檢測(cè)食品中苯并芘的方法研究

高瑋　鄧智輝

[摘要]苯并芘是一種多環(huán)芳烴類物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的致癌性和間接致畸性、致突變性，廣泛存在于自然界中。本文從國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)苯并芘的研究進(jìn)展進(jìn)行論述，從現(xiàn)有研究可知，2003年開始，有關(guān)研究苯并芘的文獻(xiàn)量增長(zhǎng)迅速，苯并芘的研究熱度明顯上升。在此基礎(chǔ)上，本文就目前比較常用的高效液相色譜-熒光法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法、表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)法，以及對(duì)免疫學(xué)苯并芘檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行分析，免疫學(xué)苯并芘檢測(cè)技術(shù)與目前常用的檢測(cè)方法相比，具有靈敏、特異性強(qiáng)、快速和對(duì)操作人員要求相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，在苯并芘快速檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

[關(guān)鍵詞]苯并芘；食品；檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180812

苯并芘（Benzopyrene，BaP）又稱苯并（a）芘，是由芘和苯稠合而成的一類多環(huán)芳香烴類化合物，主要有1，2-苯并芘、3，4-苯并芘、4，5-苯并芘等，其中3，4-苯并芘較穩(wěn)定，在自然界中分布相當(dāng)廣泛，廣泛存在于水、空氣、土壤、汽車尾氣以及各種煤炭、石油和煤焦油經(jīng)過(guò)燃燒產(chǎn)生的煙氣中，食物工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)采用的包裝材料、高溫烹調(diào)、熏烤和油炸也容易使食品受到污染產(chǎn)生苯并芘。苯并芘的分子式是C₁₂H₂₀，分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，相對(duì)分子質(zhì)量為252.32，沸點(diǎn)為312℃，熔點(diǎn)為179℃，苯并芘的高純度樣品是針狀晶體，顏色介于無(wú)色和淡黃色之間。

苯并芘的相對(duì)密度為苯并芘：水=1.35：1，其在水中的溶解度很小，主要溶于有機(jī)溶劑，在堿性條件下的穩(wěn)定性比較高，而在酸性條件下穩(wěn)定性相對(duì)較低，與氯磺酸和硝酸接觸時(shí)，極易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。在濃鹽酸中呈現(xiàn)橙紅色或者是其他熒光顏色，這些顏色可以用來(lái)檢測(cè)苯并芘的分子結(jié)構(gòu)。苯并芘的同分異構(gòu)體有很多，常見的是3，4-苯并芘、4，5-苯并芘和1，2-苯并芘。4，5-苯并芘和1，2-苯并芘雖然分子式相同，但是在分子結(jié)構(gòu)上存在著明顯的不同；3，4-苯并芘于1993年被人類第一次從瀝青中分離出來(lái)，經(jīng)研究證明，3，4-苯并芘可以使小鼠的皮膚產(chǎn)生癌變，而且由于其具有強(qiáng)致癌性和對(duì)檢測(cè)靈敏度相對(duì)較高的特點(diǎn)，可作為多環(huán)芳烴的指標(biāo)化合物。

苯并芘具有很強(qiáng)的致癌性和間接致畸性、致突變性，是世界衛(wèi)生組織認(rèn)證的三大致癌物之一。苯并芘一般通過(guò)人類日常所用的食物和水進(jìn)入人體進(jìn)而被腸道吸收，通過(guò)人體內(nèi)部的血液循環(huán)遍布身體的各個(gè)組織部位，不斷地積聚在乳房和脂肪組織中，同時(shí)也會(huì)對(duì)人的眼睛和皮膚產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激。人體經(jīng)常接觸此類物質(zhì)容易使胃、肺、肝、膀胱和消化道等發(fā)生癌變，癌變的概率與苯并芘的劑量有相當(dāng)大的關(guān)系，苯并芘的含量越高癌變的發(fā)生率就越高。經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明苯并芘可以通過(guò)母體經(jīng)由胎盤進(jìn)而影響下一代，從而造成胚胎畸形，引起胚胎死亡，而且子代的免疫功能也會(huì)因?yàn)楸讲④诺挠绊懚陆?。其致畸l生和致突變性的概率與投喂時(shí)間有關(guān)，投喂時(shí)間越長(zhǎng)概率會(huì)越大。當(dāng)人體接觸苯并芘時(shí)，并不會(huì)馬上出現(xiàn)不良反應(yīng)，因?yàn)楸讲④啪哂虚L(zhǎng)期性和隱匿性的特性，這使得苯并芘可以在人體內(nèi)積聚，一般隱藏期為10～25年，會(huì)對(duì)子孫后代產(chǎn)生不良的影響，有專家表明其甚至有可能阻礙到人類的發(fā)展。

1苯并芘的研究進(jìn)展

1.1苯并芘研究發(fā)展階段

1998-2017年研究苯并芘的文獻(xiàn)量趨勢(shì)見圖2。2003年以前，我國(guó)對(duì)笨并芘的研究還處于初級(jí)階段，相關(guān)研究的文獻(xiàn)量也相對(duì)較少，1998年僅有1篇相關(guān)文獻(xiàn)，2003年之前的文獻(xiàn)量都沒有超過(guò)10篇。這個(gè)階段主要以苯并芘的致癌性和間接致畸性、致突變性理化性質(zhì)研究為主。2003-2012年，研究進(jìn)入發(fā)展階段，相關(guān)文獻(xiàn)量上升幅度較大，2012年相關(guān)文獻(xiàn)量達(dá)到了58篇。這個(gè)階段從研究苯并芘的理化性質(zhì)發(fā)展到對(duì)苯并芘的檢測(cè)技術(shù)研究以及研究如何降低苯并芘對(duì)人體和環(huán)境的影響。2013年至今，研究進(jìn)入了成熟階段，每年相關(guān)文獻(xiàn)量維持在50篇以上，這個(gè)階段的研究在降低食品中苯并芘含量、苯并芘抗原等方面取得了很大的進(jìn)展。

1.2各階段苯并芘研究情況

1.2.1初級(jí)階段

在初級(jí)階段，學(xué)者主要對(duì)苯并芘的致癌性和間接致畸I生、致突變性進(jìn)行了研究。田河林等對(duì)以煙熏、燒烤和泡腌的食物為主食的地區(qū)胃癌和食道癌的發(fā)病率和死亡率相當(dāng)高的原因進(jìn)行了研究，研究表明，發(fā)病率與死亡率主要與煙熏、腌制食物中含有亞硝酸鹽和苯并芘這兩種致癌物質(zhì)有關(guān)。江艷艷等研究了苯并芘對(duì)人體胎盤絨毛膜上皮細(xì)胞（PCEC）中的CYP1A1酶活性具有誘導(dǎo)作用，CYP1A1可將前致癌物、致突變物氧化成活性產(chǎn)物，后者能與DNA共價(jià)結(jié)合，引起基因突變或影響基因的開放及表達(dá)，從而導(dǎo)致組織突變或癌變。信維平通過(guò)人群調(diào)查和流行病學(xué)的研究，得出苯并芘能夠引起胃癌、皮膚癌、肺癌等疾病的結(jié)論。蔣義國(guó)等以苯并芘代謝物反式二羥環(huán)氧苯并芘（BPDE）多次處理人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，發(fā)現(xiàn)BPDE可誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

1.2.2發(fā)展階段

在發(fā)展階段，更多的學(xué)者參與苯并芘的研究，從苯并芘的致癌性和間接致畸性、致突變性研究，擴(kuò)展到對(duì)苯并芘的檢測(cè)技術(shù)研究以及研究如何降低苯并芘對(duì)人體和環(huán)境的影響。黃勇等研究反式二氫二醇環(huán)氧苯并芘誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化的人體支氣管上皮細(xì)胞及其裸鼠成瘤細(xì)胞中DNA斷裂損傷情況，得出反式BPDE可導(dǎo)致DNA斷裂損傷，其損傷程度與劑量有一定關(guān)系。王亞榮通過(guò)無(wú)機(jī)、有機(jī)介孔復(fù)合材料（C₆H₅-MCM-41）作為固相微萃取的涂層和高效液相色譜聯(lián)用法，測(cè)定水樣中的痕量苯并芘。盛下放等通過(guò)對(duì)高效降解苯并芘的菌株JL14在不同條件下對(duì)苯并芘的降解作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明降解效果顯著。耿淼通過(guò)對(duì)人參提取物EFLA 400對(duì)苯并芘誘導(dǎo)的小鼠肺腺瘤的抑制作用研究，得出人參提取物ELFA 400對(duì)苯并芘造模的小鼠具有化學(xué)防護(hù)和抗誘變作用。王春華采用玻璃纖維濾膜富集、高效液相色譜法分離、熒光檢測(cè)器檢測(cè)，相對(duì)保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量測(cè)定瀝青煙霧中3，4-苯并芘。結(jié)果表明該高效液相色譜測(cè)定瀝青煙霧中3，4-苯并芘方法操作簡(jiǎn)單、富集效率高、分離效果好、準(zhǔn)確可靠，適用于對(duì)瀝青煙霧中3，4-苯并芘進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

1.2.3成熟階段

進(jìn)入成熟階段，學(xué)者的研究方向更趨向?qū)嵱茫诮档褪称分斜讲④藕?、苯并芘抗原等方面進(jìn)行了大量研究。張小濤等采用吸附法對(duì)同時(shí)脫除菜籽油中苯并芘及色澤的工藝條件進(jìn)行研究，在優(yōu)化工藝條件下，菜籽油中苯并芘脫除率達(dá)到96%。譚亮等采用正交試驗(yàn)比較提取溶劑、料液比、提取溫度、超聲時(shí)間對(duì)植物油中苯并芘提取率的影響，結(jié)果表明植物油中苯并芘提取率的影響程度依次為提取溶劑>料液比>超聲時(shí)間>提取溫度，最佳提取工藝為提取溶劑為乙腈、料液比為1：125、提取溫度為50℃、超聲時(shí)間為2.5h。王呂等以苯并芘為起始反應(yīng)物，通過(guò)碘代、Heck偶聯(lián)兩步化學(xué)反應(yīng)合成苯并芘的羰基衍生物，再經(jīng)肟化反應(yīng)將羰基羧基化，采用活化酯法將羧基化半抗原與載體蛋白（牛血清蛋白）進(jìn)行偶聯(lián)，成功構(gòu)建苯并芘的人工抗原。李文娟通過(guò)對(duì)活性炭吸附玉米油中苯并芘的研究，在110℃條件下，加入樣品質(zhì)量0.3‰的活性炭，在磁力攪拌器上攪拌30min后，苯并芘含量為10μg/kg的玉米油樣品去除率能達(dá)到99%以上，結(jié)果表明活性炭去除玉米油中的苯并芘效果明顯。2食品中苯并芘檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.27-2003《食品中苯并（a）芘的測(cè)定》，食品中苯并芘的檢測(cè)方法包括熒光分光光度法和目測(cè)比色法。在GB 5009.27-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯并（a）芘的測(cè)定》中，刪除了熒光分光光度法與目測(cè)比色法的檢測(cè)方法，并對(duì)食品中苯并芘的測(cè)定方法進(jìn)行了規(guī)定。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，食品中苯并芘的檢測(cè)方法也在不斷發(fā)展，目前比較常用的檢測(cè)方法包括高效液相色譜-熒光法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)法。

2.1高效液相色譜-熒光法

高效液相色譜法簡(jiǎn)稱HPLC，20世紀(jì)60年代后期開始發(fā)展，該方法具有相對(duì)比較新穎、精確度較高、重復(fù)性良好、分辨率相對(duì)較高的優(yōu)點(diǎn)。熒光法具有能夠提高檢測(cè)的靈敏度和良好的選擇性等優(yōu)點(diǎn)，可以很好地將同分異構(gòu)體分離，有利于檢測(cè)目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量。因此將兩種檢測(cè)方法結(jié)合在一起，能夠進(jìn)一步提高對(duì)苯并芘檢測(cè)的精度和準(zhǔn)確率。在HPLC檢測(cè)苯并芘的研究方面，李念念等用HPLC對(duì)臘肉中的苯并芘進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明，苯并芘的檢出限和定量限可達(dá)0.15μg/kg和0.5μg/kg。程威威等用HPLC對(duì)芝麻油中的苯并芘進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比，高效液相色譜-熒光法的精確度相對(duì)較高。

2.2氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法簡(jiǎn)稱GC-MS。氣相色譜對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)具有很高的分離能力，而質(zhì)譜具有靈敏性相對(duì)較高和對(duì)未知的物質(zhì)進(jìn)行定性分析的優(yōu)點(diǎn)。氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用能夠揚(yáng)長(zhǎng)避短，使混合物樣品在氣相色譜中進(jìn)行分離后再進(jìn)入質(zhì)譜中，能夠快速簡(jiǎn)便地對(duì)比較復(fù)雜的化合物進(jìn)行分離，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也是對(duì)苯并芘進(jìn)行痕量和微量檢測(cè)分析的重要檢測(cè)方法之一。在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)苯并芘的研究方面，李瑋等用此方法對(duì)奶粉中的苯并芘進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)首先用甲醇-氫氧化鉀對(duì)樣品進(jìn)行皂化，用甲苯進(jìn)行提取，經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾，測(cè)定得出苯并芘的檢測(cè)限是0.3μg/kg。

2.3液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法簡(jiǎn)稱LC-MS，是具有很高的分離能力和定性鑒別能力的技術(shù)，在檢測(cè)時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品的快速、高效分離。在LC-MS檢測(cè)苯并芘的研究方面，劉玉蘭等用此方法對(duì)食用油中苯并芘的含量進(jìn)行檢測(cè)，定量時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)樣品的量進(jìn)行標(biāo)定，對(duì)樣品進(jìn)行分析得出苯并芘的檢測(cè)限為0.2～30μg/L，檢出限是0.1μg/L。該檢測(cè)方法主要適用于樣品的精確檢測(cè)，但是由于費(fèi)時(shí)比較長(zhǎng)，對(duì)檢測(cè)人員的要求比較高，當(dāng)需要對(duì)大批量的樣品進(jìn)行快速檢測(cè)時(shí)，此方法并不適用。

2.4表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)法

表面增強(qiáng)拉曼光譜法簡(jiǎn)稱SERS，是在一些經(jīng)過(guò)特殊處理的金屬良導(dǎo)體表面或溶膠表面的作用下，利用光的拉曼閃射效應(yīng)來(lái)對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行痕量分析的技術(shù)。肖海波檢測(cè)時(shí)以苯膦酸鋯包金的核殼新合成的納米粒子為基底，對(duì)待檢測(cè)的物質(zhì)的苯并芘進(jìn)行捕獲，測(cè)得苯并芘檢測(cè)限為10～8mol/L。表面增強(qiáng)拉曼光譜具有操作簡(jiǎn)便、快速、散射效應(yīng)較強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高和對(duì)樣品無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)。肖旺對(duì)表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)快速檢測(cè)水和食用油中苯并芘的方法進(jìn)行研究，結(jié)果表明表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)具有快速、靈敏度高的特點(diǎn)。王珊對(duì)表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)快速檢測(cè)食用油中苯并芘進(jìn)行了研究，結(jié)果表明與傳統(tǒng)GC-MS或HPLC相比，SERS法可使用便攜式拉曼光譜儀對(duì)苯并芘進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，測(cè)試時(shí)間短，一般為數(shù)十秒至1～2min。但是這種方法目前還不夠成熟，在檢測(cè)過(guò)程中還存在許多問題，如對(duì)樣品進(jìn)行定量分析時(shí)不夠準(zhǔn)確，不同材料同基底之間的吸附性上也存在差異，穩(wěn)定性和重視性控制也比較困難，還有待對(duì)其繼續(xù)研究探索。

3免疫學(xué)苯并芘檢測(cè)技術(shù)

1971年，Engvall等利用抗原和抗體反應(yīng)時(shí)的特異性，將其與酶反應(yīng)的催化性、高效性結(jié)合為一體，從而開創(chuàng)出了酶聯(lián)免疫吸附分析法，并以此為基礎(chǔ)建立免疫學(xué)快速檢測(cè)方法。該方法不但能夠簡(jiǎn)便、快速、靈敏地對(duì)樣品進(jìn)行分析，而且對(duì)儀器和操作人員的要求相對(duì)比較低，不需要昂貴的大型儀器，減少了成本。同時(shí)適用于大批量樣品的檢測(cè)，在檢測(cè)過(guò)程中也不容易出現(xiàn)因?yàn)闄C(jī)器的影響而使結(jié)果產(chǎn)生誤差的現(xiàn)象。但是高脂高蛋白樣品會(huì)存在一定的假陽(yáng)性。

3.1試劑盒法

試劑盒法是利用非競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附法的原理，將制備好的單克隆抗體固定到試劑盒上，利用該試劑盒對(duì)特定樣品進(jìn)行定性和定量快速檢測(cè)的一種方法。邵輝鋒通過(guò)碘代對(duì)苯并芘的分子式進(jìn)行改造，再通過(guò)Heck進(jìn)行偶聯(lián)合成苯并芘的羰基衍生物，制備出苯并芘的人工抗原，并確定苯并芘的線性檢測(cè)范圍。史巧巧等把苯并芘和氨基進(jìn)行偶聯(lián)制成完全抗原，通過(guò)免疫小鼠獲得苯并芘的單克隆抗體。組裝成苯并芘快速檢測(cè)ELISA試劑盒，得出BaP-Kit的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈“S”，與檢測(cè)時(shí)的線性要求相符。Matschulat等制備出苯并芘的單克隆抗體，以此單抗為基礎(chǔ)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附的方法來(lái)檢測(cè)水中苯并芘的含量，其IC₅₀為24μg/L。Pschenitza等利用固相萃取結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附的方法對(duì)食用油中苯并芘的含量進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得檢測(cè)下限為0.63μg/g。

3.2電化學(xué)免疫傳感器

電化學(xué)免疫傳感器是將制備好的單克隆抗體固定在電極表面作為敏感元件，當(dāng)抗原和抗體之間的反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，將此時(shí)的生物反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，通過(guò)電極輸出對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。該技術(shù)靈敏度相對(duì)比較高，對(duì)待測(cè)物質(zhì)具有很高的選擇性，當(dāng)待檢測(cè)樣品數(shù)量很大時(shí)可以采用此方法。費(fèi)世東等把一次性絲網(wǎng)印刷電極作為基底，建立起苯并芘的電化學(xué)傳感器，對(duì)水樣中的苯并芘進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限是0.035μg/L。

3.3金標(biāo)免疫層析技術(shù)

金標(biāo)免疫層析技術(shù)是根據(jù)單克隆抗體技術(shù)建立的一種固相免疫技術(shù)，與酶聯(lián)免疫技術(shù)相似，都是屬于一種快速的檢測(cè)技術(shù)。但是與酶聯(lián)免疫技術(shù)相比，金標(biāo)免疫層析技術(shù)不需要專門的儀器設(shè)備，檢測(cè)所需時(shí)間更短，大約10min即可完成檢測(cè)。而且該試紙卡操作十分簡(jiǎn)便，與其他檢測(cè)方法相比價(jià)格相對(duì)較低，對(duì)待測(cè)物質(zhì)具有較高的靈敏度。劉波等利用該技術(shù)建立起了對(duì)食用油中苯并芘進(jìn)行檢測(cè)的試紙條，檢測(cè)限可達(dá)5～10μg/L，對(duì)食用油中苯并芘的含量具有快速準(zhǔn)確的判定。

4結(jié)論

苯并芘是世界公認(rèn)的致癌物質(zhì)之一，在自然界的分布相當(dāng)廣泛，人類可以通過(guò)各種途徑接觸到苯并芘，如何快速檢測(cè)出食品中的苯并芘并對(duì)其進(jìn)行控制就顯得尤其重要。在未來(lái)的檢測(cè)研究中，化學(xué)檢測(cè)方法并不適用于苯并芘的快速檢測(cè)，但是需要對(duì)樣品進(jìn)行精密檢測(cè)時(shí)采用此方法更為合適；表面增強(qiáng)拉曼光譜法雖然具有快速和對(duì)樣品無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)，但是該方法目前的發(fā)展還不夠成熟，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探索；免疫學(xué)方法由于其靈敏、特異性強(qiáng)、快速和對(duì)操作人員要求相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，在以后苯并芘的快速檢測(cè)中應(yīng)用會(huì)更加廣泛。