廣州某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌流行性及抗生素的耐藥性

黃琴，石磊，狄慧玲,，閆鶴

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院，廣東廣州 510632）

豬肉是我國(guó)最主要的肉類消費(fèi)品和蛋白質(zhì)攝取來源，生豬養(yǎng)殖業(yè)不僅僅滿足肉類消費(fèi)需要，而且在國(guó)內(nèi)外經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。其中仔豬腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要疾病，特別是剛出生的仔豬，近一半（49%）的仔豬死亡由腹瀉引起[1]。盡管導(dǎo)致仔豬腹瀉的原因非常復(fù)雜，但大腸桿菌是其主要病原菌已經(jīng)明確。大腸桿菌作為腸道菌群中最主要的一種細(xì)菌，除腹瀉外還能夠引發(fā)敗血癥、肺部、尿道或腹腔感染[2]，嚴(yán)重威脅畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。伴隨著抗生素在疾病防治和飼料添加中的廣泛使用乃至濫用，大腸桿菌分離菌株的抗生素耐藥率不斷攀升，且呈現(xiàn)耐藥譜廣、多重耐藥、耐藥傳播加速等趨勢(shì)。同時(shí)，抗生素的大量使用致使豬養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中的細(xì)菌生成耐藥基因的貯存庫(kù)，不僅持續(xù)危害生豬養(yǎng)殖，而且還可通過感染生豬、污染豬肉進(jìn)一步通過食物鏈傳播到人類，造成嚴(yán)重的食品安全和公共衛(wèi)生問題[3]。

目前，許多研究者對(duì)所在地區(qū)的豬源大腸桿菌進(jìn)行臨床常用抗生素的耐藥情況監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同地域的豬源大腸桿菌耐藥情況有不同程度的差異[4～6]。由于不同地域抗生素的使用方式不同，大腸桿菌的耐藥性存在差異。

廣州地區(qū)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌的耐藥情況鮮有報(bào)道，耐藥情況不明。但磺胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素等抗生素具有殺菌譜廣和快速殺菌等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于畜牧業(yè)的養(yǎng)殖。因此，本研究采集廣州某規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場(chǎng)中腹瀉仔豬和健康仔豬及豬圈環(huán)境樣本，對(duì)其進(jìn)行大腸桿菌的分離鑒定，并對(duì)分離菌株進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和氨基糖苷類等抗生素敏感性及對(duì)應(yīng)的耐藥基因型進(jìn)行檢測(cè)，分析研究廣州地區(qū)豬源大腸桿菌的流行特征及抗生素耐藥規(guī)律，尋找仔豬腹瀉可能的病因，以期指導(dǎo)仔豬腹瀉病的防治用藥，同時(shí)為進(jìn)一步防治食源性疾病的爆發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

2017年3～5月從廣州地區(qū)某規(guī)?；i養(yǎng)殖場(chǎng)中采集樣本147份，其中腹瀉仔豬樣品97份（糞便試子48份，咽拭子18份，鼻拭子3份，組織樣品28份），健康仔豬樣品28份（糞便試子6份，組織樣品22份），豬圈環(huán)境樣品22份。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司；rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）、瓊脂糖，日本TaKaRa公司；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成；腸道增菌肉湯、麥康凱瓊脂平板（MAC）、三糖鐵瓊脂（TSI）、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、尿素瓊脂、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基、MH肉湯、LB肉湯，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化

采集的樣品依據(jù)國(guó)標(biāo)GB 4789.6-2016增菌，將增菌液劃線接種MAC瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，挑取磚紅色至桃紅色典型菌落在MAC平板上二次劃線純化。

1.3.2 生化鑒定

(1)大量營(yíng)養(yǎng)元素N、P、K2O、Corg，主要與MgO、Cu、F呈正相關(guān)，與B呈反相關(guān)。其中，N與CaO、Corg、Hg、Mn、P、Pb、Sb、Zn的相關(guān)系數(shù)大于0.5，呈顯著正相關(guān)，與K2O呈明顯反相關(guān)；P與CaO、Corg、Na2O、Hg、Mn、N、Pb、Zn的相關(guān)系數(shù)大于0.5，呈顯著正相關(guān)；K2O與Al2O3的相關(guān)系數(shù)大于0.5，呈顯著正相關(guān)，與Corg、As、Cr、N呈顯著反相關(guān)；Corg與Hg、N、P、Pb、Sb的相關(guān)系數(shù)大于0.5，呈顯著正相關(guān)，與K2O呈明顯反相關(guān)。

將疑似大腸桿菌分離株分別接種TSI斜面、蛋白胨水、尿素瓊脂和KCN肉湯，于37 ℃培養(yǎng)16～18 h。對(duì)分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，記錄結(jié)果。

1.3.3uidA基因鑒定

將生化鑒定結(jié)果為陽性的分離菌株，采用煮沸法提取細(xì)菌DNA，從37 ℃過夜培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿中，挑取單菌落2～4個(gè)，加入200 μL無菌雙蒸水，100 ℃煮沸 10 min，快速冷卻，13000 r/min 離心 10 min，取上清液即為模板 DNA，-20 ℃保存。以大腸桿菌ATCC25922作為陽性對(duì)照株，金黃色葡萄球菌ATCC25923作為陰性對(duì)照株，無菌雙蒸水作為空白對(duì)照，以大腸桿菌特異性u(píng)idA基因做PCR驗(yàn)證，引物序列見表1。

1.3.4 抗菌藥物藥敏試驗(yàn)

采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的K-B紙片法，依次對(duì)所有大腸桿菌分離菌株進(jìn)行 12種6大類抗菌藥物的敏感性測(cè)定，其中，β-內(nèi)酰胺類藥敏紙片5 種：頭孢他啶（30 μg）、頭孢唑肟（30 μg）、氨曲南（30 μg）、亞胺培南（10 μg）、美羅培南（10 μg）；喹諾酮類藥敏紙片3種：環(huán)丙沙星（5 μg）、加替沙星（5 μg）、左氧氟沙星（5 μg）；氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類及多肽類藥敏紙片各1種，分別為：慶大霉素（10 μg）、替加環(huán)素（15 μg）、復(fù)方新諾明（1.25/23.75 μg）、多粘菌素 B（10 μg）。結(jié)果判讀參照CLSI 2012年版的標(biāo)準(zhǔn)[7]，以大腸桿菌ATCC25922作標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株。

1.3.5 耐藥基因檢測(cè)

對(duì)所有的耐藥菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其相應(yīng)的耐藥基因。檢測(cè)的耐藥基因包括：磺胺類：sul1；喹諾酮類：qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib；β-內(nèi)酰胺類：blaCTX、blaSHV、blaTEM：四環(huán)素類：tetK、tetM；氨基糖 苷 類 ：aph(3′)-Ⅱa、aac(3′)-Ⅰb、ant(3′)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱb。根據(jù)報(bào)道[1,8～12]設(shè)計(jì)相關(guān)引物，引物序列及擴(kuò)增條件見表1。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用spss 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 大腸桿菌的檢出情況

經(jīng)細(xì)菌生化鑒定及uidA基因檢測(cè)驗(yàn)證，147份樣本中共分離大腸桿菌115株，分離率為78.23%，其中腹瀉仔豬樣品分離83株，健康仔豬樣品分離25株，豬圈環(huán)境樣品分離7株，詳見表2。統(tǒng)計(jì)分析表明，環(huán)境樣本的大腸桿菌分離率顯著低于腹瀉及健康仔豬樣本的分離率(p＜0.01)，但腹瀉仔豬和健康仔豬樣本中大腸桿菌的分離率并無顯著差異(p＞0.05)，這表明這些大腸桿菌可能為條件致病菌，腹瀉的發(fā)生可能與飲食或氣候條件相關(guān)，也有可能是自身免疫力低下導(dǎo)致。但總體廣州地區(qū)豬源大腸桿菌的陽性率低于王基偉[13]在長(zhǎng)春地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)里腹瀉仔豬大腸桿菌的分離率（100%），可能與養(yǎng)殖場(chǎng)地域及養(yǎng)殖方式有關(guān)，也可能與地域流行病情況有關(guān)。有研究表明其他食源性致病菌的污染會(huì)隨著大腸桿菌污染程度的加劇而增多[14]，大腸桿菌的大量污染會(huì)加重仔豬腹瀉的嚴(yán)重程度，增加仔豬的死亡率。因而為防止仔豬腹瀉疫情在此地區(qū)蔓延，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)大腸桿菌污染的防控措施。

表2 廣州地區(qū)豬場(chǎng)大腸桿菌分離情況Table 2 Prevalence of E.coli from pig farm in Guangzhou

2.2 大腸桿菌對(duì)12種抗生素的藥敏情況

115株大腸桿菌對(duì)12種抗生素的耐藥情況見表3。其中對(duì)磺胺類藥物復(fù)方新諾明的耐藥率最高，腹瀉仔豬、健康仔豬樣品及環(huán)境樣品分離株的耐藥率都達(dá)到或接近 100%；與國(guó)內(nèi)外關(guān)于豬源大腸桿菌對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率（90%～100%）的報(bào)道一致[3,15,16]，這與磺胺類藥物使用時(shí)間早、使用領(lǐng)域廣泛有直接的關(guān)系，同時(shí)也表明磺胺類藥物已不適合作為仔豬腹瀉防治用藥。其次，對(duì)三種喹諾酮類藥物（左氧氟沙星53.91%、加替沙星48.70%、環(huán)丙沙星36.52%）也呈現(xiàn)了較高水平耐藥，且腹瀉仔豬樣品分離株的耐藥率顯著高于健康仔豬樣品分離株(p＜0.01)，但與環(huán)境樣品分離株無顯著差異(p＞0.05)，這可能與喹諾酮類抗生素的耐藥性能夠由質(zhì)粒介導(dǎo)進(jìn)行水平傳播有關(guān)[17]。對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物頭孢他啶（31.30%）、氨曲南（28.7%）也呈現(xiàn)了較高水平的耐藥，腹瀉仔豬樣品分離株的耐藥率顯著高于健康仔豬樣品分離株（p＜0.01），這可能與近年來養(yǎng)殖業(yè)中使用β-內(nèi)酰胺類藥物作為抗菌藥物有關(guān)，今后有關(guān)部門應(yīng)提醒養(yǎng)殖戶對(duì)該類藥物謹(jǐn)慎使用以免進(jìn)一步擴(kuò)大耐藥菌群的加重；但對(duì)頭孢唑肟及亞胺培南的耐藥水平較低，僅在腹瀉仔豬樣本品分離菌中檢出，對(duì)美羅培南所有菌株均敏感；此外，對(duì)氨基糖苷類藥物慶大霉素及多肽類藥物多粘菌素B呈現(xiàn)一定水平的耐藥，而對(duì)四環(huán)素類藥物替加環(huán)素耐藥水平較低，且僅在腹瀉仔豬樣品中檢出，這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)中較少使用這些藥物的因素有關(guān)[18]，可考慮作為今后的用藥方向。

碳青霉烯類抗生素是治療人類細(xì)菌感染的第一線藥物[18]，本次測(cè)定的豬源大腸桿菌出現(xiàn)了2株大腸桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的耐藥率情況相似[8]，雖然耐藥率不高，但也應(yīng)引起重視。另外多粘菌素和替加環(huán)素是目前治療碳青霉烯類抗生素耐藥菌的最后一道防線[21]，而本次測(cè)定的豬源大腸桿菌對(duì)粘菌素和替加環(huán)素的耐藥率分別為11.30%、3.48%，應(yīng)予以重視。

表3 大腸桿菌對(duì)抗生素的耐藥情況Table 3 Antibiotic susceptibility of E.coli strains isolated in this study

與國(guó)內(nèi)不同地區(qū)腹瀉仔豬大腸桿菌耐藥情況研究結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)腹瀉仔豬大腸桿菌耐藥率較其他地區(qū)具有不同程度的差異，2012年浙江省地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉仔豬樣品分離大腸桿菌對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為77.4%、82.3%[22]，2014年吉林省地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉豬仔樣品分離大腸桿菌對(duì)左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素的耐藥率分別為 58.06%、67.74%、67.74%[21]，2016年安徽省地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉仔豬樣品分離大腸桿菌對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星、氨曲南的耐藥率分別為 72.1%。58.1%、61.2%、55.8%和 20.9%[23]。本實(shí)驗(yàn)從腹瀉仔豬樣品分離大腸桿菌對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、加替沙星、氨曲南的耐藥率分別為 27.71%、63.86%、43.37%、57.83%和 34.94%，產(chǎn)生此種現(xiàn)象原因可能是不同地區(qū)養(yǎng)殖模式和預(yù)防治療方式的不同。本實(shí)驗(yàn)腹瀉仔豬樣品分離株耐藥情況較健康仔豬樣品分離株的耐藥情況嚴(yán)重，這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)中對(duì)于腹瀉仔豬的治療，盲目用藥甚至過量用藥有關(guān)，今后獸醫(yī)部門應(yīng)制定相關(guān)措施，加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)防治用藥的指導(dǎo)工作。

2.3 耐藥譜分析

圖1 大腸桿菌的多重耐藥情況Fig.1 Multi-Antimicrobial resistance of E.coli strains isolated in the study

本研究定義同時(shí)對(duì)≥3種抗生素耐藥的菌株為多重耐藥菌株，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1。53株為多重耐藥菌株，多重耐藥率為46.09%，統(tǒng)計(jì)分析表明腹瀉仔豬樣品分離株的多重耐藥率顯著高于健康仔豬樣品及環(huán)境樣品分離株(p＜0.05)。腹瀉仔豬樣品菌株的主要耐藥組合為磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類；來自健康仔豬樣本的耐藥組合較為分散；來自豬圈環(huán)境樣本菌株的耐藥組合與腹瀉仔豬一致，這表明環(huán)境有可能受到腹瀉仔豬糞便等排泄物的污染，有可能會(huì)進(jìn)一步傳染給健康仔豬，造成多重耐藥菌在整個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的擴(kuò)散，加重仔豬腹瀉的蔓延，因而需注意加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境消毒，并隔離腹瀉仔豬。徐國(guó)峰[6]對(duì)黑龍江省不同地區(qū)集約化生豬養(yǎng)殖場(chǎng)分離的462株大腸桿菌進(jìn)行耐藥性分析，其主要的耐藥組合是磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖胺類、四環(huán)素類，與本次實(shí)驗(yàn)主要耐藥組合相似，這表明磺胺類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類藥物在我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)中使用廣泛，已造成較廣范圍的細(xì)菌耐藥。

2.4 耐藥基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

表4 6類耐藥大腸桿菌耐藥基因分布率Table 4 Detection rate of antibiotic resistance genes of 6 kinds of drug-resistance E.coli strains isolated in this study

由表4的PCR檢測(cè)結(jié)果可知，除多肽類外，其它5類抗生素耐藥基因均有陽性擴(kuò)增產(chǎn)物檢出，檢出率最高的為四環(huán)素類tetM（100%），其次為氨基糖苷類：aph(3')-Ⅱa、ant(3′)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱb（73.08%～84.62%）；β-內(nèi)酰胺類：blaCTX、blaTEM（61.9%～73.81%）及磺胺類sul1（54.38%）。表明這些耐藥基因可能是導(dǎo)致相應(yīng)種類抗生素耐藥的主要原因。但有些耐藥基因檢出率較低，如喹諾酮類：qnrA、qnrB、qnrS（0%～14.29%），表明這三個(gè)耐藥基因不是本研究分離株的主要耐藥機(jī)制。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs)的大腸桿菌近年來引起廣泛關(guān)注，引起不僅在臨床病患體內(nèi)檢出，也廣泛在健康人群中分檢出[24]，本研究在腹瀉仔豬、健康仔豬及環(huán)境樣本中均檢測(cè)到，表明該類耐藥基因污染廣泛，可能是人類普遍感染的傳染源之一。ESBLs廣義上可以分為三大類 TEM、CTX-M、SHV，本研究只檢測(cè)到前兩類，這與之前的一些研究相似[25]，但李進(jìn)福等[26]關(guān)于河南地區(qū)豬呼吸道隱性感染大腸桿菌的研究中也檢測(cè)到SHV，表明大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥機(jī)制可能存在地域差異。另孫慧等[11]報(bào)道的山東禽源大腸桿菌氨基糖苷類耐藥基因ant(3′)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb、aph(3′)-Ⅱa的檢出率分別為49.6%、25.0%、22.8%，低于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果；而磺胺類耐藥基因sul1的檢出率卻低于韋慶蘭等[27]報(bào)道的大腸桿菌sul1耐藥基因檢出率（73.8%），喹諾酮類耐藥基因qnrS的檢出率低于夏緒進(jìn)等[28]對(duì)新疆地區(qū)豬源大腸桿菌的研究結(jié)果（62.5%），這些均表明各地大腸桿菌耐藥機(jī)制大體一致，但主要的耐藥機(jī)制可能存在地域差異。

3 結(jié)論

3.1 廣州某規(guī)?；i養(yǎng)殖場(chǎng)中大腸桿菌污染嚴(yán)重，陽性率高達(dá)78.23%，養(yǎng)殖環(huán)境樣品的大腸桿菌陽性率顯著低于腹瀉仔豬和健康仔豬樣品的分離率（p＜0.01）；但腹瀉仔豬和健康仔豬樣本中大腸桿菌的陽性率并無顯著差異(p＞0.05)。所有菌株對(duì)磺胺類及喹諾酮類藥物呈現(xiàn)了較高水平耐藥（＞30%），不建議再作為仔豬腹瀉的防治用藥；對(duì)多粘菌素B、替加環(huán)素、亞胺培南耐藥水平較低（＜15%），對(duì)美羅培南敏感，可以作為今后仔豬腹瀉的用藥方向。46.09%分離株呈現(xiàn)多重耐藥（≥3種抗生素）；且腹瀉仔豬樣品分離株的多重耐藥率顯著高于健康仔豬樣品及環(huán)境樣品分離株(p＜0.05)。除多肽類外，本研究其它5類抗生素耐藥基因均有陽性擴(kuò)增產(chǎn)物檢出，且檢出率較高，表明耐藥基因元件在本地污染大腸桿菌細(xì)菌中普遍存在，但檢出率與其他地域存在差異，表明主要耐藥機(jī)制可能存在地域差異。

3.2 我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，豬肉是人類日常喜愛的消費(fèi)食品，因而豬肉食品的安全越來越受到人們的關(guān)注。因養(yǎng)豬業(yè)中大量使用抗生素，使得在養(yǎng)殖環(huán)境中，形成細(xì)菌耐藥基因貯藏庫(kù)，耐藥性細(xì)菌通過生豬-豬肉-人的鏈條將其攜帶的耐藥基因散播給人類，給人類健康造成威脅。本研究從廣州地區(qū)某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)采集樣品，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定及耐藥性分析，為當(dāng)?shù)厣i養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉仔豬臨床治療提供指導(dǎo)意見，同時(shí)為防治食源性疾病的爆發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。