云南普洱茶產(chǎn)地微量元素的指紋溯源

林昕，王麗，蘭珊珊，魏茂瓊，沙凌杰，尹本林，杜麗娟，劉宏程

（農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（昆明），云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南昆明650223）

普洱茶是以云南地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的大葉種曬青茶為原料，并在地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)采用特定的加 工工藝制成，具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉[1]。素以“降血脂、降血糖、減肥”等獨(dú)特功效享譽(yù)海內(nèi)外。但普洱茶市場存在以次充好、以新充舊、假冒名牌和蒙騙顧客等多種問題，嚴(yán)重影響了普洱茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。為了保障普洱茶品質(zhì)，首先還得從普洱茶原料選配上入手，保證不同地域普洱茶原料的可追溯性[2]?！稗r(nóng)產(chǎn)品溯源技術(shù)”[3]是建立于農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)、加工、貯運(yùn)、銷售和消費(fèi)過程的信息記錄和信息追溯體系，即從“農(nóng)田到餐桌”的過程跟蹤或從“餐桌到農(nóng)田”的源頭追溯技術(shù)，主要通過分析表征不同地域來源農(nóng)產(chǎn)品的特異性指標(biāo)，建立起能區(qū)分農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地來源的特征指紋圖譜，從而對不同種類農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)地溯源。目前普洱茶產(chǎn)地溯源技術(shù)主要是利用微量元素含量結(jié)合化學(xué)計量學(xué)工具判別，如呂海鵬等[3]基于8種含量存在顯著差異元素對4個普洱茶產(chǎn)區(qū)的普洱茶進(jìn)行了成功判別；劉宏程等[4]基于普洱茶3個產(chǎn)區(qū)中普洱茶生茶和普洱茶熟茶的稀土含量差異性，對不同產(chǎn)地的普洱生茶和普洱熟茶進(jìn)行了識別；林昕等[5]基于古樹普洱茶和臺地普洱茶中稀土元素含量差異性，成功地區(qū)分了古樹普洱茶和臺地普洱茶，林昕等[6]基于36種微量元素的差異性，成功對三大主產(chǎn)區(qū)的普洱茶進(jìn)行了識別。在上述研究中，都是通過微量元素進(jìn)行溯源分析，缺乏結(jié)合土壤環(huán)境因子對判別模式的進(jìn)一步驗證。因此，本文通過測量不同地域的普洱茶及其茶園土壤中微量元素，為普洱茶的產(chǎn)地溯源、原產(chǎn)地保護(hù)以及判別等提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

普洱茶樣品采集自云南省西雙版納州、普洱市和臨滄市的種植生產(chǎn)一體化企業(yè)，茶葉樣品分為2類，分別是普洱茶生茶（簡稱生茶）和普洱茶熟茶（簡稱熟茶），制茶原料為 2015年春茶，加工時間為 2015年，品質(zhì)為一級?？傆嬈斩铇悠?6個，西雙版納州樣品合計16個（其中普洱生茶10個，普洱熟茶6個）；普洱市樣品合計20個（其中普洱生茶12個，普洱熟茶8個）；臨滄市樣品合計20個（普洱生茶10個，普洱熟茶10個），共計普洱生茶32個，普洱熟茶24個，土壤樣品共采集24個，土壤樣品均來源普洱茶樣品原料的種植茶園。詳細(xì)采樣信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 儀器與試劑

表1 ICP-MS儀器操作條件Table 1 Operating condition of ICP-MS

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀ELAN9000DRC-e型，美國珀金埃爾默儀器公司；含有 Re、Rh、In的混合內(nèi)標(biāo)液（50 μg/mL），含有 Ba、Be、Ce、Co、Li、Mg、Rh、U的調(diào)諧液（10 μg/mL），購于美國珀金埃爾默儀器公司；濃硝酸、高氯酸(優(yōu)級純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2 樣品前處理和檢測方法

茶葉樣品中微量元素和稀土元素的檢測，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30376-2013[7]《茶葉中鐵、錳、銅、鋅、鈣、鎂、鉀、鈉、磷、硫的測定-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法》和國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.94-2012[8]《植物性食品中稀土元素的測定》的要求進(jìn)行樣品前處理及檢測，總計測定了茶葉中 14種微量元素（錳(Mn)、鐵(Fe)、鋅(Zn)、銅(Cu)、鎳(Ni)、鉛(Pb)、鉻(Cr)、鈷(Co)、鋰(Li)、硒(Se)、鎘(Cd)、鉬(Mo)、砷(As)和鈹(Be)）和16種稀土元素（鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、镥(Lu)、鈧(Sc)和釔(Y)）。

茶葉樣品前處理：將樣品粉碎后，精密稱取0.5000 g于50 mL燒杯中，加入高氯酸1 mL和硝酸10 mL，加蓋并浸泡過夜后，在電熱板上于180 ℃消化8 h左右至試液呈無色透明，當(dāng)燒杯內(nèi)開始出現(xiàn)白煙時，取下冷卻，然后加入1 mL硝酸復(fù)溶，用水定容至25 mL，按儀器工作條件進(jìn)行測定。同時做空白試驗和平行試驗。

土壤樣品參考《土壤環(huán)境檢測技術(shù)規(guī)范》(HJ/T 166-2004)[9]，參考辛文峰等人[10]和樂淑葵等人[11]的方法，采用濕法分解：將土壤粉碎后，精確稱取0.1000 g于50 mL燒杯中，加入氫氟酸-高氯酸-硝酸（1:1:10），于電熱板上加熱溶解，轉(zhuǎn)化為待測溶液，采用ICP-MS法分析目標(biāo)元素的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有元素值在統(tǒng)一濃度后(mg/kg)，進(jìn)行均值和標(biāo)準(zhǔn)差分析；為消除元素含量間差異性，需對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理，將數(shù)據(jù)陣中各元素減去該列元素的均值后再除以該列元素的標(biāo)準(zhǔn)偏差，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理的變量(每種元素)權(quán)重相同，均值都為0，方差或標(biāo)準(zhǔn)偏差均為1。

利用方差分析和 Duncan多重比較分析茶葉樣品和土壤中元素在地域間的組成差異；利用相關(guān)分析研究茶葉和土壤中元素的組成關(guān)系；利用Fisher線性判別分析（linear discrimination analysis，LDA）評估元素對茶葉產(chǎn)地溯源鑒別的有效性，并通過交叉驗證法（留一法）對判別模型的可靠性進(jìn)行驗證。上述均通過IBMSPSSModeler14.1軟件實現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)普洱茶微量元素和稀土元素含量差異分析

2.1.1 普洱茶中微量元素含量差異分析

從表2中可知，普洱茶三大產(chǎn)區(qū)（西雙版納、普洱和臨滄）熟茶中14種微量元素含量順序為：Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Pb、Cr、Co、Li、Se、Cd、Mo、As和 Be，統(tǒng)計分析表明：Mn、Fe、Zn、Pb、Co、Cd和As 7種元素含量在不同產(chǎn)區(qū)之間不存在顯著性差異，其他7種微量元素中，Cu、Sr兩種元素在三大普洱茶產(chǎn)區(qū)的熟茶中存在兩兩顯著性差異；Li、Se、Mo和 Be四種元素在西雙版納和普洱產(chǎn)區(qū)不存在差異，而與臨滄產(chǎn)區(qū)存在差異性，Sr、Ni兩種元素在三大普洱茶產(chǎn)區(qū)存在顯著性差異。

普洱茶三大產(chǎn)區(qū)的生茶中 14種微量元素含量順序為：Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Pb、Cr、Co、Li、Se、Cd、Mo、As和Be，統(tǒng)計分析表明：Mn、Fe、Zn、Cu、Cr、Co、Se和Cd 8種元素含量在三大產(chǎn)區(qū)之間不存在顯著性差異；其他7種微量元素中，Sr和Be兩種元素在西雙版納和普洱產(chǎn)區(qū)不存在差異，而與臨滄產(chǎn)區(qū)存在差異性；Li、Mo和As三種元素在臨滄和普洱產(chǎn)區(qū)不存在差異，而與西雙版納存產(chǎn)區(qū)在差異性；Ni和Pb兩種元素在三大普洱茶產(chǎn)區(qū)的生茶中存在兩兩顯著性差異。

2.1.2 普洱茶中稀土元素含量差異分析

從表3中可知，普洱茶三大產(chǎn)區(qū)的熟茶中16種稀土元素含量順序為：Ce、La、Nd、Y、Sc、Pr、Gd、Sm、Dy、Yb、Er、Eu、Tb、Ho、Lu 和Tm；統(tǒng)計分析表明：熟茶中的稀土元素含量在西雙版納和臨滄兩個產(chǎn)區(qū)之間存在顯著性差異（p＞0.05）。而除了 Ce、Er和Sc三種稀土元素在普洱與西雙版納產(chǎn)區(qū)之間顯著差異。在熟茶中稀土元素 Ce含量最高，最低含量的稀土元素是Lu和Tm。

普洱茶三大產(chǎn)區(qū)的生茶中 16種稀土元素含量順序為：Ce、La、Nd、Y、Sc、Pr、Gd、Sm、Dy、Yb、Er、Eu、Tb、Ho、Lu和Tm；統(tǒng)計分析表明：在生茶中輕稀土組元素（La、Ce、Pr、Nd、Sm和Eu）含量在西雙版納和臨滄兩個產(chǎn)區(qū)之間存在顯著性差異（p＞0.05），而西雙版納和普洱兩個產(chǎn)區(qū)之間不存在顯著性差異。

表2 三大產(chǎn)區(qū)普洱茶中微量元素分析Table 2 Content of mineral elements in Pu-erh tea and Sun-dried green tea

表3 三大產(chǎn)區(qū)普洱茶中稀土元素含量分析Table 3 Content of the rare earth elements in Pu-erh tea and Sun-dried green tea

2.2 茶園土壤中的微量元素和稀土元素含量差異分析

從表4中可知，普洱茶園土壤中14種微量元素含量順序為：Fe、Mn、Cr、Zn、Cu、As、Li、Ni、Pb、Co、Be、Mo、Se和Cd。土壤中Fe和Mn元素的高含量，從側(cè)面說明，茶樹是喜歡酸性土壤，因為在酸性土壤能為茶樹提供更高活性的Fe和Mn元素。經(jīng)過統(tǒng)計分析，Cr、Cu、Li、Ni、Co、Be、Mo 和 Cd 八種元素含量在不同產(chǎn)區(qū)之間不存在顯著性差異（p＞0.05），Se元素在三個茶葉產(chǎn)區(qū)的土壤之間存在顯著性差異（p＜0.05），Ni元素在三個茶葉產(chǎn)區(qū)的土壤之間不存在顯著性差異（p＞0.05），F(xiàn)e元素在三個茶葉產(chǎn)區(qū)的土壤中則是兩兩存在差異性，Mn、Zn、As和Pb四個元素在在西雙版納和普洱產(chǎn)區(qū)不存在差異，而與臨滄產(chǎn)區(qū)存在差異性。從表 4中可知，As元素含量為 6.78～29.94 mg/kg，符合《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15618-1995）[12]中一級標(biāo)準(zhǔn)要求（As≤40 mg/kg）；Pb含量為20.68～27.22 mg/kg，符合《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15618-1995）中一級標(biāo)準(zhǔn)要求（Pb≤35 mg/kg）；Cd 含量為 0.07～0.11 mg/kg，符合《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15618-1995）中一級標(biāo)準(zhǔn)要求（Cd≤0.20 mg/kg）；Cr含量為 83.65～104.03 mg/kg，符合《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15618-1995）中二級標(biāo)準(zhǔn)要求（Cr≤90 mg/kg）。從表4中可知，普洱茶園土壤中16種稀土元素含量順序為：Ce、La、Nd、Sc、Y、Pr、Sm、Gd、Dy、Yb、Er、Eu、Tb、Ho、Lu和Tm；經(jīng)過統(tǒng)計分析，Eu和Sc兩個元素在三個茶葉產(chǎn)區(qū)的土壤中則是兩兩存在差異性，其余14個元素則是在在西雙版納和普洱產(chǎn)區(qū)不存在差異，而與臨滄產(chǎn)區(qū)存在差異性。

2.3 普洱茶產(chǎn)地溯源分析

基于普洱茶中微量元素作為普洱茶產(chǎn)地溯源指標(biāo)，構(gòu)建對云南省普洱茶三大產(chǎn)區(qū)（西雙版納、普洱和臨滄）的樣品進(jìn)行產(chǎn)地判別模型，從而構(gòu)建了一個30×54的數(shù)據(jù)矩陣，從而滿足進(jìn)行產(chǎn)地溯源的大數(shù)據(jù)集要求。利用Fisher函數(shù)、交叉檢驗和采取線性判別法進(jìn)行普洱茶三大產(chǎn)區(qū)判別分析，結(jié)果見表5。判別結(jié)果表明：對普洱茶產(chǎn)地的識別率是識別率94.6%，交叉檢驗識別率71.4%。說明：以普洱茶中30種微量元素為產(chǎn)地溯源指標(biāo)，可以構(gòu)建普洱茶產(chǎn)地識別模型，對普洱茶三產(chǎn)區(qū)的茶樣進(jìn)行產(chǎn)地溯源識別，但是由于元素指標(biāo)太多，對普洱茶產(chǎn)地的識別造成了識別信息不集中，所以出現(xiàn)交叉檢驗識別率71.4%，因此，需要從30種微量元素中篩選出適宜作為產(chǎn)地溯源指標(biāo)的特征地域性元素。

表4 三大普洱茶產(chǎn)區(qū)土壤微量元素與稀土元素含量Table 4 Elemental concentrations in soil samples from three regions

2.3.1 普洱茶產(chǎn)地溯源特征元素的篩選

主成分分析(Principal Components Analysis，簡稱PCA)是將多指標(biāo)簡化為少量綜合指標(biāo)的一種統(tǒng)計分析方法，用少數(shù)變量盡可能多的反映原來變量的信息[13]，保證原信息損失小且變量數(shù)目盡可能少。設(shè)X=(X1，X2，…，Xp)′是p維隨機(jī)向量，它的線性變化如下：

PC1=a1′X=a11X1+ a21X2+…+ap1Xp

PC2= a2′X= a12X1+ a22X2+…+ap2Xp

PCp= ap′X= a1pX1+ a2pX2+…+appXp

采用新變量PC1來替代原來p個變量X1，X2，…，Xp，PC1應(yīng)盡可能多的反映原變量信息，如果第一主成分不足以代表原變量的絕大部分信息，考慮引入第二主成分PC2，依次類推。主成分分析的主要目的就是簡化數(shù)據(jù)，因此在實際應(yīng)用中不會取p個主成分，通常選用m（m＜p）個主成分。主成分個數(shù)m要依據(jù)各個主成分累計方差貢獻(xiàn)率來最終判定。

式中：λ為各個主成分對應(yīng)的特征值；k為選定的主成分?jǐn)?shù)；i為全部主成分?jǐn)?shù)。通常累計貢獻(xiàn)率獻(xiàn)率達(dá)到80%～90%時[14]，就可以用主成分代替原始變量做進(jìn)一步的分析。 采用主成分分析對30×54的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行降維處理，選取特征值大于1的成分作為主成分，共提取了6個主成分，總計貢獻(xiàn)率為79.82%，以接近主成分貢獻(xiàn)率80%要求，可以視為達(dá)到了反映普洱茶產(chǎn)地原始數(shù)據(jù)信息的目的。前6個主分成分，PC1貢獻(xiàn)率為50.72%，PC2貢獻(xiàn)率為8.177%，PC3貢獻(xiàn)率為7.11%，PC4貢獻(xiàn)率為5.362%、PC5貢獻(xiàn)率為4.251%和PC6的貢獻(xiàn)率為4.202%。

圖1 第1、2、3主成分得分圖Fig.1 Scatter plot of PC1, PC2 and PC3

以主成分PC1、PC2和PC3得分作3D圖（圖1），可以直觀看出普洱茶三大產(chǎn)區(qū)的普洱茶熟茶和生茶可以被標(biāo)識出。相同產(chǎn)地的普洱熟茶和生茶聚居在一起，這說明可以從微量元素與稀土元素中篩選出用于溯源不同普洱茶產(chǎn)區(qū)的特征元素，用于構(gòu)建普洱茶產(chǎn)地的溯源模型。從表6可以看出，PC1主要由16種稀土元素（La、Ce、Nd、Sc、Y、Pr、Sm、Gd、Dy、Yb、Er、Eu、Tb、Ho、Lu和Tm）和Se元素構(gòu)成，PC2主要由Li和Ni元素構(gòu)成，PC3主要由Zn、Fe、Cu和Mn元素構(gòu)成，共計23種元素可以作為普洱茶產(chǎn)地溯源模型的特征礦質(zhì)元素等待做進(jìn)一步的篩查和分 析。

表5 不同地區(qū)普洱茶樣品識別分析結(jié)果Table 5 Classification with discriminant analsis of Pu-erh tea samples from different regions

表6 普洱茶中元素的特征向量及累計方差貢獻(xiàn)率Table 6 The eigenvenctors and cumulative contribution of Pu-erh tea elements of the principal components

Fe -0.056 -0.293 0.579 0.18 0.064 -0.351 方差貢獻(xiàn)率/% 50.720 8.177 7.110 5.362 4.251 4.202 累計貢獻(xiàn)率/% 50.720 58.897 66.006 71.369 75.620 79.822

2.3.2 普洱茶產(chǎn)地溯源特征元素的逐步判別分析

為了進(jìn)一步了解 23種元素中那些元素可以作為普洱茶產(chǎn)地溯源指標(biāo)。對Sc、Y、La、Ce、Pr、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Nd、Ni、Cu、Zn、Se、Fe、Mn和Li 23種元素進(jìn)行逐步判別分析，篩選出對地域判別有效的變量，剔除不必要的干擾變量，建立判別模型。逐步判別分析（Stepwise Discriminant Analysis，SDA）是數(shù)理統(tǒng)計中一種比較成熟的方法。逐步判別結(jié)果表明：La、Ce、Pr、Sm和Se 5種元素先后被引入到判別模型中，構(gòu)成普洱茶三產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)地判別模型：

Y 西雙版納=-42.43XLa-15.0XCe-50.36XPr-84.76 XSm+84.96XSe-28.95

Y 普洱=-57.46XLa+10.11XCe+94.1XPr-38.13XSm+ 86.98XSe-8.68

Y 臨滄=-48.75XLa+42.12 XCe-37.25 XPr-0.91XSm+ 78.82XSe-18.29

利用此判別模型對樣品分類，并結(jié)合“留一法”對樣品進(jìn)行回代檢驗和交叉檢驗分析，回代檢驗識別率94.6%，交叉檢驗識別率89.3%（表7）。此結(jié)果與基于30種微量元素構(gòu)建的普洱茶產(chǎn)地識別結(jié)果相比較，初始識別率相同，但是交叉檢驗識別率由71.4%提高到了89.3%，表明：可以將La、Ce、Pr、Nd、Sm和Se 5種元素作為普洱茶三大產(chǎn)區(qū)判別指標(biāo)。這一結(jié)果說明：La、Ce、Pr、Nd、Sm和Se 5種元素是區(qū)別不同產(chǎn)地普洱茶的特征元素。

表7 不同地區(qū)普洱茶樣品識別分析結(jié)果Table 7 Classification with discriminant analsis of Pu-erh tea samples from different regions

2.3.3 普洱茶和土壤中同種元素的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步了解La、Ce、Pr、Nd、Sm和Se 5種元素能否是合適作為普洱茶產(chǎn)地溯源模型的特征元素。分別進(jìn)行了對生茶與土壤、熟茶與土壤中元素含量進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果如表8所示。

La、Ce、Pr、Nd、Sm和Se 5種元素都呈現(xiàn)正相關(guān)性，其中Ce元素則呈現(xiàn)了極顯著相關(guān)性（p＜0.01），結(jié)合主成分和逐步判別分析結(jié)果，表明這5種元素都適宜成為普洱茶產(chǎn)地溯源模型的特征元素，說明了土壤中礦質(zhì)元素對普洱茶中礦質(zhì)元素含量的影響，土壤都是茶葉中微量元素的主要來源，采用微量元素作為構(gòu)建普洱茶產(chǎn)地溯源技術(shù)的基礎(chǔ)是可行的。

表8 三大產(chǎn)區(qū)普洱茶與土壤中微量元素含量相關(guān)分析Table 8 Pearson correlation coefficients between teas and soil samples from three regions

注：*表示元素含量在樣品間極顯著相關(guān)（p＜0.05）；**表示元素含量在樣品間極顯著相關(guān)（p＜0.01）。

3 結(jié)論

3.1 植物體內(nèi)的礦物元素與地域土壤中的礦物元素組成密切相關(guān)[15]。土壤中的礦物元素組成受土壤類型、成土母質(zhì)、土壤pH值、氣候以及降水等條件的影響，在不同地域間形成其特定的元素指紋特征。這種特征差異通過“土壤-植物”系統(tǒng)進(jìn)入到植物體內(nèi)，從而造成植物組織中的微量元素的組成差異。但不是所有微量元素都是適宜元素。

3.2 通過對普洱茶三大產(chǎn)區(qū)生熟茶中微量元素和稀土元素含量數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，普洱茶中礦物元素含量在小范圍地域間存在差異。在運(yùn)用Fisher函數(shù)、交叉檢驗的基礎(chǔ)上，采取逐步判別法進(jìn)行判別分析，達(dá)到了在小范圍地域內(nèi)準(zhǔn)確溯源的目的，其初始正確判別率達(dá)到94.6%，交叉檢驗正確識別率為71.4%，說明可以通過普洱茶中的礦質(zhì)元素含量差異對不同產(chǎn)地的普洱茶溯源。

3.3 通過對普洱茶中礦物元素含量的方差分析、主成分分析和逐步判別判別分析，得到 La、Ce、Pr、Sm和Se 5種元素作為普洱茶溯源的表征指標(biāo)候選元素，結(jié)合普洱茶產(chǎn)地土壤的相關(guān)性分析結(jié)果，確定5種元素可以作為溯源指標(biāo)，其初始正確判別率達(dá)到94.6%，交叉檢驗正確識別率為89.3%。