心氣陰兩虛證心力衰竭大鼠血漿代謝組學(xué)研究

鐘森杰　李欣春　李杰　胡志?！『喚S雄　周瑤　姚濤　楊夢

〔摘要〕 目的 研究心氣陰兩虛證心力衰竭大鼠血漿代謝組學(xué)特征。方法 將Dahl鹽敏感性大鼠分為模型組和正常組，通過高鹽飼料喂養(yǎng)模型組大鼠的方法制造心衰模型，于成模后采集模型組（7只）和正常組（8只）大鼠的血漿樣本，運用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)及多元統(tǒng)計分析進行模式識別和差異代謝物的篩選。結(jié)果 主成分分析和偏最小二乘判別分析后得到的得分圖顯示兩組血漿樣本的代謝成分積分點完全分離，表明兩組大鼠的代謝模式存在明顯差異，正交-偏最小二乘判別分析發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組蘇糖酸、半胱氨酸、鳥氨酸、丙氨酸、4-羥基-脯氨酸、蘇氨酸、甲基半胱氨酸、天冬酰胺、花生四烯酸、膽固醇、蘇糖醇、丙酮酸、焦谷氨酸濃度上升；色氨酸、亮氨酸、木糖醇、核糖醇、丙二酸、尿素濃度下降。結(jié)論 心氣陰兩虛證心衰大鼠模型血漿代謝組學(xué)出現(xiàn)變化，差異代謝物與氨基酸代謝、脂代謝、糖代謝紊亂和肝功能異常相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 心力衰竭；心氣陰兩虛證；代謝組學(xué)

〔中圖分類號〕R541；R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.003

〔Abstract〕 Objective To investigate the features of plasma metabonomics in rats with heart failure with heart-Qi Yin deficiency syndrome. Methods Dahl salt-sensitive rats were divided into model group and normal group. The rats in the model group were given high-salt fodder to establish a model of heart failure. After modeling， plasma samples were collected from 7 rats in the model group and 8 in the normal group， and gas chromatography-mass spectroscopy and a multivariate statistical analysis were performed for analysis. Results The score chart obtained by principal component analysis and partial least squares-discriminant analysis showed that the integral point of metabolic components was completely separated between the two groups， indicating that there was a significant difference in metabolic pattern between the two groups. The orthogonal partial least squares-discriminant analysis of the variables with between-group differences showed that compared with the normal group， the model group had significant increases in the concentrations of threonic acid， cysteine， ornithine， alanine， 4-hydroxy-proline， threonine， methyl cysteine， asparagine， arachidonic acid， cholesterol， D-threitol， pyruvic acid， and pyroglutamic acid and significant reductions in the concentrations of tryptophan， leucine， xylitol， ribitol， malonic acid， and carbamide. Conclusion There are changes in the plasma metabonomics of rats with heart failure， and differential metabolites are associated with disorders of amino acid metabolism， lipid metabolism， and glucose metabolism and abnormal liver function.

〔Keywords〕 heart failure； heart-Qi Yin deficiency syndrome； metabonomics

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后新興的研究方法，通過現(xiàn)代分析技術(shù)（液相色譜-質(zhì)譜、氣相色譜-質(zhì)譜、核磁共振等）定量測定生物體中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，結(jié)合模式識別等化學(xué)信息學(xué)技術(shù)考察生物體在不同狀態(tài)下代謝產(chǎn)物的變化，從而尋找代謝物與病理生理之間的聯(lián)系[1]，其具有整體性和系統(tǒng)性的特點，與中醫(yī)學(xué)的整體觀念相契合，因此可作為中醫(yī)證候研究的出發(fā)點和切入點[2]。本研究運用基于氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù)對心氣陰兩虛證心衰大鼠的血漿代謝物進行研究，探討其代謝組學(xué)變化規(guī)律，進一步揭示證候的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為心衰的診斷、辨證和治療提供新思路。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性SPF級Dahl鹽敏感性大鼠15只，體質(zhì)量（220±10）g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證編號：11400700134072，分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級實驗室內(nèi)。

1.2 主要試劑

甲醇（上海沃凱公司）；2-氯苯丙氨酸（美國Aladdin公司）、十七碳酸（美國Aladdin公司）；甲氧基胺鹽酸鹽、吡啶、BSTFA衍生化試劑（日本TCI公司）。

1.3 主要儀器

7890A型氣相色譜儀、5975C型質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；超低溫冰箱Forma 900series（美國Thermo公司）；H1650-W型冷凍離心機、53050型真空濃縮儀（德國Eppendorf公司）；DHG-9240型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒公司）；KW-100TDV型超聲波清洗器（昆山舒美公司）。

2 方法

2.1 模型制備

本課題組通過8%NaCl高鹽飼料喂養(yǎng)Dahl鹽敏感性大鼠20周，建立高血壓心衰大鼠模型；同時以0.3%NaCl低鹽飼料喂養(yǎng)Dahl鹽敏感性大鼠作為正常大鼠模型。本次實驗選取前期制備的高血壓心衰大鼠（7只）和正常大鼠（8只），進行血漿代謝組學(xué)研究[3]。

2.2 心氣陰兩虛證模型評價

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)參麥注射液對高血壓心衰大鼠的治療效果顯著，而參附注射液對高血壓心衰大鼠無治療效果，基于“以方測證”理論驗證了高血壓心衰大鼠所屬證型為心氣陰兩虛證[4]。

本次研究觀察了模型大鼠的體征及行為情況，參考中國中西醫(yī)結(jié)合虛證與老年病研究專業(yè)委員會于1986年修訂的《中醫(yī)虛證辨證參考標準》，通過以下表現(xiàn)情況進行評價：心率增快反映心悸癥狀，呼吸急促反映氣短癥狀，精神萎靡、蜷縮懶動反映神疲乏力、少氣懶言癥狀，抓起反抗劇烈反映煩躁易怒癥狀。發(fā)現(xiàn)該模型大鼠能較好地反映心氣陰兩虛證的相關(guān)證候特點，與“以方測證”結(jié)果相符合，認為該模型能作為心氣陰兩虛證動物模型進行研究。

2.3 血漿樣本采集與處理

兩組大鼠血漿采集前12 h禁食不禁水，以4 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，隨后進行腹主動脈取血，采血完畢后常溫靜置20 min，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃保存。

實驗前預(yù)處理：（1）在每個血漿樣本中加入60 μL的2-氯苯丙氨酸以及60 μL十七碳酸作為內(nèi)標，渦旋振蕩30 s；（2）放入超聲波機室溫處理30 min，冰上放置30 min；（3）4 ℃14 000 r/min離心10 min，取上清液1 200 μL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，用真空離心濃縮儀濃縮；（4）加入60 μL甲氧基溶液渦旋振蕩30 s，37 ℃條件下反應(yīng)2 h；（5）加入60 μL BSTFA衍生化試劑（含1%三甲基氯硅烷），37 ℃條件下反應(yīng)90 min，4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清液加入檢測瓶中，進行GC-MS上機分析。

2.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

通過Agilent MSD ChemStation工作站將GC-MS分析得到的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成netCDF格式（xcms輸入文件格式），運用R（v3.1.3）的XCMS程序包進行峰識別、過濾和對齊，得到包括質(zhì)核比、保留時間和峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣。隨后結(jié)合色譜-質(zhì)譜自動處理與鑒定系統(tǒng)（AMDIS）程序進行代謝物的注釋，將注釋到的代謝物進行分類，分別為氨基酸、糖類、核苷酸、有機酸、脂肪酸、磷酸、胺類、多元醇以及其他等九大類，所用數(shù)據(jù)庫為Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

運用SIMCA-P（v13.0）軟件包對所得數(shù)據(jù)進行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA），以得分圖的形式顯示結(jié)果。隨后進行正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），選取OPLS-DA模型第一主成分VIP值>1的代謝物作為對分類有重要貢獻的變量，結(jié)合單因素方差分析結(jié)果尋找差異代謝物。

3 結(jié)果

3.1 GC-MS分析結(jié)果

GC-MS分析后，得到兩組樣本的代表性總離子流色譜圖（TIC），見圖1。結(jié)合Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫選擇出匹配度較好的化合物共85種，其中氨基酸類24種、有機酸類24種、多元醇類9種、脂肪酸類6種、糖類6種、磷酸類2種、胺類2種和其他類別12種。

3.2 模式識別分析結(jié)果

PCA得分圖可以觀察樣本的聚集、離散程度，樣本點越遠離，說明這些樣本中所含代謝物的組成和濃度差異越大；PLS-DA得分圖可直觀地展示模型的分類效果，兩組樣本的分離程度越大，說明分類效果越顯著。如圖2所示，PCA得分圖顯示樣本點基本都處于橢圓形散點圖（95%置信區(qū)間）內(nèi)，模型組和正常組的樣本點在空間分布上明顯分開，無交叉和重疊；PLS-DA得分圖顯示樣本點基本都處于橢圓形散點圖內(nèi)，模型組和正常組之間沿t1軸線方向分離，分離程度較好，無交叉和重疊。上述結(jié)果表明模型組大鼠和正常組大鼠的代謝模式存在明顯差異，所用方法能準確區(qū)分兩組大鼠。

3.3 差異代謝物篩選結(jié)果

根據(jù)OPLS-DA模型第一主成分變量重要性值（VIP）結(jié)果，并結(jié)合單因素方差分析的P值，以VIP值>1且P<0.05為條件來篩選具有表達差異的代謝物，最終得到19種組間差異代謝物。與正常組比較，模型組蘇糖酸、半胱氨酸、鳥氨酸、丙氨酸、4-羥基-脯氨酸、蘇氨酸、甲基半胱氨酸、天冬酰胺、花生四烯酸、膽固醇、蘇糖醇、丙酮酸、焦谷氨酸濃度上升；色氨酸、亮氨酸、木糖醇、核糖醇、丙二酸、尿素濃度下降。見表1。

4 討論

心衰的病理生理過程十分復(fù)雜，現(xiàn)有的治療方法依然難以控制疾病的發(fā)展[5]。代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為從代謝角度揭示心衰病理生理學(xué)過程的動態(tài)變化及它們所包含的生物學(xué)意義提供了新的方法，同時它所采用的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)可以克服傳統(tǒng)中醫(yī)四診方法的局限，為從生物代謝的角度研究中醫(yī)證候的現(xiàn)代內(nèi)涵提供可靠依據(jù)，是中醫(yī)“證”本質(zhì)研究方法的拓展和深化[6]。

已鑒定的差異代謝物中，氨基酸類占比重最大。其中色氨酸、亮氨酸和蘇氨酸屬于必需氨基酸，必需氨基酸是合成蛋白質(zhì)的重要原料，機體內(nèi)不能合成，必須從食物中攝取。正常情況下心臟代謝最主要的能源來源于游離脂肪酸、葡萄糖的氧化，而氨基酸供能甚少，氨基酸的代謝異常提示心衰大鼠的糖、脂有氧代謝功能不足，需要動員外周組織氨基酸代謝加強供能[7]。

與糖類代謝紊亂相關(guān)的代謝物有丙氨酸、丙酮酸、蘇糖醇、木糖醇和核糖醇。丙氨酸可通過糖異生途徑轉(zhuǎn)化成葡萄糖，其水平上升提示丙氨酸-丙酮酸-葡萄糖循環(huán)的紊亂，機體氧化功能障礙進一步加重[8]。丙酮酸水平上升提示糖酵解途徑異常，心衰時機體缺氧，糖的有氧氧化功能下降，糖酵解增強以供給能量。蘇糖醇與果糖、甘露糖代謝相關(guān)，木糖醇、核糖醇與葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換途徑相關(guān)，上述3種多元醇類代謝物異常也提示了機體的糖代謝紊亂存在。

與脂類代謝紊亂相關(guān)的代謝物有花生四烯酸和膽固醇。膽固醇屬于類固醇化合物，是血脂的重要組成部分，能與脂肪酸結(jié)合成酯；花生四烯酸屬于不飽和脂肪酸，在血液、肝臟和其他器官系統(tǒng)中作為磷脂結(jié)合的結(jié)構(gòu)脂類起重要作用，對脂質(zhì)蛋白的代謝具有調(diào)節(jié)作用，花生四烯酸和膽固醇的水平上升提示心衰大鼠出現(xiàn)脂質(zhì)堆積，引起能量代謝障礙。

氨基酸在體內(nèi)貯存的主要代謝場所為肝臟，肝臟又是合成尿素、脂肪酸和膽固醇的主要器官，氨基酸、脂肪酸、尿素和膽固醇的代謝異常在一定程度上反映了肝功能出現(xiàn)損害。尿素下降提示腎功能可能受損，但本次研究未能在血漿中檢測出肌酐等與腎功能密切相關(guān)的代謝物，是否存在腎功能損害有待進一步研究。

三羧酸循環(huán)作為三大營養(yǎng)素（糖類、脂類、氨基酸類）的最終代謝通路，是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，分布在線粒體內(nèi)。線粒體的形狀、功能與細胞骨架密切相關(guān)，心衰時心肌的損傷可以導(dǎo)致細胞骨架的改變，同時心衰后各種損傷原因均可導(dǎo)致線粒體功能的損傷[9]。既往的心衰代謝組學(xué)研究[10-12]發(fā)現(xiàn)心衰時機體存在三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物或底物代謝紊亂。值得注意的是，本次研究發(fā)現(xiàn)模型大鼠血漿中與三羧酸循環(huán)相關(guān)的檸檬酸、琥珀酸水平均低于正常大鼠，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具體機制有待進一步研究。

中醫(yī)學(xué)認為，心氣陰兩虛證是心衰的常見證型之一，多出現(xiàn)在心衰的早期或中期[13]，本研究采用病證結(jié)合的動物模型，貼近臨床實際，可以很好地模擬人類心衰的病理特點。研究通過PCA得分圖和PLS-DA得分圖證實了心衰大鼠和正常大鼠具有不同的代謝模式，提示心衰大鼠的代謝功能被明顯干擾，其血漿代謝譜中包含更多的病理化信息。通過OPLS-DA對組間差異變量進行分析，鑒定出19種代謝物對分類貢獻較大，可能為該心衰模型的生物標志物；并通過差異代謝物這些關(guān)鍵信息點，明確了與其相關(guān)的代謝途徑，提示該模型的氨基酸代謝、脂代謝、糖代謝紊亂和肝功能受損，這些關(guān)鍵信息區(qū)分了模型大鼠與正常大鼠不同的代謝模式，同時也反映與該病證模型病理生理相對應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生異常后物質(zhì)和功能的改變[14]。鑒于目前還沒有一種代謝組學(xué)技術(shù)能涵蓋生物體內(nèi)所有內(nèi)源性代謝物，單純使用GC-MS技術(shù)可能導(dǎo)致部分關(guān)鍵信息的缺失，課題組計劃在下一步研究中采用核磁波譜儀等技術(shù)從更廣泛的代謝途徑闡釋該病證模型的代謝特點。

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（本文編輯 楊 瑛）