固相萃取凈化-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚肉制品中鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素的含量

萬譯文，黃向榮，伍遠(yuǎn)安，肖維，索紋紋

（1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長沙 410153）（2.水產(chǎn)健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000）

鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素均屬于氨基糖苷類抗生素，具有廣譜類抗菌性，此類抗生素的效果好，對(duì)多種革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌具有顯著的抗菌效果，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，常被漁民用來預(yù)防動(dòng)物類疾病或者促進(jìn)動(dòng)物生長[1,2]。食品中抗生素的殘留進(jìn)入人體后有較大的副作用，主要體現(xiàn)在對(duì)人體的腎毒性和耳毒性[3]。各國已經(jīng)禁止在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中違規(guī)添加氨基糖苷類藥物，我國也明確規(guī)定該類抗生素在動(dòng)物源性食品中最高殘留限量[4,5]。2011年衛(wèi)生部在動(dòng)物源性食品殘留物質(zhì)監(jiān)控計(jì)劃中明確規(guī)定在咸魚、臘魚等食品中鏈霉素與雙氫鏈霉素最高殘留限量為10 μg/kg。農(nóng)業(yè)部在 2008年制定國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了河豚魚和鰻魚中鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素的檢出限均為 10 μg/kg（GB/T 22954-2008）[6]。因此，對(duì)于魚肉制品中鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素的殘留檢測(cè)，建立一個(gè)方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確、靈敏度高的方法尤為重要。

目前，針對(duì)鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素殘留的檢測(cè)方法有微生物法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]、液相色譜法[9]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10～12]。近年來，對(duì)不同基質(zhì)中鏈霉素等抗生素殘留的檢測(cè)均采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，由于這類氨基糖苷類抗生素含有糖苷鍵，具有較大的極性，在色譜柱中不易保留，在以往研究中多采用在流動(dòng)相中添加庚烷磺酸鈉、五氟丙酸等離子化試劑進(jìn)行色譜優(yōu)化[13～15]，容易污染質(zhì)譜檢測(cè)器，造成靈敏度降低。在前處理過程中，有文獻(xiàn)采用雙柱固相萃取來對(duì)樣品進(jìn)行凈化，但是該類方法前處理比較復(fù)雜，需要使用大量有機(jī)溶劑，目標(biāo)物的回收率也不太理想。本文采用0.45 μm濾膜快速過濾后經(jīng)C18柱單柱凈化，簡(jiǎn)化了操作步驟，方法簡(jiǎn)單快捷，能滿足對(duì)魚肉制品中鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素殘留的快速檢測(cè)，對(duì)監(jiān)管在漁業(yè)養(yǎng)殖和漁業(yè)加工中非法添加抗生素的實(shí)際工作中提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于99.9%，美國Sigma公司；乙腈、正己烷、甲醇、二氯甲烷（均為色譜純）：德國Merk公司；C18固相萃取柱（60 mg，3 mL）：美國色譜科公司；磷酸、磷酸鈉、冰乙酸、三氯乙酸、庚烷磺酸鈉（分析純）：Alfa Aesar天津化學(xué)有限公司；超純水，美國Milli-Q純水系統(tǒng)制水。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo TSQ Quantum高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司；超聲波清洗器，昆山超聲波儀器廠；氮吹儀，美國Organomation公司；高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司，微型漩渦混合儀，江蘇盛藍(lán)分析儀器廠；固相萃取裝置，美國SUPELCO公司；精密電子天平，梅特勒托利多有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制

分別稱取鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，定容配置成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18 ℃下避光保存。

1.3.2 提取溶液配制

磷酸鹽緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取10.1 g庚烷磺酸鈉、4.1 g磷酸鈉、加入5 mL磷酸，用水定容至1000 mL待用。

10%三氯乙酸溶液：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸50 g，溶于500 mL水中，混勻待用。

1.3.3 樣品前處理方法

取樣品 5.00 g（精確到 0.01 g）置于50 mL 離心管中，加入10 mL 磷酸鹽緩沖溶液，2 mL 10%三氯乙酸溶液，5 mL正己烷，在漩渦混合儀上充分混合后超聲振蕩10 min，平衡后放入離心機(jī)8000 r/min離心10 min，取下層液體過0.45 μm濾膜待用。將上述上清液轉(zhuǎn)移到已活化的C18固相萃取柱中（5 mL甲醇、5 mL水活化），用5 mL水淋洗小柱后抽干。用4 mL甲醇分2次洗脫，洗脫液于40 ℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入1.0 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液（2:8，V/V）溶解殘?jiān)?，?.0 mL正己烷后漩渦混勻1 min，取下層液體過0.22 μm濾膜，供液質(zhì)聯(lián)用儀分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Elution process of the separation

色譜柱：WatersACQUITYUPLC BEH HILIC C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃，流動(dòng)相A：0.1%的甲酸水溶液；B：乙腈；進(jìn)樣量為10 μL；采用梯度洗脫程序見表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：大氣壓電噴霧離子源（ESI），正離子模式；噴霧電壓：3500 V；鞘氣流量：10 L/min；輔助氣流量：1.8 L/min；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM），鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞能量、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 3種化合物的SRM采集參數(shù)Table 2 SRM parameters for 3 drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

氨基糖苷類抗生素極性高，難溶于乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑，易溶于水，在魚肉制品中與蛋白質(zhì)相結(jié)合。因此，采用合適的提取溶劑能水解樣品組織，沉淀蛋白質(zhì)，將目標(biāo)物從組織中提取出來就更為重要。對(duì)于動(dòng)物源性食品中鏈霉素、雙氫鏈霉素等抗生素的提取，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道采用的提取溶劑有磷酸、磷酸鹽緩沖溶液和三氯乙酸等酸性溶液[2～15]。本文比較了這三種不同的提取溶液，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用磷酸溶液時(shí)對(duì)樣品的提取效果不太好，目標(biāo)物的峰形和響應(yīng)強(qiáng)度均不太理想，凈化后溶液較渾濁長時(shí)間使用造成質(zhì)譜噴霧針堵塞。而采用三氯乙酸雖能較好的將魚肉制品中的蛋白質(zhì)沉淀下來，目標(biāo)物的提取效果和回收率均滿足要求，但是采用三氯乙酸提取后，提取溶液的凈化方式較為復(fù)雜，需采用雙柱固相萃取的方式才能達(dá)到較好的凈化效果。

本文采用磷酸鹽緩沖溶液中加入一定量的庚烷磺酸鈉來提取，庚烷磺酸鈉能與目標(biāo)物形成穩(wěn)定的離子對(duì)，增強(qiáng)了在C18固相萃取柱中的吸附能力，提高目標(biāo)物的回收率，同時(shí)加入2 mL的三氯乙酸溶液用來沉淀魚肉制品中的蛋白質(zhì)，正己烷用來溶解魚肉制品中的脂肪和色素等雜質(zhì)，共同降低魚肉制品的基質(zhì)效應(yīng)來減少對(duì)質(zhì)譜造成的污染。

2.2 凈化條件的選擇

圖1 不同固相萃取柱的鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素回收率Fig.1 Recoveries of metabolites of streptomycin,dihydrostreptomycin and kanamycin on different SPE columns

目前對(duì)魚肉制品中常用的凈化方式有使用正己烷去脂、固相萃取以及分散固相萃取等方式。由于市場(chǎng)上代售的咸魚、臘魚等魚肉制品含有大量的脂肪、色素和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，采用加入庚烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖溶液提取后，樣品中很多細(xì)小的顆粒物溶解在提取溶液中，如果直接將提取溶液過柱，過柱非常緩慢甚至造成小柱發(fā)生堵塞。

本文采用0.45 μm濾膜將提取液過濾后再通過固相萃取柱來凈化，不同的固相萃取柱由不同的填料所構(gòu)成，填料的類型決定了吸附能力的大小以及回收率的高低，本文采用實(shí)驗(yàn)室常用的幾種固相萃取柱有HLB、C18、MAX、Alumina-N及Carb/NH2進(jìn)行比較。HLB是一種親水親脂的固相小柱，三個(gè)目標(biāo)物的回收率均在60%以上，鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率大于70%；C18是反相萃取柱，用于凈化非極性或極性較低的化合物，鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素的富集效果好，洗脫后回收率符合要求，回收率均大于75%；MAX是陽離子交換固相萃取柱，對(duì)三種目標(biāo)物的富集效率比較差，回收率比較低，目標(biāo)物的平均回收率在60%以下。

Alumina-N為中性氧化鋁固相萃取柱，鏈霉素及卡那霉素的回收率均符合要求，雙氫鏈霉素的回收率偏低。Carb/NH2固相萃取柱，多用于從非極性溶劑中提取弱極性或者中等極性物質(zhì)，三種目標(biāo)物在Carb/NH2柱上不易富集，造成目標(biāo)物的回收率較低。通過這五種固相萃取柱對(duì)鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素的吸附能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)采用 C18柱凈化后的鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素相對(duì)其他固相萃取小柱回收率更好，并且比較穩(wěn)定，見圖1。

2.3 色譜條件的選擇

圖2 鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素的SRM圖Fig.2 SRM of streptomycin, dihydrostreptomycin and kanamycin

鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素含有糖苷鍵、極性強(qiáng)，易溶于水，在常用的C18反相色譜柱中難以保留，目前多采用在流動(dòng)相中添加離子對(duì)試劑來加強(qiáng)待測(cè)物的保留效果[13,14]，但是離子對(duì)試劑會(huì)造成鹽析影響離子化效率，污染質(zhì)譜的離子源且難以去除，使質(zhì)譜的靈敏度降低。

本文選擇HILIC色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行分離，能避免使用離子對(duì)試劑對(duì)質(zhì)譜離子源的污染，氨基糖苷類抗生素易溶于水，而流動(dòng)相中甲酸水是強(qiáng)洗脫劑，乙腈是弱洗脫劑，這種流動(dòng)相組合對(duì)鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素在HILIC色譜柱中有很好的保留和分離能力，同時(shí)本文比較了0.1%與0.2%的甲酸水溶液保留作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用0.1%的甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫時(shí)能使目標(biāo)物的鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素色譜峰峰形尖銳、對(duì)稱性好，色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度高。鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液SRM 色譜圖見圖2。

2.4 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素的結(jié)構(gòu)特征，選擇ESI正離子電離模式對(duì)三種目標(biāo)物混合標(biāo)液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，得到每個(gè)目標(biāo)物的母離子。再選擇豐度最大的二級(jí)碎片離子作為定量離子，豐度次強(qiáng)的碎片離子為定性離子。鏈霉素與雙氫鏈霉素標(biāo)樣中子離子263的豐度值最大，卡那霉素標(biāo)樣中子離子163的豐度值最大，因此選用263和163作為定量離子。在使用液質(zhì)法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，本方法選擇的子離子均符合歐盟657/2002/EC8規(guī)定的識(shí)別點(diǎn)要求。

2.5 線性范圍和測(cè)定低限

由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，導(dǎo)致待測(cè)物發(fā)生離子增強(qiáng)或抑制作用，本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用基質(zhì)加標(biāo)法進(jìn)行，稱取相同基質(zhì)的空白樣品，分別加入不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，制備成含有鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素的質(zhì)量濃度為5.0、10、20、50、100 μg/kg樣品，按樣品前處理方法操作，采用外標(biāo)法定量，以待測(cè)物的質(zhì)量濃度和待測(cè)物峰面積相對(duì)應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程及相關(guān)系數(shù)。用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，通過計(jì)算目標(biāo)物的信噪比（S/N）來確定檢出限（LOD）及定量限（LOQ），見表3。結(jié)果表明，鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在 0.9992～0.9996之間，按照本文建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，這三種有機(jī)磷農(nóng)藥的方法檢出限（LOD）為 2.5 μg/kg，方法的定量限為 5.0 μg/kg。

表3 3種目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 3 compounds

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

采用外標(biāo)法定量，在空白樣品中添加低濃度、中濃度、高濃度三個(gè)添加水平的目標(biāo)化合物（10、50、100 μg/kg），每個(gè)添加水平檢測(cè)3次，每次實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定6次，所得結(jié)果為回收率為77.4%～107.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.16%～7.35%，由結(jié)果可知能滿足有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求[17]，結(jié)果見表4。

表4 3種目標(biāo)物在空白樣品中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recoveries and relative standard deviations of 3 compounds in blank samples (RSDs, n=6)

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本文所建立的方法，對(duì)長沙市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市代售的12份不同品牌的魚肉制品（咸魚、臘魚和魚罐頭等）進(jìn)行了抽樣檢測(cè)，按照本文的前處理方法和儀器條件進(jìn)行了上機(jī)測(cè)定。由結(jié)果可知，雙氫鏈霉素和卡那霉素在樣品中均未檢出，有一份樣品檢出鏈霉素的殘留量達(dá)到 12.5 μg/kg，超出了國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限[6]。

3 結(jié)論

本文建立的魚肉制品中鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素的殘留檢測(cè)方法，準(zhǔn)確度和精密度較好，滿足對(duì)目標(biāo)物的定性和定量的要求，該方法并可為鏈霉素、雙氫鏈霉素及卡那霉素在魚肉制品中的消除規(guī)律及毒理評(píng)價(jià)提供靈敏、準(zhǔn)確的分析手段，對(duì)食品的安全工作提供了有力的保障。