超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂蜜中的內(nèi)源性酚酸和黃酮類物質(zhì)

宿書芳，薛霞，公丕學(xué)，孫珊珊，付冉，張然，劉艷明，祝建華

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南 250101）

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)。蜂蜜中除了含有葡萄糖和果糖等糖類物質(zhì)外，還含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及酚酸、黃酮等生物活性物質(zhì)[1]，使蜂蜜具有抗氧化、抗菌和抗炎等功效，國內(nèi)和國際市場對蜂蜜的需求量也不斷擴(kuò)大。

近年來，受蜂蜜產(chǎn)量、價格及檢測標(biāo)準(zhǔn)滯后等因素的影響，不少商販采用各種摻假手段生產(chǎn)低質(zhì)量蜂蜜，甚至假蜂蜜，以賺取高額利潤。摻假蜂蜜極大損害了蜂農(nóng)、消費(fèi)者和正規(guī)蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)的利益，嚴(yán)重影響了蜂蜜產(chǎn)品的市場秩序和我國蜂蜜的出口貿(mào)易[2]。為提高蜂農(nóng)的生產(chǎn)積極性、維護(hù)蜂蜜市場秩序，促進(jìn)我國蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，建立一套靈敏、高效、準(zhǔn)確的蜂蜜摻假鑒定方法，尤其是蜂蜜中內(nèi)源性成分的分析方法，對蜂蜜的摻偽鑒別具有重要的意義與價值。

酚酸、黃酮類物質(zhì)是一類苯環(huán)上有若干個酚性羥基的化合物，多為植物的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗自由基等廣泛的生理活性[3]。不同種類的蜂蜜，其酚酸類物質(zhì)的含量及種類差別較大[4,5]。常見的酚酸、黃酮的測定方法有高效液相色譜法[5～8]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[9～11]和紫外分光光度法[12]等。孫崇臻等[5]建立了蜂蜜中沒食子酸、咖啡酸等14種多酚的高效液相色譜測定方法。但該方法需要的樣品量較大，前處理凈化過程復(fù)雜，分析時間較長。本研究建立了蜂蜜中咖啡酸、對香豆酸和沒食子酸等18種酚酸、黃酮類物質(zhì)的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，樣品采用 HLB固相萃取柱凈化，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定性定量，僅需13 min，便可完成18種目標(biāo)物的分析，大大縮短了分析時間，非常適合批量樣品的分析與鑒別。利用該方法對實(shí)際蜂蜜樣品進(jìn)行檢測，并將棗花蜜、洋槐蜜、荊條蜜、糖漿及糖漿摻假蜂蜜的測定結(jié)果做了匯總比較，為蜂蜜摻偽鑒別提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸（gallic acid）、咖啡酸(caffeic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、蘆丁(rutin)、槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、芹菜素(apigenin)、原兒茶酸(protocatechuic acid)、二甲氧基肉桂酸(dimethoxycinnamic acid)、染料木素(genistein)、綠原酸(chlorogenic acid)、表兒茶素(epicatechin)、丁香酸(syringic acid)、對香豆酸(p-coumaric acid)、兒茶精(catechinic acid)、楊梅酮(myricetin)均購自美國 sigma公司；甲醇、乙腈（美國Fisher公司，色譜純），其它試劑均為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液除芹菜素外，其它17種化合物均用甲醇溶解，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。芹菜素則在配制過程中，需先加入0.5 mL pH=10的氫氧化鈉溶液，使目標(biāo)物溶解，再用甲醇定容，配制得到1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2 主要儀器設(shè)備

TQS超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國Millipore公司；超聲波清洗器，寧波新芝生物科技有限公司；電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL），美國 waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

天然成熟蜂蜜（棗花蜜、洋槐蜜、荊條蜜各 50批次）均購自當(dāng)?shù)胤滢r(nóng)，并于4 ℃冰箱中保存。市售洋槐蜜購自當(dāng)?shù)卮笮统?。高果淀粉糖漿由保齡寶生物科技有限公司贈送。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 提取

稱取樣品 5 g(精確至 0.01 g)，加入 15 mL 0.01 mol/L鹽酸水溶液，渦旋使樣品充分溶解，超聲30 min，待凈化。

1.3.2.2 凈化

將樣品處理液轉(zhuǎn)移至事先經(jīng)5 mL甲醇，10 mL 0.01 mol/L HCl活化的HLB固相萃取小柱，待樣品全部滴盡，用5 mL水淋洗，抽干小柱，再用10 mL甲醇洗脫，洗脫液于 35 ℃氮吹至近干，用 1 mL 1+1（體積比）甲醇水溶液復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，待上機(jī)測定。

1.3.3 色譜質(zhì)譜條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3(2.1*100 mm，1.8 μm)；流動相A：乙腈；流動相B：10 mmol/L醋酸銨溶液；流速：0.3 mL/min，梯度洗脫程序：0～1 min，A為5%；1.0～7.0 min，A由5%線性變化至70%，7.1 min，A 為 100%，保持 3 min，10～13 min，以初始比例平衡色譜柱；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

表1 18種目標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)及保留時間Table 1 Mass spectrometric acquisition parameters and the retention time of 18 compounds

電離模式：電噴霧電離，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；錐孔電壓36 V；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：550 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/H；錐孔氣流量：150 L/H；碰撞氣流速：0.15 mL/min。在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，各組分的母離子、子離子及碰撞能等參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取劑的選擇

對于食品中酚酸的測定，文獻(xiàn)[13～15]采用水、乙酸乙酯、丙酮-水等溶液對樣品進(jìn)行提取。本方法若采用乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑提取，提取后需經(jīng)氮吹除去大部分有機(jī)溶劑，才能進(jìn)行下一步的SPE凈化操作，步驟繁瑣；而若直接以水為提取劑，其操作方便，省時且綠色環(huán)保?？紤]到被分析目標(biāo)物多為有機(jī)弱酸，為避免其在中性水溶液中發(fā)生解離，實(shí)驗(yàn)采用 0.01 mol/L鹽酸溶液作為樣品提取劑。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱

被分析組分大多含有酚羥基和羧基，分子的極性較強(qiáng)，在反相C18色譜柱上保留較弱，極易受雜質(zhì)組分的干擾。實(shí)驗(yàn)大多通過降低流動相中有機(jī)相的比例來增強(qiáng)極性組分的保留。但是，流動相中水相的提高，得到穩(wěn)定的霧化所需電壓就更高，在負(fù)離子電離模式下，易導(dǎo)致放電，影響離子源的霧化效率，降低目標(biāo)物靈敏度。因此，僅通過改善流動相的比例并不能達(dá)到較好的分離效果，選擇合適的色譜柱更為關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)比較了 BEH C18，RP Shield C18 和 HSS T3 色譜柱對被分析組分的色譜保留情況，以保留時間最短的沒食子酸為例（表 2），BEH C18 與 RP Shield C18 兩種色譜柱，對極性較強(qiáng)的沒食子酸，基本無保留，保留時間為 0.58～0.60 min；而 HSS T3 色譜柱，其保留機(jī)理主要是基于填料表面的硅羥基與目標(biāo)物之間的氫鍵作用力，使得該色譜柱對極性小分子呈現(xiàn)良好的保留特性，從而減少了部分共流出物對目標(biāo)物的基質(zhì)干擾。而且該色譜柱能耐受高比例的水相流動相，更有利于水溶性極性化合物的保留。綜合考慮，選擇以高強(qiáng)度硅膠為基質(zhì)的HSS T3色譜柱為分析色譜柱。

2.2.2 流動相

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-10 mmol/L的乙酸銨溶液作為流動相的色譜分離效果。結(jié)果表明，以乙腈-10 mmol/L的乙酸銨溶液作為流動相，被分析組分的離子化效率較高，信號較強(qiáng)（見表2），且沒食子酸、綠原酸等弱酸性組分的色譜峰拖尾現(xiàn)象得到有效地改善，提高了方法靈敏度。因此選擇乙腈-10 mmol/L的乙酸銨作為流動相。洗脫模式為梯度洗脫。根據(jù)各組分的保留時間，優(yōu)化流動相洗脫梯度，以減少共流出物對目標(biāo)組分的色譜峰的干擾。優(yōu)化的流動相條件見1.3.3.1。在優(yōu)化的色譜、質(zhì)譜條件下，18種目標(biāo)分析物的MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 18種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 18 mixed analytes standard solution

2.3 SPE 條件的優(yōu)化

蜂蜜成分復(fù)雜，且含有大量的糖類，為保證儀器響應(yīng)靈敏度，有必要將樣品凈化，以減少雜質(zhì)對色譜柱及質(zhì)譜離子源造成污染。根據(jù)待分析化合物的性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)選用C18及HLB固相萃取柱對樣品進(jìn)行凈化處理。通過比較，兩種凈化柱在凈化效果上差異不大，但由于 HLB固相萃取柱采用特殊的聚合物吸附劑，所耐受的pH范圍為pH 0～14，更適合酸性蜂蜜提取液的凈化處理。因此實(shí)驗(yàn)采用 HLB柱為樣品凈化柱。實(shí)驗(yàn)以水作為淋洗液，除掉蜂蜜中的果糖、葡萄糖等糖類物質(zhì)，再用純甲醇將被分析物洗脫，經(jīng)過氮?dú)獯蹈蓾饪s，從而達(dá)到凈化富集的目的。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下，將18種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液依次注入色譜儀，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各化合物的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，18種目標(biāo)物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均不低于0.992。以峰高3倍信噪比處對應(yīng)的濃度，作為方法檢出限，除楊梅酮、木犀草素等4種化合物檢出限大于 100 μg/kg，其它化合物檢出限均低于 50 μg/kg（結(jié)果見表3）。

2.5 添加回收率、精密度

以洋槐蜜為例，由于被分析組分的靈敏度不盡相同，且在洋槐蜜中的本底含量存在差異，所以選取濃度水平500 μg/kg為加入量，并平行測定6次，考察方法回收率和精密度。結(jié)果匯總見表3。

由表 3可知，18種目標(biāo)物回收率范圍為69.2%～94.1%，其中，芹菜素、染料木素等4種化合物的添加回收率不足80%，可能是由于基質(zhì)共流出物抑制了目標(biāo)物的電離，使得實(shí)際到達(dá)四極桿質(zhì)量分析器的目標(biāo)離子數(shù)量，大大低于理論值，回收率下降。從精密度數(shù)值看，各組分的RSD均小于10%，方法重現(xiàn)性較好。

表2 色譜柱及流動相對沒食子酸的保留時間及信號強(qiáng)度的影響Table 2 The relationship of column and mobile phase to the retention time and the signal intensity

表3 18種目標(biāo)物線性方程、檢出限、回收率及精密度Table 3 The linear equations, LODs, spiked recoveries of 18 compounds in blank samples and RSDs (n=6)

2 Gallic acid y=2.14e4x+3.62e3 0.991 2～2000 20 7.3 75.6 3 Chlorogenic acid y=3.58e4x+1.76e3 0.997 2～2000 20 6.7 88.6 4 p-Coumaric acid y=1.17e4x+6.74e2 0.992 5～2000 50 9.5 80.7 5 Caffeic acid y=1.42e4x+6.21e3 0.999 5～2000 50 9.0 84.1 6 Ferulic acid y=5.29e4x+3.70e2 0.998 2～2000 20 6.6 90.6 7 Syringic acid y=3.15e4x+6.52e3 0.991 2～2000 20 2.1 92.3 8 Epicatechin y=7.48e4x+9.47e3 0.995 2～2000 20 0.9 94.1 9 Catechinic acid y=9.85e4x+1.24e2 0.991 2～2000 20 1.5 91.4 10 Myricetin y=1.87e4x-2.17e2 0.993 10～2000 100 7.5 80.5 11 Rutin y=5.62e4x+1.02e4 0.995 2.5～2000 25 3.5 86.8 12 Dimethoxycinnamic acid y=2.96e4x+4.25e2 0.994 5～2000 50 8.0 79.2 13 Genistein y=8.68e3x+2.57e3 0.997 10～2000 100 9.0 76.8 14 Apigenin y=1.48e4x-1.24e2 0.998 5～2000 50 8.1 69.2 15 Naringenin y=1.95e4x+6.57e3 0.991 5～2000 50 4.2 84.5 16 Kaempferol y=8.12e4x+1.2e4 0.994 2～2000 20 5.5 83.7 17 Luteolin y=6.78e3x+2.31e4 0.992 10～2000 100 6.5 79.5 18 Quercetin y=4.24e3x-4.5e4 0.999 20～2000 200 8.7 91.6

表4 不同蜂蜜中酚酸、黃酮類物質(zhì)的平均含量比較Table 4 Comparation of average content results of the phenolic acids and flavonoids compounds in different honey samples

2.6 方法應(yīng)用

利用該方法對150批次天然成熟蜂蜜、市售洋槐 蜜及以不同比例（20%、40%、60%和 80%）糖漿混合的洋槐蜜進(jìn)行檢測，對不同蜂蜜中酚酸及黃酮類物質(zhì)的含量進(jìn)行了匯總整理（詳見表4），根據(jù)測定結(jié)果：

（1）不同蜂蜜中目標(biāo)物的組成及含量存在明顯的差異，這主要與蜜源植物花粉本身有關(guān)。其次，不同蜂蜜廠家的生產(chǎn)工藝的不同也可能會導(dǎo)致樣品中酚酸含量的差異。在檢出的目標(biāo)成分中，阿魏酸在棗花蜜中的平均含量最高，為550 μg/kg；洋槐蜜中平均含量最高的為芹菜素，平均含量為3910 μg/kg；咖啡酸在荊條蜜中平均含量最高，為1721 μg/kg。

（2）糖漿中未檢測到任何的酚酸與黃酮類物質(zhì)，而對于糖漿摻假蜂蜜，隨著糖漿比例的增大，各目標(biāo)組分的含量逐漸降低，市售蜂蜜中目標(biāo)物的含量大多優(yōu)于糖漿摻假蜂蜜。

（3）不同蜂蜜的色譜圖比較（以第2通道為例），如圖2，其中圖(a)、圖(b)分別為真正蜂蜜，色譜圖中呈現(xiàn)的色譜峰個數(shù)較多，而圖(c)和圖(d)，由于不含或僅含少量蜂蜜，其色譜峰信息明顯較少。通過比較各質(zhì)譜圖的差異，可以實(shí)現(xiàn)糖漿及摻假蜂蜜的鑒別。

圖2 實(shí)際樣品（a）棗花蜜；（b）洋槐蜜；（c）糖漿；（d）20%糖漿摻假洋槐蜜測定總離子流圖Fig.2 TIC chromatograms of different honey samples (a) date honey; (b) acacia honey; (c)syrup and (d) 20% molasses adulterated honey

3 結(jié)論

本文針對目前造假蜂蜜中普遍使用糖漿及劣質(zhì)蜂蜜，以及缺乏準(zhǔn)確有效的檢測方法，難以對市場進(jìn)行有效監(jiān)管的問題，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中內(nèi)源性酚酸、黃酮的分析方法。樣品經(jīng)提取溶劑提取，HLB固相萃取柱凈化，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定，可同時完成18種目標(biāo)物的定性定量分析。該方法操作簡單、專屬性好、準(zhǔn)確性高，可用于摻假蜂蜜的快速鑒別檢測。方法的實(shí)施對推動行業(yè)科技進(jìn)步、規(guī)范蜂產(chǎn)品市場、保障消費(fèi)者合法權(quán)益以及促進(jìn)我國蜂產(chǎn)品事業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。