牛樟芝中一個(gè)新型還原型聚酮合酶基因的克隆及表達(dá)分析

原曉龍 華梅 陳劍 王娟 楊宇明 王毅

摘 要： 為了研究牛樟芝中PKS基因與化合物之間的關(guān)系，該研究通過(guò)對(duì)牛樟芝基因組分析獲得牛樟芝聚酮合酶基因，以此序列為模板設(shè)計(jì)含有起始密碼子和終止密碼子的特異引物并以牛樟芝cDNA為模板克隆獲得一個(gè)高度還原型PKS（HR-PKS）基因全長(zhǎng)，命名為AcPKS2；對(duì)AcPKS2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并比較該基因在不同培養(yǎng)基上的表達(dá)量。結(jié)果表明：AcPKS2全長(zhǎng)7 842 bp，有24個(gè)內(nèi)含子，其外顯子共編碼2 613個(gè)氨基酸，該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為293.5 kDa ，理論等電點(diǎn)pI為5.78。用CDD分析其結(jié)構(gòu)域顯示，該基因?qū)儆贖R-PKS，其結(jié)構(gòu)域組織排列為KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-TE，8個(gè)結(jié)構(gòu)域其活性位點(diǎn)分別為β-酮基合成酶（DTACSSSL）、酰基轉(zhuǎn)移酶（GHSIGETA）、脫水酶（RNDGSTSPL）、甲基轉(zhuǎn)移酶（SFDIITAFDV）、烯酰還原酶（HAGVSSPAA）、酮基還原酶（GSPGQANYTAA）、?；D(zhuǎn)移酶（YGLDSLTSVRL）、硫酯酶（KQPNGPY）。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示AcPKS2與其他化合物未知的HR-PKS蛋白聚為一支，結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示該基因可能編碼一種新的含TE結(jié)構(gòu)域高度還原型聚酮合酶；表達(dá)分析結(jié)果顯示葡萄糖和果糖能夠誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞： 牛樟芝， 高度還原型PKS， 生物信息學(xué)分析， 基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q939.92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-3142（2018）09-1146-09

Abstract： We isolated the polyketide synthase gene with anlyzing the genome of Antrodia camphorata， designed special primers including initial coden and stop coden according to the DNA sequence of this gene. Then， we cloned the full length of a PKS gene using the cDNA of A. camphorata， it is a part of HR-PKS and named as AcPKS2. We used bioinformatic methods to analyze AcPKS2 gene and its proteinic sequence， and compared the expression level of AcPKS2 gene culturing in different media. The results showed that the gene AcPKS2 had 7 842 bp including 24 introns， all the exons encoded 2 613 amino acids； and its relative molecular weight was 293.5 kDa， the theoretical isoelectric point（pI） was 5.78. The result of conserved domain database （CDD） analysis revealed that the organization domain of AcPKS2 was KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-TE， the active sites of eight domains were β-ketosynthase（DTACSSSL）， acyltransferase（GHSIGETA）， dehydratase（RNDGSTSPL）， methyl-transferase（SFDIITAFDV）， enoyl reductase（HAGVSSPAA）， ketoreductase（GSPGQANYTAA）， acyl carier protein（YGLDSLTSVRL）， thioesterase （KQPNGPY）， respectively. Phylogenetic analysis clarified that AcPKS2 and another HR-PKS that their products had not identified clustered together， the domain and phylogenetic tree analysis could anthenticated that AcPKS2 gene encoded a new HR-PKS that includes TE domain. The gene expression analysis showed glucose and fructose could improve the ability of AcPKS2 gene expression.

Key words： Antrodia camphorata， highly reducing polyketide synthase， bioinformatics， gene expression

聚酮化合物（polyketides， PK）是一類(lèi)最重要的次生代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已明晰的結(jié)構(gòu)已超過(guò)7 000種，市場(chǎng)上聚酮類(lèi)藥物已超20種（Cox， 2007； Hertweck， 2009）。聚酮化合物的合成依賴(lài)于聚酮合酶（polyketides synthase， PKS），其催化過(guò)程類(lèi)似于脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）合成脂肪酸，即通過(guò)脂?；?CoA活化底物，并在不同的底物之間不斷重復(fù)脫羧縮合形成數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)豐富的次生代謝產(chǎn)物（Seshime et al， 2005； Shen， 2003），從結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的芳香類(lèi)（如苔色酸、6-methylsalicylic acid等）到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高度還原型聚酮類(lèi)（如T-毒素、洛伐他汀等）（Hideki et al， 2010）。真菌PKS主要屬于Ⅰ型聚酮合酶，根據(jù)其所擁有結(jié)構(gòu)域的不同可將真菌Ⅰ型PKS分為非還原型PKS（Non-reducing PKS）、部分還原型PKS（Partial-reducing PKS）、高度還原型PKS（Highly-reducing PKS）（Kroken et al， 2003； Sato et al， 2017）。像洛伐他?。↙ovastatin）（Ma et al， 2009）、細(xì)胞松弛素（Cytochalasans）（Scherlach et al， 2010）等源自真菌的聚酮類(lèi)化合物的碳骨架主要由高度還原型PKS催化合成的（Liu et al， 2017）。

高度還原型PKS是由功能相對(duì)獨(dú)立的且可重復(fù)使用的不同酶結(jié)構(gòu)域組成的巨型合酶（Khosla et al， 2007），不同的結(jié)構(gòu)域組合方式可產(chǎn)生不同的還原型聚酮類(lèi)化合物（Halo et al， 2008）。如源自土曲霉（Aspergillus terreus）具降膽固醇活性的藥物洛伐他?。∕a et al， 2009）；對(duì)哺乳動(dòng)物鯊烯合酶具潛在抑制效應(yīng)、可有效治療朊病毒感染的神經(jīng)元的聚酮類(lèi)化合物薩拉哥酸A（Zaragozic acid A）[又名角鯊抑素S1（Squalestatin S1）] （Bonsch et al， 2016； Liu et al， 2017）；均屬高度還原型聚酮類(lèi)化合物。HR-PKS除具有β-酮基合成酶（KS）、酰基轉(zhuǎn)移酶（AT）、?；d體蛋白（ACP）這三個(gè)PKS最基本的結(jié)構(gòu)域外，還具有與β-酮加工合成相關(guān)的酮基還原酶（KR）、脫水酶（DH）和烯酰還原酶（ER），將新合成的β-酮基還原成為β-醇、脫水成為α-β不飽和烯?；⑦€原雙鍵成為亞甲基等（Cox， 2007； Hertweck， 2009； Kroken et al， 2003； Sato et al， 2017）。Cox & Simpson（2009）根據(jù)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和催化方式的不同，將HR-PKS分成兩類(lèi)：一類(lèi)為合成大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)如洛伐他??；另一類(lèi)為與NRPS結(jié)合形成肽酯類(lèi)如鐮菌素等。聚酮合酶與化合物之間相關(guān)關(guān)系的研究已有初步進(jìn)展，Cox et al（2004）通過(guò)MT（甲基轉(zhuǎn)移酶）單元保守序列設(shè)計(jì)特異引物克隆得到與他汀類(lèi)藥物角鯊抑素類(lèi)生物合成相關(guān)的PKS基因。為了研究牛樟芝中PKS基因與化合物之間的關(guān)系，本研究在對(duì)其基因組數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，分離并克隆得到牛樟芝中的聚酮合酶基因（AcPKS2）全長(zhǎng)cDNA，采用生物信息學(xué)的方法對(duì)AcPKS2基因進(jìn)行分析，測(cè)定AcPKS2基因在添加了不同碳氮源的培養(yǎng)基上的表達(dá)量，以期為進(jìn)一步研究牛樟芝聚酮合酶基因的異源表達(dá)、AcPKS2基因和具體化合物的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛樟芝菌株由從臺(tái)灣地區(qū)購(gòu)買(mǎi)的段木上的牛樟芝子實(shí)體分離獲得，經(jīng)形態(tài)及ITS鑒定為牛樟芝，菌種編號(hào)為L(zhǎng)KYAC01。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中用麥芽糖酵母提取物培養(yǎng)基（malt yeast extract，美國(guó)BD）進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 牛樟芝AcPKS2基因全長(zhǎng)的克隆 收集于25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)30 d的牛樟芝菌絲體，用植物RNA提取試劑盒（康為世紀(jì)）提取牛樟芝菌絲體總RNA，使用NanoDropTM 2000紫外分光光度計(jì)（美國(guó) Thermo Fisher）測(cè)定RNA的濃度和質(zhì)量，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-80 ℃冰箱。

通過(guò)對(duì)已測(cè)序的牛樟芝基因組數(shù)據(jù)搜索獲得一個(gè)與聚酮化合物生物合成相關(guān)的基因AcPKS2的全長(zhǎng)cDNA序列，利用在線程序GENE Fisher分別設(shè)計(jì)含有起始密碼子（AcPKSF0）和終止密碼子（AcPKSR0）的一對(duì)特異引物（表1）進(jìn)行cDNA克隆。以AcPKSF0和AcPKSR0為引物，利用高保真聚合酶（HiFi-DNA polymerase）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將目的片段與克隆載體連接，篩選得到陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 AcPKS2基因及蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 利用NCBI上的在線程序ORF Finder對(duì)AcPKS2基因進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)，BLAST程序進(jìn)行序列同源性比較，ProtParam進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)（等電點(diǎn)、分子量）分析，用SignalP 4.1 server預(yù)測(cè)信號(hào)肽的有無(wú)，用Target P預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位，用NCBI中的Conversed Domain Database數(shù)據(jù)庫(kù)搜索AcPKS2蛋白的結(jié)構(gòu)功能域。選取與牛樟芝AcPKS蛋白質(zhì)序列同源性較高的其他真菌的PKS蛋白序列一起，用MEGA 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)行Clustal W程序比對(duì)后，采用Neighbor-Joinging 程序構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，1 000次重復(fù)，其他參數(shù)選用默認(rèn)值。生物信息學(xué)所用在線工具及其網(wǎng)址見(jiàn)表2。

1.2.3 牛樟芝AcPKS2基因在不同培養(yǎng)基上的表達(dá)分析 項(xiàng)目組之前的研究表明，不同碳氮源及配方的培養(yǎng)基對(duì)牛樟芝生長(zhǎng)速度有顯著影響（趙能等，2016）。在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，先選取適合牛樟芝菌絲體快速生長(zhǎng)的1-11號(hào)培養(yǎng)基應(yīng)用于AcPKS2基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)，具體配方見(jiàn)表3；再用商業(yè)培養(yǎng)基MEB（麥芽浸粉13 g·L-1）、PDA（馬鈴薯浸粉 5 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1）、WB（麥芽浸粉 15 g·L-1， 麥芽糖12.75 g·L-1）、SA（葡萄糖 20 g·L-1）和TMG（番茄浸粉10 g·L-1， 麥芽糖5 g·L-1， 葡萄糖10 g·L-1）驗(yàn)證其AcPKS2基因的表達(dá)情況。按照所選的培養(yǎng)基配方配置，并接種牛樟芝菌絲體，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 d后，從每種培養(yǎng)基上各獲取0.5 g牛樟芝真菌菌絲體，重復(fù)3次取樣，并依據(jù)真菌RNA提取試劑盒（康為世紀(jì)）的說(shuō)明提取總RNA。牛樟芝總RNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Transgen）說(shuō)明書(shū)合成第一條鏈cDNA，并于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后，以特異引物TacPKS1F、TacPKS1R（表1）檢測(cè)生長(zhǎng)于不同培養(yǎng)基上的牛樟芝AcPKS2基因具體表達(dá)情況，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用圖像分析軟件GENE-SNAPS分析其積分光密度，并進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛樟芝AcPKS2基因全長(zhǎng)的獲得

以牛樟芝真菌菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以AcPKSF0和AcPKSR0為引物，利用高保真聚合酶（HiFi-DNA polymerase）進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法獲得一條長(zhǎng)度約為7.5 kb的片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收、克隆并測(cè)序后獲得7 842 bp的cDNA序列。BLASTP比對(duì)分析顯示該基因的cDNA與密褐褶孔菌（Gloeophyllum trabeum，XM_007871656.1）、根狀索孔菌（Fibroporia radiculosa，XM_012328483.1）、莢果腐病菌（Moniliophthora roreri，XM_007857385.1）等真菌的聚酮合酶DNA序列分別具有70%、72%和73%的一致性，并將該基因命名為AcPKS2。通過(guò)比對(duì)AcPKS2 cDNA和DNA序列，顯示該基因有24個(gè)內(nèi)含子，其外顯子共編碼2 613個(gè)氨基酸。

2.2 AcPKS2蛋白序列的生物信息學(xué)分析

用在線軟件ProtParam預(yù)測(cè)AcPKS2蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為293.5 kDa，理論等電點(diǎn)pI為5.78 ，結(jié)構(gòu)式為C13133H20526N3534O3895S101，不穩(wěn)定系數(shù)為39.66，為穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)91.54，平均親水性值為0.013，親水性較弱；SignalP 4.1 server分析結(jié)果顯示，該蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白；采用Target P在線軟件預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位，存在線粒體的可能性為0.216、分泌途徑為0.050，其他位置為0.788，可靠性為3，結(jié)合SignalP 4.1 server分析結(jié)果，推測(cè)該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的可能性最大。用CDD預(yù)測(cè)該蛋白序列的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白含有KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-TE等結(jié)構(gòu)域 （圖1）。將牛樟芝AcPKS2與其他高度還原型聚酮合酶對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)AcPKS2的8個(gè)結(jié)構(gòu)域其活性位點(diǎn)分別為β-酮基合成酶（DTACSSSL）、酰基轉(zhuǎn)移酶（GHSIGETA）、脫水酶（RNDGSTSPL）、甲基轉(zhuǎn)移酶（SFDIITAFDV）、烯酰還原酶（HAGVSSPAA）、酮基還原酶（GSPGQANYTAA）、?；D(zhuǎn)移酶（YGLDSLTSVRL）、硫酯酶（KQPNGPY）（圖2）。

2.3 AcPKS2蛋白的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6.0中的Clustal W程序?qū)cPKS2蛋白序列和其他真菌的31條Ⅰ型PKS的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)后，用鄰位相接法構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，1 000次重復(fù)，其他參數(shù)選用默認(rèn)值。分析結(jié)果顯示（圖3）：以非還原型PKS作為外接參照組，高度還原型PKS可分為5組，牛樟芝AcPKS2蛋白序列與密褐褶孔菌（Gloeophyllum trabeum， XP_007869847.1 ）、毛韌革菌（Stereum hirsutum， XP_007309121.1 ）和孢莢腐病菌（Moniliophthora roreri， XP_007849738.1 ）聚為一支，合成產(chǎn)物目前不明確。另外Clade Ⅰ分為ⅠA、ⅠB兩個(gè)亞組，ⅠA組的結(jié)構(gòu)域KS-AT-DH-ER-KR-ACP-（ACP），合成T-toxin 母核；ⅠB組結(jié)構(gòu)域?yàn)镵S-AT-DH-MT-ER-KR-ACP，合成單環(huán)類(lèi)毒素母核（如2-吡咯烷酮）。CladeⅡ組的結(jié)構(gòu)域?yàn)镵S-AT-DH-MT-SDR-ER-KR-（AMP-ACP），生成洛伐他汀類(lèi)母核。CladeⅢ的結(jié)構(gòu)域?yàn)镵S-AT-DH-MT-（SDR）-ER-KR-ACP，合成大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)聚酮化合物。Clade Ⅳ的結(jié)構(gòu)域?yàn)镵S-AT-DH-（MT）-ER-KR-ACP，合成伏馬菌素類(lèi)母核。與牛樟芝AcPKS2蛋白序列所在的第Ⅴ組進(jìn)行比較，僅該組存在結(jié)構(gòu)域TE，可推測(cè)其合成產(chǎn)物為一種新的聚酮類(lèi)化合物。

2.4 不同碳氮源添加物對(duì)牛樟芝AcPKS2基因表達(dá)的影響

根據(jù)項(xiàng)目組之前的研究，牛樟芝菌絲體在不同的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度差異較大（趙能等， 2016）。將牛樟芝菌絲體培育在17種不同的培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 d后，提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用特異引物（表1）檢測(cè)其表達(dá)情況。結(jié)果顯示（圖4：A）：在不同碳源添加物的分析試驗(yàn)中，果糖（fru）和葡萄糖（glu）能夠誘導(dǎo)AcPKS2基因的表達(dá)，而在基本培養(yǎng)基（none）、添加甘露糖（man）和乳糖（lac）的培養(yǎng)基上不表達(dá)，其中添加了葡萄糖的培養(yǎng)基上該基因的表達(dá)量最高；在不同氮源添加物的分析試驗(yàn)中（圖4：B），以麥芽糖和葡萄糖作為碳源的前提條件下，不同氮源均可誘導(dǎo)該基因表達(dá)，但其表達(dá)量存在顯著差異，其誘導(dǎo)表達(dá)量從高到低依次為 酵母提取物（MFY2）、土豆蛋白胨（MFS）、牛肉浸粉（MFB）、酪蛋白胨（MFL）、胰蛋白胨（MFY1）、番茄浸粉（MFT）；其中誘導(dǎo)表達(dá)量最高的培養(yǎng)基MFY2與最低的MFT之間相差5倍之多。同時(shí)采用不同的商業(yè)培養(yǎng)基測(cè)試該基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示（圖4：C）：TMG誘導(dǎo)表達(dá)量最高，從高到低依次為YMB、WB、PDA、MEB、SA。

3 討論

牛樟芝（Antrodia camphorata）屬于多孔菌科（Polyporaceae）薄孔菌屬（Antrodia）真菌，是我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)所特有的珍貴食藥兩用真菌（Lu et al， 2014； Wu et al， 2004）。牛樟芝中含有豐富的具生理活性的次生代謝產(chǎn)物，如牛樟芝子實(shí)體中特有的聚酮化合物安卓凱因A （antrocamphin A）（Hsieh et al， 2010； Lee et al， 2011）。依據(jù)牛樟芝基因組測(cè)序結(jié)果，研究者發(fā)現(xiàn)牛樟芝基因組中存在14個(gè)可能為PKS的基因片段，其中有4個(gè)PKS基因編碼的氨基酸數(shù)量超過(guò)了2 000個(gè)（Lu et al， 2014），本項(xiàng)目組通過(guò)對(duì)牛樟芝基因組的分析，獲得1條高度還原型PKS基因AcPKS2基因。尚未有關(guān)于聚酮合酶基因與化合物之間聯(lián)系的報(bào)道，本研究的目的是從牛樟芝基因組中分離聚酮合酶基因，并研究其在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)狀況，最終目的為確定基因與化合物之間的聯(lián)系。

本研究通過(guò)對(duì)AcPKS2基因和其蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)結(jié)構(gòu)域分析獲知AcPKS2蛋白含有HR-PKS特有結(jié)構(gòu)域β-酮基還原酶（KR）和烯酰還原酶（ER），可推斷該基因?qū)儆贖R-PKS；結(jié)構(gòu)域分析顯示AcPKS2蛋白中含有硫酯酶釋放結(jié)構(gòu)域（TE）。TE結(jié)構(gòu)域通常位于C-末端，許多真菌的非還原型聚酮合酶的TE結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)催化環(huán)化反應(yīng)形成大環(huán)內(nèi)酯（Du & Lou， 2010）并釋放聚酮化合物，但目前尚未有TE結(jié)構(gòu)域存在于HR-PKS中的報(bào)道。在非還原型聚酮合酶中，與TE結(jié)構(gòu)域功能類(lèi)似的結(jié)構(gòu)域還有C-末端還原酶釋放結(jié)構(gòu)域（R）（Kroken et al， 2003）、C-末端酯酶/類(lèi)脂肪酶（EST）結(jié)構(gòu)域（Ishiuchi et al， 2012），類(lèi)金屬-β-內(nèi)酰胺酶（MβL）水解酶（Scherlach et al， 2010）等。這些酶結(jié)構(gòu)域的功能已通過(guò)試驗(yàn)得到證明，如Fujii et al（2001）通過(guò)異源過(guò)量表達(dá)wA-PKS基因修飾過(guò)的C-末端首次證明TE結(jié)構(gòu)域參與克萊森環(huán)化反應(yīng)，該結(jié)構(gòu)域又被命名為克萊森式環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域（CLC），參與構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中WA聚酮合酶催化萘并吡喃酮（naphthopyrone）第二個(gè)芳香環(huán)的克萊森式環(huán)化；R結(jié)構(gòu)域催化還原釋放的作用通過(guò)異源表達(dá)得到確認(rèn)（Bailey et al， 2007）；EST結(jié)構(gòu)域略大于TE/CLC結(jié)構(gòu)域，屬絲氨酸水解酶家族（Ishiuchi et al， 2012）；通過(guò)基因敲除的方式證明MβL結(jié)構(gòu)域參與構(gòu)巢曲霉中AptA（asperthecin PKS）聚酮產(chǎn)物的釋放（Szewczyk et al， 2008）。AcPKS2 TE結(jié)構(gòu)域的蛋白序列與密褐褶孔菌（XP_007869847.1）（Floudas et al， 2012）TE結(jié)構(gòu)域的同源性為56.49%，且其保守活性位點(diǎn)均為KQPXGPY。聚類(lèi)分析可將功能相似的基因或蛋白聚為一支，本研究中AcPKS2蛋白與其他3種功能和化合物未知的PKS蛋白聚為一支，可推斷AcPKS2基因是一種含TE結(jié)構(gòu)域的新型HR-PKS。

不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式對(duì)牛樟芝生長(zhǎng)速度和其活性組分均有顯著的影響（趙能等， 2016；周璇等， 2017），同時(shí)同一基因在不同培養(yǎng)條件下，其基因表達(dá)會(huì)出現(xiàn)差異，且可能產(chǎn)生不同的化合物，這一現(xiàn)象可通過(guò)“一菌多產(chǎn)物”（one strain many compounds， OSMAC）來(lái)解釋。Hemphill et al（2017）利用“一菌多產(chǎn)物”策略成功地從內(nèi)生真菌三線鐮刀菌 （Fusarium tricinctum）中獲得5種化合物， 2種新化合物fusarilelin K和fusarilelin L及2種已知化合物fusarilelin A和fusarilelin B，并將化合物fusarilelin J的量增加了80倍。本研究應(yīng)用含不同碳氮源添加物和商業(yè)培養(yǎng)基誘導(dǎo)AcPKS2基因的表達(dá)，不同碳源添加物試驗(yàn)表明葡萄糖和果糖能誘導(dǎo)AcPKS2基因的表達(dá)，不同氮源添加物的試驗(yàn)表明在碳源一致的前提條件下，酵母提取物的表達(dá)量最高，番茄浸粉表達(dá)量最低；不同商業(yè)培養(yǎng)基測(cè)試顯示TMG表達(dá)量最高、SA最低。該結(jié)果說(shuō)明牛樟芝AcPKS2基因在不同培養(yǎng)條件下，其表達(dá)水平具較大的差異，能夠?yàn)橄乱徊酵ㄟ^(guò)大規(guī)模發(fā)酵的方式獲取牛樟芝聚酮化合物提供最佳培養(yǎng)基。本研究結(jié)果有助于牛樟芝聚酮類(lèi)化合物的異源表達(dá)，為提高牛樟芝聚酮化合物的合成效率及基因調(diào)控分析奠定基礎(chǔ)。

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