腫瘤標志物PHPAA分子印跡聚合物的合成與性能研究

劉偉婷 張媛媛 乾康 高淑婷 萬喜 尹小英

中圖分類號 O631.6；R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）08-1027-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.04

摘 要 目的：合成對羥基苯乙酸（PHPAA）分子印跡聚合物（MIPs），為腫瘤患者尿液中PHPAA的分離富集提供參考。方法：以PHPAA為模板分子，以偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，分別以4-乙烯基吡啶（4-V）、丙烯酰胺（AM）、1-乙烯基咪唑（1-V）、鄰苯二胺為功能單體，以二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）為交聯(lián)劑，采用沉淀聚合法合成MIPs。采用掃描電鏡、紅外光譜、靜態(tài)吸附試驗、分子識別性能試驗對其微球結(jié)構(gòu)和性能進行表征。結(jié)果：MIPs1（4-V、EGDMA）微球粘連嚴重，MIPs2（AM、EGDMA）微球呈聚集狀；MIPs3（1-V、TRIM）、MIPs4（鄰苯二胺、TRIM）微球較為分散，且球形度好。MIPs的紅外光譜中未見PHPAA的特征吸收峰。各MIPs的吸附量均高于不含模板分子的空白印跡聚合物，且隨著模板分子濃度的升高，其吸附量也隨之增加。MIPs3的吸附量顯著高于其他MIPs，其對PHPAA的靜態(tài)分配系數(shù)（0.14）高于其他結(jié)構(gòu)類似物[對羥基苯丙酸（PHPA）（0.06）、酪氨酸（TA）（0.01）]，對PHPAA與PHPA、PHPAA與TA的選擇性分離因子分別為2.3、11.5。結(jié)論：以1-V為功能單體、TRIM為交聯(lián)劑合成的MIPs對PHPAA分子具有特異性吸附和選擇性識別能力，可將其作為固相萃取劑，用以分離富集腫瘤患者尿液中低含量的PHPAA。

關(guān)鍵詞 對羥基苯乙酸；分子印跡聚合物；功能單體；沉淀聚合；靜態(tài)吸附；分子識別性能

ABSTRACT OBJECTIVE： To synthesize 4-hydroxyphenylacetic acid （PHPAA） molecular imprinted polymers （MIPs）， and to provide reference for separation and enrichment of PHPAA in urine of cancer patients. METHODS： With PHPAA as template molecule and azobisisobutyronitrile as evocating agent， MIPs was synthesized by precipitation polymerization using 4-vinyl pyridine （4-V）， acrylamide （AM）， 1-vinyl imidazole （1-V） and o-diaminobenzene as functional monomers， ethylene glycol dimethacrylate （EGDMA） and trimethylolpropane trimethacrylate （TRIM） as crosslinking agent. Using scanning electron microscope， infrared spectrum， static adsorption test and molecular recognition performance test used adopted to characterize the structure and performance of MIPs. RESULTS： MIPs1（4-V， EGDMA）microspheres adhered seriously， and MIPs2（AM， EGDMA）microspheres are aggregated. MIPs3（1-V， TRIM）， MIPs4 （o-diaminobenzene， TRIM） microspheresare were dispersed and had good sphericity. Characteristic absorption peak of PHPAA was not found in infrared spectrum of MIPs. The adsorption capacity of each MIPs was higher than that of blank imprinted polymer without the template molecule， and increased as the increase of template molecular concentration. The adsorption capacity of MIPs3 was significantly higher than that of other MIPs， and its static distribution coefficient （0.14） of PHPAA was higher than that of other structural analogues [PHPA （0.06），TA （0.01）]， selective separation factors of PHPAA to PHPA， PHPAA to TA were 2.3， 11.5， respectively. CONCLUSIONS： MIPs synthesized with 1-V as functional monomer and TRIM as crosslinking agent has the ability of specific adsorption and selective recognition. It can used as solid phase extractant to separate and enrich low content of PHPAA in the urine of tumor patients.

KEYWORDS 4-Hydroxyphenylacetic acid； Molecular imprinted polymer； Functional monomer； Precipitation polymerization； Static adsorption； Molecular recognition performance

對羥基苯乙酸（4-Hydroxyphenylacetic acid，PHPAA）是酪氨酸代謝產(chǎn)物之一[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸及其酚類代謝產(chǎn)物的紊亂不僅與氨基酸代謝疾病有關(guān)，而且與惡性腫瘤也有一定關(guān)聯(lián)[2-3]。代謝研究結(jié)果表明，乳腺癌和卵巢癌患者尿液中PHPAA的含量低于正常人[（5.39±0.23）～（99.67±1.82）mg/L]，加之尿液中成分復雜，傳統(tǒng)的萃取填料（C8、C18等）難以特異性地將其提取出來，使得腫瘤標志物的分離富集成為難題[4-5]。近年來，分子印跡聚合物（Molecular imprinted polymers，MIPs）由于其識別能力強、性質(zhì)穩(wěn)定、可重復使用等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于仿生傳感器[6]、分離分析[7]和人工模擬抗體[8-9]等領(lǐng)域，非常適合作為固相微萃取填料，分離富集生物樣本中微量的目標產(chǎn)物，實現(xiàn)特定分子的分離與分析。為此，本研究運用沉淀聚合法合成MIPs，并對其結(jié)構(gòu)和吸附、分子識別性能進行表征，以期為腫瘤患者尿液中低含量PHPAA的分離富集以及早期診斷、輔助治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-2550型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；5700型紅外光譜儀（美國Nicolet公司）；Quanta 250型掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）；CHY-2型恒溫振蕩器（江蘇金壇富華儀器有限公司）；SK-1200H型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；HH-2型恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

1.2 試劑

PHPAA對照品（批號：J1409049，純度：99%）、對羥基苯丙酸對照品（PHPA，批號：G1513061，純度：98%）、酪氨酸對照品（TA，批號：A0274948，純度：98%）均購自上海阿拉丁試劑有限公司；功能單體[4-乙烯基吡啶（4-V）、丙烯酰胺（AM）、1-乙烯基咪唑（1-V）、鄰苯二胺]、交聯(lián)劑[二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）]、引發(fā)劑[偶氮二異丁腈（AIBN）]、致孔劑（乙腈）等試劑均為分析純。

2 方法

2.1 合成

采用沉淀聚合法。將模板分子（PHPAA）、功能單體（4-V、AM、1-V、鄰苯二胺）和交聯(lián)劑（EGDMA、TRIM）溶解在裝有致孔劑（乙腈）80 mL的圓底燒瓶中，加入引發(fā)劑（AIBN）78 mg后，通氮氣15 min，密封，放置于60 ℃水浴中聚合24 h。采用索氏提取法，使用甲醇-冰醋酸溶液（9 ∶ 1，V/V）對反應(yīng)后的聚合物進行洗脫，以去除模板分子（吸取洗脫液適量，在277 nm波長處進行紫外光譜掃描，至檢測不到模板分子的吸收為止）；再用甲醇洗去殘留的冰醋酸，即得到MIPs，將該聚合物于60 ℃真空烘干，備用?？瞻子≯E聚合物（Nonimprinted polymers，NIPs）除不加入模板分子外，其余步驟同上。不同MIPs、NIPs的組成見表1。

2.2 掃描電鏡分析

分別取“2.1”項下各MIPs、NIPs適量，置于試管中，加入適量甲醇，超聲（功率：53 kHz）處理10 min使其分散，隨后于60 ℃真空烘干，使用掃描電子顯微鏡對其微球形貌進行結(jié)構(gòu)分析。

2.3 紅外光譜分析

使用紅外光譜儀對模板分子、MIPs、NIPs進行比較，分析其結(jié)構(gòu)變化。

2.4 靜態(tài)吸附試驗

2.4.1 PHPAA標準溶液的制備 精密稱取PHPAA對照品0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g，分別置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容，搖勻，得相應(yīng)質(zhì)量濃度的PHPAA對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液各0.25 mL，分別置于25 mL量瓶中，加乙腈稀釋并定容，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50、60 μg/mL的PHPAA標準溶液，備用。

2.4.2 試驗內(nèi)容 精密稱取“2.1”項下各MIPs/NIPs 20.0 mg，置于10 mL量瓶中，依次加入“2.4.1”項下PHPAA標準溶液各3 mL，密閉，于25 ℃恒溫振搖吸附12 h后，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液適量，使用紫外-可見分光光度計于277 nm處測定其吸光度，考察模板分子的濃度變化，并以此計算模板分子在聚合物上的吸附量（Q）。Q=（c0-cs）V/m[式中，Q為靜態(tài)平衡吸附量（μmol/g），c0為模板分子的起始濃度（μmol/L），cs為吸附平衡時模板分子的濃度（μmol/L），V為底物溶液的體積（L），m為MIPs/NIPs的使用量（g）][10]。以Q為縱坐標、c0（不同濃度單位之間需相互換算）為橫坐標繪制等溫吸附曲線，考察MIPs的靜態(tài)吸附性能。

2.5 分子識別性能試驗

2.5.1 PHPA、TA標準溶液的制備 精密稱取PHPA、TA對照品各0.01 g，按“2.4.1”項下方法操作，制得質(zhì)量濃度均為10 mg/L的PHPA、TA標準溶液，備用。

2.5.2 試驗內(nèi)容 選取人體內(nèi)酪氨酸代謝產(chǎn)物PHPAA、PHPA、TA作為底物，考察MIPs的分子識別性能[11]。精密稱取“2.1”項下MIPs各20 mg，分別置于10 mL量瓶中，依次加入質(zhì)量濃度為10 mg/L的PHPAA、PHPA、TA標準溶液各3 mL，于25 ℃恒溫振蕩24 h。取上述溶液適量，使用紫外-可見分光光度計分別于277 nm（PHPAA）、278 nm（PHPA）、279 nm（TA）處測定其吸光度，考察底物的濃度變化，并以此計算各底物在聚合物上的吸附量，平行測定3次。MIPs的分子識別性能以靜態(tài)分配系數(shù)（Kd）和選擇性分離因子（α）進行表征。其中，Kd=cp/cc[式中，cp表示聚合物結(jié)合底物的濃度（μmol/g），cc表示吸附平衡時底物在溶液中的濃度（μmol/L）]；Kd體現(xiàn)了MIPs對底物的吸附能力（Kd越大，表明MIPs對底物的吸附力能力越強）。α=Kdi/Kdj[式中，i和j分別表示模板分子（PHPAA）和其他底物（PHPA、TA）]；規(guī)定若j=i，α=1；若α<1，表明MIPs對其模板分子沒有選擇性；若α>1，則表明MIPs對模板分子有一定的選擇性[12]。

3 結(jié)果

3.1 掃描電鏡分析結(jié)果

不同MIPs的電鏡圖譜見圖1，不同NIPs的電鏡圖譜見圖2。由圖1可見，MIPs1粒徑較?。?03～243 nm），微球粘連嚴重（圖1A）；MIPs2呈聚集狀，且其球形度較差（圖1B）；MIPs3、MIPs4的球形度較好，微球光滑均勻，且較為分散（圖1C、圖1D），其中MIPs3粒徑為350～810 nm，分布均勻，形狀飽滿（圖1C）。由圖2可見，各NIPs與對應(yīng)MIPs的形態(tài)雖較為相似，但微球球體不規(guī)則、粘連嚴重、粒徑略小。

3.2 紅外光譜分析結(jié)果

由掃描電鏡分析結(jié)果可見，MIPs3微球形態(tài)較好，故對模板分子、MIPs3、NIPs3進行紅外光譜分析，結(jié)果見圖3。由圖3可見，PHPAA在3 264、1 707 cm-1處有強烈的吸收峰，分別來自PHPAA中—OH以及—COOH中C=O的特征吸收峰；在1 607、1 516 cm-1處的吸收峰則可作為其結(jié)構(gòu)中苯環(huán)存在的依據(jù)。MIPs3在2 965 cm-1處的C—H伸縮振動吸收強度較大，由此可推測，模板分子與功能單體1-V發(fā)生了聚合反應(yīng)；在1 737 cm-1處為TRIM中C=O的伸縮振動峰，說明交聯(lián)劑已成功固定在MIPs結(jié)構(gòu)中；同時其紅外光譜顯示，PHPAA的特征吸收峰已消失，表明PHPAA已被完全洗脫。將MIPs3與NIPs3的紅外圖譜進行比對，可見兩者的特征吸收峰大致相同，無明顯變動。

3.3 靜態(tài)吸附試驗結(jié)果

不同MIPs、NIPs的等溫吸附曲線見圖4。由圖4可見，不同功能單體、交聯(lián)劑合成的MIPs的Q均大于對應(yīng)NIPs，且隨著底物PHPAA濃度的增加，MIPs的Q也隨之增加；同時，當?shù)孜餄舛认嗤瑫r，MIPs3的Q大于其他MIPs，表明以1-V為功能單體、TRIM為交聯(lián)劑合成的MIPs3對PHPAA具有較高的特異性吸附性能。

3.4 分子識別性能試驗結(jié)果

由靜態(tài)吸附試驗結(jié)果可知，MIPs3具有最好的吸附性能，且在底物PHPAA濃度為60 μg/mL時，其Q達到13.398 μmol/g，故本研究考察了MIPs3對各底物的分子識別性能，結(jié)果見表2。

由表2可知，MIPs3對PHPAA的Kd為0.14，高于其結(jié)構(gòu)類似物PHPA的0.06和同為酪氨酸代謝產(chǎn)物TA的0.01；同時，MIPs對PHPAA與PHPA、PHPAA與TA的α分別高達2.3、11.5，表明MIPs對PHPAA的吸附具有選擇性。

4 討論

本研究采用沉淀聚合法，在乙腈溶液中，以4-V、AM、1-V、鄰苯二胺為功能單體，EGDMA、TRIM為交聯(lián)劑，于60 ℃水浴中合成MIPs。在前期預試驗中，本課題組對功能單體、交聯(lián)劑的組合方式以及反應(yīng)條件進行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以4-V為功能單體、TRIM為交聯(lián)劑時，得到的聚合物并非為沉淀，故選用EGDMA為交聯(lián)劑；當以1-V、鄰苯二胺為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑時，所得聚合物為絮狀物，且在洗脫過程中溶解，故將交聯(lián)劑替換為TRIM。同時，合成反應(yīng)需在無氧條件下進行，否則無法獲得MIPs。

電鏡掃描結(jié)果顯示，以EGDMA為交聯(lián)劑合成的MIPs（MIPs1、MIPs2）微球粘連嚴重或呈聚集狀；而以TRIM為交聯(lián)劑合成的MIPs（MIPs3、MIPs4）微球則較為分散，且球形度好；其中，以1-V為功能單體的MIPs3微球粒徑適當、分布均勻、形狀飽滿。這可能與PHPAA分子含有1個酚羥基和1個羧基，具有一定的酸性，堿性功能單體更有利于形成穩(wěn)定的模板分子-功能單體復合物有關(guān)。紅外圖譜印證了模板分子與功能單體的聚合反應(yīng)，且作用位點是PHPAA的—OH和—COOH（MIPs、NIPs的紅外圖譜中，上述基團的特征峰消失）。

靜態(tài)吸附性試驗考察了MIPs對不同濃度底物的吸附能力。結(jié)果顯示，MIPs對PHPAA的Q高于NIPs，提示MIPs對底物的吸附不同于NIPs的物理吸附，而是一種具有特異性識別位點的選擇性吸附[13]。除此之外，3種不同功能單體合成的MIPs對模板分子的吸附能力有顯著差異，Q由高到低排序依次為MIPs3>MIPs1>MIPs4>MIPs2，筆者分析原因可能為：（1）PHPAA與1-V之間存在氫鍵和π-π鍵的共同作用，因此具有較好的吸附效果；（2）相比于二元交聯(lián)劑EGDMA，三元交聯(lián)劑TRIM分子結(jié)構(gòu)比前者多1個乙烯基，使得后者的MIPs更易保持結(jié)合位點的剛性，故吸附性能更強。

通過Kd和α對MIPs的分子識別性能進行評價，不僅反映了底物在固定相和流動相中的遷移能力，同時還印證了在干擾底物的存在下，MIPs對PHPAA的分離性能。結(jié)果顯示，以1-V為功能單體合成的MIPs3對各底物的Kd由大到小排序依次為PHPAA>PHPA>TA，PHPAA與PHPA、PHPAA與TA的α均超過1，提示相比于PHPA、TA，MIPs對PHPAA的吸附具有特異性。筆者認為這種特異性識別能力可能與MIPs中留有與底物結(jié)合位點相匹配的空穴有關(guān)。

綜上，以1-V為功能單體、TRIM為交聯(lián)劑合成的MIPs具有特異性吸附性能，可選擇性識別PHPAA分子，可將其作為固相萃取劑，用以分離富集腫瘤患者尿液中低含量的PHPAA，為其早期診斷和治療提供參考。

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（收稿日期：2017-06-05 修回日期：2018-02-23）

（編輯：張元媛）