蜆殼花椒種子萌發(fā)時(shí)期內(nèi)參基因的篩選與驗(yàn)證

孫吉康 王平 賈浩 周韜 吳艷

摘 要： 為了解蜆殼花椒種子萌發(fā)的分子機(jī)制，需要篩選蜆殼花椒種子萌發(fā)時(shí)期表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因。該研究通過(guò)赤霉素處理種子促進(jìn)萌發(fā)，以不同萌發(fā)階段的蜆殼花椒種子為材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了6個(gè)候選內(nèi)參基因GAPDH、ACT、18SrRNA、UBQ5、TUA和CYP在蜆殼花椒種子萌發(fā)時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明：（1）α-淀粉酶基因、DELLA基因和異檸檬酸裂解酶基因分別反應(yīng)了種子萌發(fā)階段糖、激素和脂肪的代謝活動(dòng)，因此選擇蜆殼花椒異檸檬酸裂解酶基因（Unigene0032088）、α-淀粉酶基因（Unigene0033597）和DELLA基因（Unigene0058868）作為驗(yàn)證基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量驗(yàn)證。（2）綜合geNorm、NormFinder和BestKeeper的分析結(jié)果顯示在蜆殼花椒種子萌發(fā)過(guò)程中ACT表達(dá)穩(wěn)定性最好，UBQ5次之。（3）以ACT、UBQ5基因?yàn)閮?nèi)參基因的結(jié)果顯示驗(yàn)證基因的表達(dá)量與種子萌發(fā)生理狀態(tài)一致，初步揭示了GA處理的種子易于萌發(fā)而清水處理的種子在萌發(fā)第3天容易腐敗這一現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因。綜上所述，ACT是蜆殼花椒種子萌發(fā)時(shí)期最合適的內(nèi)參基因，其次是UBQ5。

關(guān)鍵詞： 蜆殼花椒， 種子萌發(fā)， 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR， 內(nèi)參基因， 基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-3142（2018）09-1136-10

Abstract： In order to understand the molecular mechanism of the seed germination， we need to screen the reference genes of stable expression during the seed germination of Zenthoxylum dissitum. The seeds of Z. dissitum were treated with the gibberellins （GA） to promote germination. The samples were collected in 0， 1， 2， 3 and 5 d of germination. The quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was performed to analyze the expression stabilities of six candidates such as Glyceraldehyde-3-phosphate （GAPDH）， Actin （ACT）， 18S ribosomal RNA （18SrRNA）， ubiquitin-40S ribosomal （UBQ5）， α-tubulin （TUA） and cyclophilin （CYP） among the seeds of the different germination stages. The α-amylase gene， DELLA gene and isocitrate lyase gene respectively reflected the metabolic activities of the sugars， hormones and lipids during the germination of Z. dissitum seeds. Therefore， isocitrate lyase （Unigene0032088）， α-amylase （Unigene0033597） and DELLA （Unigene0058868） of Z. dissitum were selected as the validation genes for the relative expression verification during the seed germination. The comprehensive analysis of three softwares including geNorm， NormFinder and BestKeeper indicated that the expression stablility of ACT was the best and the second was UBQ5. The expressions of the validation genes were consistent with the states of seeds germination when ACT and UBQ5 were selected as the reference genes. Besides， when the ACT and UBQ5 genes were selected as the reference genes， the relative expression levels of isocitrate lyase， α-amylase and DELLA of zanthoxylum revealed the possible reasons that the seeds treated with GA were able to germinate successfully but the seeds treated with water easily spoiled in the 3rd day of germination. In conclusion， ACT is the preferred reference gene during the seed germination of Z. dissitum， followed by UBQ5.

Key words： Zanthoxylum dissitum， seed germination， quantitative real-time PCR （qRT-PCR）， reference gene， gene expression

蜆殼花椒（Zanthoxylum dissitum）屬于蕓香科花椒屬木質(zhì)藤本植物，主要生長(zhǎng)于我國(guó)南方海拔500～1 200 m的山地林下、林緣以及灌木叢中，是南方地區(qū)重要的林藥資源。蜆殼花椒種子自然萌發(fā)率極低，目前野生植株采伐數(shù)量超過(guò)自然生長(zhǎng)率，導(dǎo)致野生蜆殼花椒資源受到嚴(yán)重破壞，藥材原料匱乏（馬英姿和王平，2008；程鵬等，2013）。因此開展蜆殼花椒種子萌發(fā)分子機(jī)理的研究有助于促進(jìn)對(duì)蜆殼花椒資源的保護(hù)。

定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)常用于基因表達(dá)水平分析，具有定量準(zhǔn)確、高靈敏度、低成本以及高通量特性。內(nèi)參基因用于標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)錄本的豐度，是決定qRT-PCR結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素（Huggett et al，2005）。理想的內(nèi)參基因不受任何實(shí)驗(yàn)處理的影響并且在不同組織以及不同發(fā)育階段表達(dá)穩(wěn)定（Czechowski et al，2005）。實(shí)際上，影響基因表達(dá)的因素很多，如實(shí)驗(yàn)材料、樣品量、細(xì)胞活性、RNA完整性、cDNA質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率等（Bustin，2002）。相關(guān)研究也證實(shí)使用表達(dá)不穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)@著錯(cuò)估基因表達(dá)量并導(dǎo)致對(duì)數(shù)據(jù)的錯(cuò)誤分析（Ferguson et al，2010；Mafra et al，2012）。基因表達(dá)具有顯著的組織特異性，同時(shí)基因表達(dá)也會(huì)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)組織所處生理狀態(tài)的不同或?qū)嶒?yàn)處理方式的不同而變化。目前，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有基因能作為通用的內(nèi)參基因（Nicot et al，2005；Gutierrez et al，2008；Gimeno et al，2014）。RNA測(cè)序（RNA-seq）廣泛應(yīng)用于各種物種的轉(zhuǎn)錄組分析（Huggett et al，2005；Czechowski et al，2005；Ferguson et al，2010），同時(shí)也用于搜索內(nèi)參基因。Zhuang et al（2015）結(jié)合黃花棘豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)從18SrRNA、actin、tubulin、GAPDH 和 histone H3（HIS）等12個(gè)候選內(nèi)參基因中篩選出HIS 和 actin是黃花棘豆在非生物脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的基因。Li et al（2016）通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)在牡丹花的不同發(fā)育時(shí)期從actin、tubulin、ubiquitin、GAPDH、EF-1α 和 cyclophilin（CYP）等10個(gè)候選參考基因中篩選出GAPDH和ubiquitin在花的不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)穩(wěn)定性最好。然而關(guān)于種子萌發(fā)過(guò)程中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因研究很少，目前僅發(fā)現(xiàn)Li et al（2012）以大豆發(fā)芽種子為材料，篩選出在大豆種子萌發(fā)過(guò)程最適合的內(nèi)參基因是Glyma05g37470和Glyma08g28550。迄今為止，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)蕓香科花椒屬內(nèi)參基因研究的相關(guān)報(bào)道。

基于我們的蜆殼花椒種子萌發(fā)過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并參考相關(guān)文獻(xiàn)，我們選擇6個(gè)常用內(nèi)參基因GAPDH、ACT、18SrRNA、UBQ5、TUA和CYP作為候選內(nèi)參基因。這些候選內(nèi)參基因通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析，采用NormFinder，BestKeeper和geNorm（Andersen et al，2004；Vandesompele et al，2002；Pfaffl，2001）軟件對(duì)多個(gè)候選內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)穩(wěn)定性并進(jìn)行評(píng)價(jià)、排序，并通過(guò)種子萌發(fā)過(guò)程中具有重要功能的異檸檬酸裂解酶基因、α-淀粉酶基因和DELLA基因?yàn)轵?yàn)證基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的驗(yàn)證分析，以確定蜆殼花椒種子萌發(fā)時(shí)期表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為更準(zhǔn)確分析蜆殼花椒種子萌發(fā)過(guò)程中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用蜆殼花椒種子于2016年12月取自張家界地區(qū)采集種子，晾干后置于4 ℃保存。開始萌發(fā)前，將去殼種子浸泡在赤霉素溶液（1% w/v）3.5 h。以無(wú)菌水浸泡的種子作為對(duì)照。在9 cm有機(jī)玻璃培養(yǎng)皿中，將種子置于無(wú)菌雙蒸去離子水浸透的無(wú)菌濾紙上，然后在光照培養(yǎng)箱中（白天溫度18 ℃ 16 h，夜間溫度10 ℃ 8 h，光強(qiáng)103 W·m-2）萌發(fā)。清水浸泡的種子在萌發(fā)第3天通常腐壞，而GA浸泡種子可以繼續(xù)萌發(fā)并且一周后胚根突出種皮0.2～0.5 cm。在GA處理種子萌發(fā)的第0天、第1天、第2天、第3天、第5天取樣作為內(nèi)參基因篩選的樣本（第3天重復(fù)取樣），標(biāo)記為0D、1D、2D、3-1D、3-2D、5D。驗(yàn)證基因的樣本則在萌發(fā)開始的第1天和第2天取樣，得到5個(gè)驗(yàn)證樣本，即C0-萌發(fā)0 d，W1-清水處理后萌發(fā)1 d，W2-清水處理后萌發(fā)2 d，GA1-GA處理后萌發(fā)1 d，GA2-GA處理后萌發(fā)2 d。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 、DNA Marker及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司。引物由北京全式金生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 儀器 智能光照培養(yǎng)箱-GZH-328A，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 蜆殼花椒種子RNA的提取、純化及cDNA合成 將去除種皮的蜆殼花椒種子迅速置于液氮中研磨，使用RNA植物試劑盒（Tiangen Biotech，Beijing，China）提取總RNA?？俁NA的濃度和純度用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)，總RNA的完整性用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。為進(jìn)行qRT-PCR，使用PrimeScriptTM RT試劑盒和gDNA Eraser（TaKaRa Bio Inc.，Dalian，China）按照使用說(shuō)明書配制20 μL的反應(yīng)體系（總RNA 1.5 μg，1 μL dNTP mix（10 mmol·L-1），1 μL隨機(jī)引物（100 μmol·L-1））用于cDNA合成。最后用無(wú)核酸酶的水將cDNA稀釋40倍用于qRT-PCR。

1.3.2 內(nèi)參基因的選擇、引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng) 6個(gè)候選內(nèi)參基因分別是GAPDH，ACT，UBQ5，CYP，TUA和18SrRNA基因（表1）。引物通過(guò)網(wǎng)站IDTdna的primerquest工具設(shè)計(jì)，參數(shù)進(jìn)行如下設(shè)置： GC含量45%～55%，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度100～200個(gè)堿基對(duì)，引物長(zhǎng)度為17～28個(gè)堿基，前導(dǎo)鏈與后隨鏈引物的溶解溫度值相差不超過(guò)5度。熒光定量分析采用大連寶生物工程有限公司的SYBR Premix ExTaqTM II試劑盒。使用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀和96孔板。每個(gè)反應(yīng)為20 μL體系： 4 μL模板cDNA，前導(dǎo)鏈與后隨鏈引物均0.8 μL（10 μmol·L-1），10 μL SYBR Premix Ex TaqTM II，4.4 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件設(shè)定為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.3.3 內(nèi)參基因引物擴(kuò)增效率（E）計(jì)算及特異性鑒定 將種子萌發(fā)0、1、2、3、5 d 5個(gè)樣品的cDNA模板按照相同分量進(jìn)行混合，然后以5倍比例稀釋成4個(gè)梯度，則得到混合的cDNA模板濃度分別是1、1/5、1/25、1/125倍。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。溶解溫度通過(guò)軟件7500 Software v2.3得到。在EXCEL中根據(jù)Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸分析得到斜率（K）和線性相關(guān)系數(shù)（R2）；利用公式E=5-1/K-1，計(jì)算引物的擴(kuò)增效率（E）。引物的擴(kuò)增特異性鑒定則將qRT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳以觀察非特異性擴(kuò)增條帶是否存在。

1.3.4 內(nèi)參基因篩選的數(shù)據(jù)處理與分析 geNorm、

NormFinder和BestKeeper 三個(gè)軟件被用來(lái)評(píng)價(jià)候選內(nèi)參基因在蜆殼花椒種子萌發(fā)時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性。通過(guò)他們的綜合比較分析篩選出表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。在geNorm和NormFinder軟件處理數(shù)據(jù)之前，需要先將Ct值轉(zhuǎn)化成Q值后進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)化公式：Q=ECtmin-Ctsample，E為引物的擴(kuò)增效率，當(dāng)引物擴(kuò)增效率接近100%時(shí)，E值一般為2。Ctsample指的是基因的Ct值，Ctmin指的是基因在所有組織中的最小Ct值。BestKeeper軟件直接輸入Ct值進(jìn)行計(jì)算分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜆殼花椒候選內(nèi)參基因的選擇

以擬南芥中表達(dá)最穩(wěn)定的基因和在qRT-PCR研究中常用的內(nèi)參基因?yàn)閰⒄?，與蜆殼花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLASTX后得到蜆殼花椒同源的候選內(nèi)參基因。表1描述了6個(gè)候選內(nèi)參基因的qRT-PCR引物序列和擴(kuò)增序列特征。候選內(nèi)參基因按照擬南芥同源基因以及蜆殼花椒轉(zhuǎn)錄組Nr注釋命名。

2.2 擴(kuò)增效率和擴(kuò)增特異性

根據(jù)已知的候選內(nèi)參基因序列分析，設(shè)計(jì)溶解溫度值在58～62 ℃之間的特異性引物。以5倍濃度梯度稀釋的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)作6個(gè)候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示各候選內(nèi)參基因的決定系數(shù)R2≥0.969，引物的擴(kuò)增效率在91.99%～104.0%之間，均符合qRT-PCR對(duì)擴(kuò)增效率的要求（表2）。分析溶解曲線發(fā)現(xiàn)各內(nèi)參基因都只產(chǎn)生單一的溶解峰，各重復(fù)樣品間的曲線重復(fù)性好（圖1）。上述結(jié)果說(shuō)明所設(shè)計(jì)引物的特異性良好，qRT-PCR反應(yīng)專一性高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 內(nèi)參基因Ct值分析

Ct值與基因的表達(dá)量成反比關(guān)系，即Ct值越小，表達(dá)量越大。qRT-PCR的結(jié)果表明，6個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值在10～30之間，其中18SrRNA的Ct值最低，在10～14之間；TUA的Ct值較高，在26～30之間；ACT、GAPDH、UBQ5和CYP的Ct值則在22～28之間（表3）。表3結(jié)果表明，18SrRNA在蜆殼花椒種子萌發(fā)早期的不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)豐度最高，其次是CYP、UBQ5、ACT，而TUA的表達(dá)豐度最低。同時(shí)，GAPDH、TUA在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)豐度變異較大?？梢?jiàn)，這些內(nèi)參基因在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)豐度的變化規(guī)律較為復(fù)雜，有必要采用內(nèi)參基因分析軟件對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。

2.4 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

BestKeeper、geNorm和NormFinder軟件常被用于對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中BestKeeper程序直接輸入Ct值進(jìn)行表達(dá)的穩(wěn)定性分析； 而geNorm和NormFinder軟件在處理數(shù)據(jù)前需要先將Ct值轉(zhuǎn)換成相對(duì)表達(dá)量再進(jìn)行穩(wěn)定性分析。我們用這3個(gè)軟件對(duì)GAPDH、ACT、UBQ5、CYP、TUA和18SrRNA候選內(nèi)參基因在蜆殼花椒種子萌發(fā)早期的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.4.1 geNorm分析 geNorm V3.5軟件根據(jù)平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)M值確定在不同條件下表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。M值越大，基因的表達(dá)穩(wěn)定性越低，反之越高。M值小于1.5的候選內(nèi)參基因才被認(rèn)為表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。本研究分析結(jié)果表明，6個(gè)候選內(nèi)參基因中3個(gè)的M值均小于1.5，分別是ACT、UBQ5、18SrRNA，說(shuō)明這3個(gè)候選內(nèi)參基因都較為穩(wěn)定。在3個(gè)候選內(nèi)參基因中，ACT的M值最低，說(shuō)明它的穩(wěn)定性最好。6個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性從高到低依次為ACT >UBQ5>18SrRNA>CYP>GAPDH>TUA（圖2）。另外，M值都偏大，估計(jì)與種子萌發(fā)時(shí)期表達(dá)豐度的變異程度較大有關(guān)。

2.4.2 BestKeeper分析 BestKeeper分析的原理是直接將候選內(nèi)參基因的Ct值用EXCEL軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（s）。一般s值越小，基因的表達(dá)穩(wěn)定性越好。當(dāng)s值>1時(shí)表明該基因表達(dá)不穩(wěn)定。本研究分析結(jié)果（表4）顯示，GAPDH和TUA的s值大于1，其余都小于1；其中ACT的s最小，表明ACT的表達(dá)穩(wěn)定性最好。按照穩(wěn)定性從高到低排序依次為ACT>UBQ5> CYP>18SrRNA>TUA > GAPDH。

2.4.3 NormFinder分析 NormFinder程序依據(jù)相對(duì)表達(dá)量用EXCEL軟件計(jì)算基因的穩(wěn)定值M。M值越低，則該基因越穩(wěn)定。6個(gè)候選內(nèi)參基因的M值如表5所示。表5結(jié)果表明，UBQ5的M值最低，說(shuō)明它是所選內(nèi)參基因中穩(wěn)定性最好的；TUA的M值最高，說(shuō)明它的穩(wěn)定性最差。6個(gè)候選內(nèi)參基因按照穩(wěn)定性從高到低排序依次為UBQ5>ACT>18SrRNA>CYP>GAPDH>TUA。

2.5 內(nèi)參基因的綜合穩(wěn)定性分析

使用BestKeeper、geNorm和NormFinder 3個(gè)軟件對(duì)蜆殼花椒中6個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)綜合分析（表6）。geNorm軟件分析結(jié)果顯示，ACT和UBQ5的M值最低，說(shuō)明它們的穩(wěn)定性較好，6個(gè)候選內(nèi)參基因按照穩(wěn)定性從高到低排序依次為ACT>UBQ5>18SrRNA>CYP>GAPDH>TUA。BestKeeper軟件分析結(jié)果顯示，ACT的s值最低，穩(wěn)定性較好；GAPDH和TUA的s值大于1，穩(wěn)定性最差，6個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序?yàn)锳CT>UBQ5>CYP>18SrRNA>TUA>GAPDH。NormFinder軟件分析結(jié)果顯示，UBQ5的M值最低，說(shuō)明其穩(wěn)定性較好，穩(wěn)定性排序?yàn)閁BQ5>ACT>18SrRNA>CYP>GAPDH>TUA。3個(gè)軟件的分析結(jié)果一致性較好，結(jié)果可靠度高。從綜合分析結(jié)果來(lái)看，ACT、UBQ5和18SrRNA適合作為內(nèi)參基因，但ACT和UBQ5表達(dá)更穩(wěn)定且表達(dá)豐度也適中。因此，優(yōu)先選擇ACT和UBQ5作為內(nèi)參基因。

2.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

以ACT、UBQ5、18SrRNA和GAPDH作為內(nèi)參基因，分析異檸檬酸裂解酶基因Unigene0032088、α-淀粉酶基因Unigene0033597、DELLA基因Unigene0058868在種子萌發(fā)初始階段的相對(duì)表達(dá)量，以研究不同內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。3個(gè)驗(yàn)證基因分別是與種子萌發(fā)時(shí)期糖代謝、脂代謝、激素密切相關(guān)的重要基因，能夠較好地反應(yīng)種子萌發(fā)時(shí)期的生理狀態(tài)。

圖3結(jié)果表明，以ACT、UBQ5、18SrRNA為內(nèi)參基因時(shí)3個(gè)驗(yàn)證基因在各樣本中的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，而且在GA處理種子萌發(fā)的第1天、第2天都活躍表達(dá)，這與種子萌發(fā)的生理過(guò)程相一致。以GAPDH為內(nèi)參基因時(shí)驗(yàn)證基因的表達(dá)趨勢(shì)則明顯不同。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)以GAPDH為內(nèi)參基因時(shí)驗(yàn)證基因表達(dá)量在GA種子萌發(fā)的第1天、第2天普遍偏小，反而在第0天高表達(dá)，這顯然與GA種子萌發(fā)趨勢(shì)不一致，而且表3也顯示GAPDH的表達(dá)趨勢(shì)是在萌發(fā)的第0天、第1天、第2天表達(dá)量明顯增大，因此當(dāng)以GAPDH為內(nèi)參基因時(shí)驗(yàn)證基因在第1天、第2天的相對(duì)表達(dá)量會(huì)明顯偏小。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶。在種子萌發(fā)早期， 外源GA促進(jìn)α-淀粉酶表達(dá)以加強(qiáng)對(duì)糖的分解利用，可見(jiàn)GAPDH表達(dá)量并不穩(wěn)定，因此GAPDH不適合為內(nèi)參基因。綜上所述，在用qRT-PCR分析基因表達(dá)時(shí)，選擇不恰當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因?qū)⒖赡軐?dǎo)致錯(cuò)估目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量，由此可見(jiàn)內(nèi)參基因選擇的重要性。

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的植物生理發(fā)育過(guò)程，其中許多植物激素在種子萌發(fā)過(guò)程中具有重要作用：如赤霉素GA、油菜素內(nèi)脂BR促進(jìn)種子萌發(fā)，而脫落酸ABA、茉莉酸JA抑制萌發(fā)，但可以增強(qiáng)植物抗氧化和抗微生物感染能力。GA是促進(jìn)種子萌發(fā)的激素，在谷物種子萌發(fā)早期GA誘導(dǎo)糊粉層中的α-淀粉酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)（Ye et al，2011）。DELLA蛋白抑制GA信號(hào)傳導(dǎo)通路（徐恒恒等，2014），并負(fù)調(diào)節(jié)BR信號(hào)途徑（Iliev et al，2002），同時(shí)促進(jìn)JA信號(hào)通路應(yīng)答基因表達(dá)（Aleman et al，2016）。由此可見(jiàn)，DELLA 蛋白是多種激素間相互作用的關(guān)鍵調(diào)控因子。蜆殼花椒種子富含油脂，油脂在種子萌發(fā)過(guò)程中可以提供碳源與能量。種子油脂一般先分解為脂肪酸，并經(jīng)過(guò)β-氧化途徑轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A，然后通過(guò)乙醛酸循環(huán)生成糖加以利用。異檸檬酸裂解酶是乙醛酸循環(huán)途徑關(guān)鍵酶，通過(guò)對(duì)異檸檬酸裂解酶的表達(dá)情況可以了解種子萌發(fā)過(guò)程中油脂動(dòng)員情況。因此，α-淀粉酶基因、DELLA基因和異檸檬酸裂解酶基因可以較好地反映種子萌發(fā)階段糖、激素和脂肪的相關(guān)代謝活動(dòng)。

本研究結(jié)果表明，蜆殼花椒種子萌發(fā)時(shí)期的合適內(nèi)參基因是ACT、UBQ5和18SrRNA。當(dāng)以ACT、UBQ5和18SrRNA為內(nèi)參基因時(shí)，3個(gè)驗(yàn)證基因具有相似的相對(duì)表達(dá)量，且在清水處理種子萌發(fā)第2天表達(dá)量都極低，表明此時(shí)種子糖、脂、激素相關(guān)代謝活動(dòng)幾乎處于停滯狀態(tài)，顯示清水處理種子的萌發(fā)過(guò)程在萌發(fā)第2天被中斷。這一現(xiàn)象可能與清水處理種子在第3天容易腐壞有關(guān)?？紤]到18SrRNA表達(dá)豐度遠(yuǎn)高于大多數(shù)基因，因此ACT是蜆殼花椒種子萌發(fā)時(shí)期最合適的內(nèi)參基因，其次是UBQ5。

本研究中，當(dāng)以ACT、UBQ5為內(nèi)參基因時(shí)，異檸檬酸裂解酶基因的表達(dá)量在GA處理的種子萌發(fā)第2天具有極大提高，表明在GA處理的種子萌發(fā)第2天乙醛酸循環(huán)旺盛，此時(shí)種子油脂的動(dòng)員也非?；钴S。α-淀粉酶基因在GA處理種子萌發(fā)第1天、第2天均有高表達(dá)，同時(shí)清水種子在萌發(fā)第1天也有一定程度的表達(dá)，表明無(wú)論是GA處理種子或是清水種子，在萌發(fā)早期糖代謝都較為活躍。DELLA基因在GA處理種子萌發(fā)的第1天高表達(dá)，但是在第2天顯著下調(diào)，表明DELLA對(duì)于GA信號(hào)通路的抑制作用減弱，有利于誘導(dǎo)谷物種子的糊粉層中α-淀粉酶的轉(zhuǎn)錄和種子萌發(fā)?？梢?jiàn)，以ACT、UBQ5為內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量分析初步揭示了GA處理的種子易于萌發(fā)而清水處理的種子在萌發(fā)第3天容易腐敗這一現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因。

總之，本研究以不同萌發(fā)階段的蜆殼花椒種子為材料，分析了6個(gè)候選內(nèi)參基因GAPDH、ACT、18SrRNA、UBQ5、TUA和CYP在蜆殼花椒種子萌發(fā)時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性。綜合geNorm、NormFinder和BestKeeper的分析結(jié)果并結(jié)合基因的相對(duì)表達(dá)量分析驗(yàn)證，結(jié)果表明蜆殼花椒種子萌發(fā)時(shí)期最合適的內(nèi)參基因是ACT，其次是UBQ5。這個(gè)結(jié)果為蜆殼花椒種子萌發(fā)過(guò)程中的熒光定量PCR分析提供了詳盡的內(nèi)參基因參考。

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