性，對(duì)多西他賽不敏感的腫瘤也有活性，應(yīng)用范圍更廣，因此具有較好的發(fā)展前景?？ò退悾–abazitaxel）是一種紫杉烷類藥，多由紅豆杉經(jīng)萃取的前體半合成制備而成[5]，用于治療晚期、抗激素型前列腺癌[6]?？ò退惥哂锌鼓[瘤作用強(qiáng)的特點(diǎn)[7]，其作用機(jī)制為抑制微管蛋白[8]，與多烯紫杉醇相似。在2010年6月17日獲美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市，是獲得批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性激素難治性前列腺癌的二線治療中首個(gè)及唯一一個(gè)提供顯著生存獲益的治療藥物[9-13]。其原料藥的有關(guān)物質(zhì)檢查方法已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[14]。筆者采用已報(bào)道原料藥的有關(guān)檢查方法，對(duì)卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢查試驗(yàn)，但是該報(bào)道的原料藥有關(guān)物質(zhì)的分析方法未檢測(cè)出主峰，所以得出該分析方法可能不適用于卡巴他賽注射液制劑分析。結(jié)合卡巴他賽原料在合成過(guò)程中會(huì)引入一些副產(chǎn)物和中間體[15-16]，其制劑過(guò)程中加入的輔料和制劑工藝中也可能引入的雜質(zhì)，這些有關(guān)物質(zhì)可能是無(wú)效或者危害人的生命，亦或者影響藥物的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響藥物的質(zhì)量[17]。到目前為止，在各國(guó)藥典中還未收載此藥。根據(jù)以上原因，筆者采用反相高效液相色譜法對(duì)卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析[18]，篩選出了能夠達(dá)到控制其有關(guān)物質(zhì)的分析方法，為卡巴他賽注射液有關(guān)物質(zhì)分析提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；XS205電子分析天平 （瑞士Mettler -Toledo公司）；AS5150A超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Agilent Eclipse XDB色譜柱（美國(guó)Agilent公司）；Capcell Pak MGⅡ色譜柱（日本資生堂公司）；Swell Chromplus色譜柱（成都思為科學(xué)儀器有限公司）；Agilent SB色譜柱（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

卡巴他賽對(duì)照品（批號(hào)：ws-120901，純度：98.55%）、卡巴他賽注射液（批號(hào)：150409、150410、150411，規(guī)格：1.5 mL ∶ 60 mg）以及雜質(zhì)對(duì)照Z(yǔ)JTI（批號(hào)：141205，純度：95.60%）、DXTS（批號(hào)：141207，純度：95.79%）、CI-12（批號(hào)：141103，純度：95.81%）、CI-23（批號(hào)：141219，純度：96.10%）、CI-24（批號(hào)：150121，純度：95.89%）均為自制。乙腈、乙醇均為色譜純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，乙醇為流動(dòng)相C，梯度洗脫，見(jiàn)表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 溶劑 取200 mL的去離子水與800 mL乙腈混合，制成水-乙腈（2 ∶ 8，V/V）的混合液，超聲混勻，即可。

2.2.2 對(duì)照品溶液 取卡巴他賽工作對(duì)照品25 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用溶劑超聲（功率：120 W，頻率：40 kHz，10 min）溶解并稀釋至刻度，搖勻，再取1.0 mL置于100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即可。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取卡巴他賽注射劑供試品適量（約相當(dāng)于卡巴他賽25 mg），置于50 mL量瓶中，用溶劑超聲（功率：120 W，頻率：40 kHz，10 min）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即可。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)和檢測(cè)方法

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使卡巴他賽峰高約為滿量程的10%～20%。取對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，其峰面積的RSD不得超過(guò)2.0%，卡巴他賽峰的拖尾因子不得超過(guò)1.5。

2.3.2 檢測(cè)方法 取“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至卡巴他賽峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，任一單個(gè)雜質(zhì)峰面積的RSD均不得超過(guò)0.2%，總雜質(zhì)峰面積的RSD不得超過(guò)1.0%。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果 取對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，連續(xù)6次進(jìn)樣。結(jié)果，主峰面積的RSD為0.17%，主峰拖尾因子為1.14～1.15，符合系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。色譜圖見(jiàn)圖1的A圖。

2.4 色譜柱耐用性試驗(yàn)

選擇Agilent XDB、Capcell Pak MGⅡ、Swell Chromplus、Agilent SB等色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)分離度、雜質(zhì)峰個(gè)數(shù)、拖尾因子等進(jìn)行比較。結(jié)果表明，采用Agilent Eclipse XDB C18色譜柱檢出雜峰個(gè)數(shù)最多，分離度最大，主峰對(duì)稱性最好，故選用Agilent Eclipse XDB C18色譜柱檢測(cè)卡巴他賽的有關(guān)物質(zhì)。色譜柱篩選結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 專屬性考察

2.5.1 本品主組分與雜質(zhì)、中間體、輔料的分離 取按處方比例配制的不含主成分的混合空白輔料溶液（吐溫80）約625 mg，置于50 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為空白溶液。分別取中間體ZJTI、DXTS、CI-12、CI-23、CI-24適量，加溶劑制成濃度均為每1 mL中含0.02 mg的溶液，取此溶液少量（1 mL）和供試品溶液（5 mL）混合置于10 mL量瓶中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，空白輔料不干擾本品的測(cè)定，中間體能與卡巴他賽完全分離。色譜圖見(jiàn)圖1的B、C、D圖。

2.5.2 降解試驗(yàn) 取供試品（批號(hào)：150409）適量（約相當(dāng)于卡巴他賽25 mg），置于50 mL量瓶中，分別經(jīng)強(qiáng)酸（0.1 mol/L的鹽酸溶液，室溫放置2 h）、強(qiáng)堿（0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，室溫放置10 min）、高溫（120 ℃ 時(shí)放置2.5 h）、氧化（1 mL的雙氧水溶液，在120 ℃放置20 min）、強(qiáng)光[（4 500±500） lx，2 h]降解，酸堿破壞樣品分別中和后，均用溶劑稀釋至刻度，分別取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜。結(jié)果表明，降解物質(zhì)與主峰均能較好地分離。色譜圖見(jiàn)圖1的E、F、G、H、I圖。

2.6 線性關(guān)系考察

取卡巴他賽工作對(duì)照品適量，加溶劑依次配制成11.60、7.73、3.87、1.93、0.77、0.39、0.039 μg/mL濃度的溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)其主峰面積分別為360 964、243 926、122 223、66 348、24 852、12 390、1 218。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，線性回歸方程為y=31 105x+1 850.49（r= 0.999 8）。結(jié)果表明，卡巴他賽在0.039～11.60 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 檢測(cè)限與定量限考察

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限。結(jié)果，卡巴他賽的檢測(cè)限為2×10-4 μg，定量限為8×10-4 μg。

2.8 精密度試驗(yàn)

2.8.1 進(jìn)樣精密度 稱取625 mg供試品（主藥量約25 mg）于50 mL量瓶中，用溶劑稀釋定容配成含卡巴他賽0.5 mg/mL的供試液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制對(duì)照液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。結(jié)果，最大單雜的RSD為8.94%（n=6），總雜的RSD為4.76%（n=6），表明進(jìn)樣精密度良好。

2.8.2 中間精密度 對(duì)同一樣品不同日期、不同操作人員按有關(guān)物質(zhì)檢查方法測(cè)定，進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。結(jié)果，最大單雜的RSD分別為9.27%、8.21%（n=6），總雜的RSD分別為6.38%、5.39%（n=6），表明中間精密度試驗(yàn)良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取625 mg供試品（批號(hào)：150409）（主藥量約25 mg）6份，分別置于50 mL量瓶中，用溶劑稀釋定容配成含卡巴他賽0.5 mg/mL的供試液，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制對(duì)照液，取20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。結(jié)果，最大單雜的RSD為8.21%（n=6），總雜的RSD為5.39%（n=6），表明重復(fù)性試驗(yàn)良好。

2.10 卡巴他賽注射液測(cè)定結(jié)果

取3批樣品適量，各3份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算最大單雜（未知）量和總雜量。結(jié)果，批號(hào)為150409、150410、150411的卡巴他賽樣品其最大單雜（未知）量分別為0.07%、0.07%、0.08%，總雜量分別為0.28%、0.29%、0.26%，測(cè)得結(jié)果穩(wěn)定，表明本檢測(cè)方法可行。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在篩選試驗(yàn)條件時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)柱溫和流速對(duì)分離度和雜峰個(gè)數(shù)無(wú)影響，而柱溫低或流速增大可使色譜柱的柱壓會(huì)增加，故根據(jù)試驗(yàn)實(shí)際情況，選擇柱溫為35 ℃，流速為1 mL/min。

3.2 溶劑的選擇

在選擇溶劑的過(guò)程中，主要考慮到卡巴他賽幾乎不溶于水，溶于乙醇、乙腈，輔料（吐溫）易溶于水的性質(zhì)，初步選擇水、乙腈和乙醇3種試劑作為溶劑，而經(jīng)試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)有無(wú)乙醇對(duì)溶液穩(wěn)定性沒(méi)有影響，最終采用水-乙腈（2 ∶ 8，V/V）為溶解樣品的溶劑。

3.3 卡巴他賽主組分與雜質(zhì)的分離

在專屬性試驗(yàn)時(shí)，采用二極管陣列檢測(cè)器，取經(jīng)過(guò)各種降解后所得的樣品溶液進(jìn)行試驗(yàn)，卡巴他賽主峰的峰純度因子均在999以上，表明卡巴他賽與雜質(zhì)能夠完全分離，故本法能準(zhǔn)確、可靠地測(cè)定卡巴他賽的有關(guān)物質(zhì)。

3.4 進(jìn)樣濃度的選擇

以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)，隨著濃度的增加檢測(cè)到的雜質(zhì)峰有所增加，但當(dāng)濃度增加到0.5 mg/mL時(shí)，雜峰個(gè)數(shù)不再增加，又考慮到色譜柱使用壽命，最終選擇0.5 mg/mL的溶液為進(jìn)樣濃度。

綜上，本研究建立的方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于卡巴他賽注射液的有關(guān)物質(zhì)檢查。

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（收稿日期：2017-12-23 修回日期：2018-03-15）

（編輯：余慶華）