鵝去氧膽酸的大孔樹脂純化工藝優(yōu)化及其降血脂活性

席曉志，郭莎莎，曹慧，崔曉偉，周繼棟，胡超群，王磊，段童瑤，黃璐瑤，李佳

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355）

鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）是動(dòng)物體膽汁中的一種生化物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，是天然初級(jí)膽汁酸。在人、畜、禽的膽汁中廣泛存在， 是雞、鴨和鵝等家禽膽汁中的主要有機(jī)成分。臨床上不僅用做溶解膽結(jié)石和糾正飽和膽汁的藥物，還具有顯著的平喘、抗炎、鎮(zhèn)咳、降血脂和祛痰的作用。另外，鵝去氧膽酸也是制備另一種治療膽結(jié)石的藥物（熊去氧膽酸）的良好原料[1,2]。大量的專利和文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于鵝去氧膽酸的分離純化，其中較為常用的是鋇鹽和鈣鹽沉淀法等[3～6]，但提取方法都比較復(fù)雜且成本較高，限制了其開發(fā)利用。高血脂是多種心血管疾病的主要危險(xiǎn)因子，已經(jīng)成為人們健康和生命的“頭號(hào)殺手”?，F(xiàn)在隨著生活水平的提高，高血脂人群在不斷的增加，因其引發(fā)的相關(guān)性血管類疾病的發(fā)病率也不斷升高，并有向年輕化發(fā)展的趨勢(shì)。市面上的降血脂藥物多以化學(xué)藥物為主，但其毒副作用較大，不利于患者的長(zhǎng)期使用。因此，開發(fā)安全、無毒副作用的預(yù)防高血脂的天然藥物和保健品是十分重要的[7～9]。鵝去氧膽酸作為一種從動(dòng)物膽汁中提取的天然物質(zhì)，目前關(guān)于其降血脂作用的研究報(bào)道較少。因此，本研究采用活性炭脫色提取和D101大孔樹脂進(jìn)行分離純化，通過清潔環(huán)保、低耗能的方式得到純度較高的鵝去氧膽酸，并且由小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究鵝去氧膽酸的降血脂作用。以期為鵝去氧膽酸的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

圖1 鵝去氧膽酸的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of chenodeoxycholic acid

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料、試劑

雞膽汁皂化液，山東天綠制藥有限公司；D101、HZ-802大孔樹脂，天津浩聚樹脂科技有限公司；鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；95%乙醇（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；薄層層析硅膠，青島海洋化工有限公司；磷鉬酸，源葉生物有限公司；乙酸乙酯（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；石油醚（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；冰醋酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；鹽酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

高脂飼料：78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉和10%豬油、0.2%膽鹽。

甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠 40只，體重(90±5)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(魯)2017 0010，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 儀器

磁力攪拌器，上海梅穎溥儀儀表制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；層析柱，江陰市新輝層析柱有限公司；UV-5100B型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Agilent1260型高效液相色譜儀（Agilent1260四元泵，DAD檢測(cè)器，LC1260色譜工作站）；色譜柱：TC-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×200 mm）。

1.4 方法

1.4.1 鵝去氧膽酸提取液的制備

取膽汁皂化液，鹽酸調(diào)PH到1，得到固體。用無水乙醇攪拌溶解，加入 3%活性炭，回流脫色，抽濾，得到粗提物。脫色過程中，對(duì)于樣品的提取量與提取時(shí)間做了檢測(cè)。

1.4.2 大孔樹脂的篩選

準(zhǔn)確稱取濕樹脂各1.0 g，加入25 mL樣液于100 mL 錐形瓶中，在水浴搖床(25 ℃、100～120 r/min)上振蕩24 h，計(jì)算樹脂吸附率。然后用蒸餾水洗樹脂三次以除去表面殘留樣液，再加入50 mL，70%乙醇解吸24 h后計(jì)算解吸率[10～12]。考察大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能。

式中：C0為初始樣液濃度，C1為平衡濃度，C2為洗脫液濃度，V0為初始樣液體積，V2為洗脫液體積，M為樹脂干重。

1.4.3 大孔樹脂純化鵝去氧膽酸的條件優(yōu)化

1.4.3.1 吸附劑和上樣濃度的優(yōu)選

在7份預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂濕法裝柱，將粗提物分別溶于不同濃度乙醇上樣?？疾觳煌絼?duì)大孔樹脂吸附效果的影響。

將5份預(yù)處理好的樹脂以濕法裝柱，用蒸餾水充分平衡，然后將濃度分別為4、6、8、10、12 mg/mL的鵝去氧膽酸粗提物以 2 BV/h的流速上樣吸附，每0.5 BV的流出液收集1份，測(cè)定流出液的鵝去氧膽酸濃度，繪制泄漏曲線，根據(jù)曲線確定上樣濃度。

1.4.3.2 解吸液的選擇

將鵝去氧膽酸粗提物溶于45%乙醇上樣。分別用45%，55%，65%，75%，85%，95%乙醇進(jìn)行洗脫，通過薄層色譜檢測(cè)洗脫液中所含有的成分，HPLC檢測(cè)各濃度洗脫液中有效成分純度，以確定合適洗脫劑。 1.4.3.3 解吸速度對(duì)解吸效果的影響

取一定量處理好的大孔樹脂濕法裝柱，柱體積為30 mL，將50 mL樣液經(jīng)大孔樹脂吸附完全后，用150 mL，55%乙醇分別以1.0、2.0、3.0、4.0 BV/h速度解吸，計(jì)算解吸率?？疾旖馕俣葘?duì)解吸效果的影響。

1.4.4 CDCA結(jié)晶

鵝去氧膽酸粗提物溶于45%乙醇經(jīng)過D101大孔樹脂純化后，得到含有CDCA的洗脫液。洗脫液加入氫氧化鈉溶液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮脫醇，至乙醇脫凈后，用磁力攪拌器邊攪拌邊加鹽酸至 pH=1，有固體析出，抽濾，得到CDCA結(jié)晶，烘干。

1.4.5 CDCA純度的檢測(cè)

薄層色譜檢測(cè)：將10 μL樣品和CDCA標(biāo)準(zhǔn)品，點(diǎn)樣于G型薄層層析硅膠板上，放入展開槽中展開（展開劑為乙酸乙酯:石油醚:冰乙酸=7:3:1.5），展開后晾干，用5%磷鉬酸乙醇溶液作為顯色劑，在105 ℃烘箱內(nèi)高溫顯色。

高效液相色譜條件：Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-水，等梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；測(cè)定波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量 10 μL。

1.4.6 降血脂試驗(yàn)方法

1.4.6.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模、分組及給藥

根據(jù)文獻(xiàn)[13,14]所述降血脂實(shí)驗(yàn)方法并有所調(diào)整，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下除空白組外其他四組大鼠喂飼基礎(chǔ)飼料觀察20 d，然后取尾血，測(cè)定血清總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。根據(jù)血清總膽固醇隨機(jī)分組，分為空白組只給予蒸餾水，模型組在給予高脂飼料的同時(shí)給予蒸餾水，剩余三組給予高脂飼料同時(shí)給予不同劑量(100 mg/kg，200 mg/kg和500 mg/kg)的鵝去氧膽酸，灌胃28 d后眼球取血，0 ℃靜置 30 min，4000 r、4 ℃離心 15 min 分離血清測(cè)定血清TC，TG，HDL-C水平。

1.4.6.2 大鼠臟器指數(shù)

大鼠給藥28 d后，空腹稱重，處死，解剖取出其完整的心、肝、脾和腎，除去血液，用濾紙擦干，稱重。計(jì)算臟器指數(shù)：

1.4.6.3 大鼠的生化指標(biāo)的測(cè)定

按照1.4.6.1項(xiàng)下方法取得各組大鼠血清后，按照試劑盒要求測(cè)定血清TC，TG，HDL-C水平。

1.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析，以p＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果和討論

2.1 粗提液的制備

在脫色回流的過程中，由于不同的回流時(shí)間會(huì)對(duì)CDCA的提取效果產(chǎn)生影響，于是對(duì)回流時(shí)間進(jìn)行了篩選，結(jié)果如圖2中所示隨著脫色時(shí)間的延CDCA的含量在2 h時(shí)CDCA濃度最高，之后逐漸減少，因此可以得出最佳的回流時(shí)間為2 h。

圖2 脫色回流時(shí)間與CDCA提取量的關(guān)系圖Fig.2 Decolorizing reflux time and extraction for CDCA of the diagram

2.2 大孔樹脂的篩選結(jié)果

樹脂極性及其孔徑大小決定大孔樹脂吸附效果。表1對(duì)五種大孔樹脂進(jìn)行比較，703、D201和AB-8型大孔樹脂與D101大孔樹脂比較對(duì)于鵝去氧膽酸吸附量、吸附率及解吸附率都比較低且具有顯著性差異（p＜0.05），D101樹脂吸附率與HZ-802樹脂之間存在顯著性差異較小（p＞0.05），但是D101大孔樹脂價(jià)格要比HZ-802樹脂便宜10倍同樣對(duì)鵝去氧膽酸具有高分離能力。綜合考慮選擇D101樹脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 五種大孔樹脂吸附率與解吸附率的比較Table 1 Rate of five kinds of macroporous resin adsorption and desorption rate comparison (M±SD, n=5)

2.3 吸附劑和上樣濃度對(duì)吸附效果的影響

圖3 不同濃度吸附劑對(duì)吸附率的影響Fig.3 Different concentration adsorbent impact on adsorption rate

圖4 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響Fig.4 Effect of sample concentration on adsorption capacity

由圖3可知，在提取物溶于不同濃度乙醇時(shí)，其吸附率有明顯的差異，在吸附劑為45%乙醇時(shí)樹脂對(duì)CDCA的吸附效果最好，由于CDCA水溶性較差，若醇含量過低則會(huì)有析出，而醇含量過高則會(huì)使CDCA的溶解度過大不易被樹脂吸附，因此選擇45%乙醇為最佳吸附劑。將提取物溶于45%乙醇上樣，上樣濃度分別為4 mg/mL～12 mg/mL，由圖4可以看出當(dāng)上樣濃度在4、6和8 mg/mL時(shí)的鵝去氧膽酸的泄露較多樹脂過早達(dá)到穿透點(diǎn)，容易造成樣品浪費(fèi)；而濃度為10 mg/mL時(shí)泄漏量較低，效果最好。

2.4 解吸液濃度對(duì)CDCA解吸效果的影響

由圖5知，隨著解吸液濃度的提高 CDCA、CA的解吸率都是先增大后減小，在 55%與 75%之間，CDCA與CA的解吸率有明顯的差別，因此，這一階段可作為對(duì)CDCA與CA的分離梯度進(jìn)行洗脫，因此在洗脫中選擇55%和75%乙醇梯度洗脫。

圖5 解吸液濃度對(duì)CDCA解吸效果的影響Fig.5 The influence of desorption solution concentration of CDCA desorption effect

2.5 解吸速度對(duì)解吸效果的影響

圖6 解吸速度對(duì)解吸效果的影響Fig.6 Effect of desorption rate on desorption capacity

由圖6可知，當(dāng)解吸速度為1.0、2.0 BV/h時(shí)，解吸率均高于85%，而解吸速度為3.0、4.0 BV/h時(shí)，解吸率顯著降低。這是由于一定用量的乙醇解吸，當(dāng)解吸速度太大時(shí)，會(huì)因?yàn)楸粯渲降挠行С煞譀]有足夠的時(shí)間完全溶于乙醇而造成解吸率較低；而當(dāng)解吸速度太低時(shí)，雖然解吸率較高，但解吸所耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，效率太低，且會(huì)因?yàn)榱鞒龅慕馕翰粔蚣卸鴮?dǎo)致拖尾現(xiàn)象的出現(xiàn)[10～12]。因此，選擇2.0 BV/h為最佳解吸速度。

2.6 薄層色譜結(jié)果

按照優(yōu)化后的提取工藝，對(duì)鵝去氧膽酸分離純化，將不同洗脫劑下的洗脫液收集點(diǎn)板后。結(jié)果如圖7薄層色譜板顯色結(jié)果，由圖可知，最左側(cè)點(diǎn)為鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品，1～3個(gè)柱體積時(shí)，為CA的薄層點(diǎn)，第4～7柱體積為CA與CDCA混合物質(zhì)，第8柱體積處CA已經(jīng)除去，第9～12柱體積將CDCA薄層點(diǎn)。由此可以發(fā)現(xiàn)，D101大孔樹脂在7個(gè)柱體積下就可以除掉膽汁中膽酸，從而得到高純度的鵝去氧膽酸。

圖7 薄層色譜顯色圖Fig.7 Thin layer chromatography color chart

2.7 CDCA純度檢測(cè)結(jié)果

圖8 a.CDCA標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果，b.純化后CDCA檢測(cè)結(jié)果Fig.8 a. Standard test results of CDCA, b. Purified CDCA test results

在使用HPLC檢測(cè)CDCA的純度過程中，發(fā)現(xiàn)使用外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)兩點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果相同，因此采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如圖8所示，CDCA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣后保留時(shí)間為 12.863 min測(cè)得峰面積 Ai為627267.375，而做出樣品中 CDCA得保留時(shí)間為12.757 min 測(cè)得峰面積 AS615022.0275，求得 CDCA純度為Ai/AS=98%。

2.8 鵝去氧膽酸對(duì)高血脂大鼠的影響結(jié)果

2.8.1 高血脂模型大鼠造模結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中，空白對(duì)照組大鼠狀態(tài)較好，體重質(zhì)量穩(wěn)定上升；高脂模型組大鼠通行質(zhì)量呈先增長(zhǎng)后降低在增長(zhǎng)的趨勢(shì)。各組都不存在搏斗現(xiàn)象，試驗(yàn)期間無動(dòng)物死亡狀況。由表2可知，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)過10 d的高脂飼料喂飼后，大鼠體質(zhì)量相對(duì)空白組有顯著增高（p＜0.05），TG、TC 水平升高明顯(p＜0.05)，且給藥組和模型組大鼠血清中總膽固醇和甘油三酯含量顯著高于空白組(p＜0.05)，說明造模結(jié)果理想。

表2 高血脂大鼠模型的建立Table 2 Establishment of rat model of hyperlipidemia (M±SD,n=10)

2.8.2 大鼠臟器指數(shù)

由表3可以看出，模型組大鼠肝指數(shù)和鵝去氧膽酸給藥組顯著高于空白對(duì)照組(p＜0.05)，說明高脂飼料的過多攝入使得脂質(zhì)在大鼠的肝臟內(nèi)積存，造成了大鼠肝臟重量的增加；而鵝去氧膽酸中、高組大鼠的肝臟指數(shù)顯著低于模型組(p＜0.05)，表明鵝去氧膽酸有利于脂質(zhì)的降解，緩解了脂質(zhì)在肝臟的堆積；各組間的腎指數(shù)、脾指數(shù)及心指數(shù)無顯著性差異(p＞0.05)，表明高脂飼料及鵝去氧膽酸未使大鼠其它臟器產(chǎn)生病變。

2.8.3 大鼠血清TC、TG和HDL-C的含量

由表4可知，高脂飼料顯著增加了模型組大鼠血清的TC、TG及HDL-C水平（p＜0.05），而鵝去氧膽酸中、高組大鼠血清的TC、TG和HDL-C水平顯著低于模型組(p＜0.05)，表明鵝去氧膽酸在一定程度上降低了高血脂大鼠的血清血脂水平。

表3 大鼠的臟器指數(shù)Table 3 Viscera index of rats (M±SD, n=10)

表4 大鼠的血清血脂水平Table 4 Serum lipid levels in rats (M±SD, n=10)

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)五種大孔樹脂的篩選，選擇了D101這種價(jià)格便宜，重復(fù)利用度高且對(duì)CDCA有較強(qiáng)吸附力的大孔樹脂。實(shí)驗(yàn)過程中優(yōu)化了鵝去氧膽酸的提取純化工藝，并對(duì)純化過程中吸附劑、上樣濃度、解吸附液濃度、解析速度進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，經(jīng)過活性炭回流脫色2 h后的鵝去氧膽酸粗提物，用45%乙醇溶解上樣，上樣濃度為10 mg/mL，用55%和75%乙醇以2 BV/h；流速洗脫12 BV得到CDCA，經(jīng)高效液相測(cè)得純度為98%。通過對(duì)大鼠進(jìn)行高血脂造模后，灌胃鵝去氧膽酸28 d，對(duì)大鼠生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定初步評(píng)估鵝去氧膽酸的降血脂功效。

3.2 結(jié)果表明，鵝去氧膽酸中、高劑量組大鼠血清的TC、TG和HDL-C水平顯著低于模型組（p＜0.05），在一定程度上降低了大鼠的血清血脂水平。本研究對(duì)鵝去氧膽酸的提取純化方法進(jìn)行了優(yōu)化并對(duì)其降血脂功效進(jìn)行了初步探究，為該物質(zhì)的研究提供了一定參考。但對(duì)于降血脂功效只是初步探究，在后續(xù)的試驗(yàn)中還需要深入探討。