豬-人異種移植相關(guān)基因CMAH的克隆、表達(dá)及功能生物信息學(xué)分析

張 霞 ，秦彩艷 ，霍海龍 ，王淑燕 ，王 配 ，潘偉榮 ，張永云 ，陳園園 ，霍金龍

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院教務(wù)處，昆明 650031；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，昆明 650201）

器官移植在臨床醫(yī)學(xué)中始終面臨諸如供體器官嚴(yán)重不足的問(wèn)題，制約了器官移植的廣泛應(yīng)用。因此異種器官移植被認(rèn)為是解決供體器官短缺的有效途徑，作為拯救和延續(xù)人類生命的一種重要手段，廣受醫(yī)學(xué)工作者和科研工作者的關(guān)注。目前豬已被認(rèn)為是異種器官移植重要的候選物種[1-2]，但是異種移植后將出現(xiàn)比同種移植更為復(fù)雜的排斥反應(yīng)，其中，超急性排斥反應(yīng)（Hyperacute rejection，HAR）是異種器官移植需要克服的主要屏障。它在異種器官移植免疫排斥反應(yīng)中發(fā)生最快、破壞力最大[3-4]。而版納微型豬近交系是世界上首個(gè)培育成功的豬近交系，其基因高度純合、遺傳背景清楚，生理生化、解剖和疾病發(fā)生等方面與人類極為相似，可為新藥臨床應(yīng)用前的安全性評(píng)價(jià)、豬基因組計(jì)劃中的功能基因研究、人類疾病動(dòng)物模型的制作和人類異種器官移植等眾多領(lǐng)域提供良好的實(shí)驗(yàn)素材和器官供體，具有重要的科研價(jià)值和科學(xué)應(yīng)用前景[5-7]。

引起豬→靈長(zhǎng)類動(dòng)物異種器官移植HAR的主要原因是豬器官內(nèi)皮細(xì)胞表面的α-1,3-半乳糖（α-1,3-Gal）抗原，被受體的抗體識(shí)別并激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)，從而引發(fā)超急性排斥反應(yīng)[8-10]。將敲除α-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,3galactosyltransferase，GGTA1，α-1,3GT）的豬的器官移植到受體后，受體的補(bǔ)體活性及細(xì)胞毒性作用雖明顯減弱，但是并沒有完全消除，提示人們除了α-1,3-Gal外可能還有其他成分在異種器官移植免疫排斥中起作用[11-14]。N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc）是常見的唾液酸類型，參與免疫應(yīng)答、炎癥和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等過(guò)程，是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控豬到人異種器官移植免疫排斥反應(yīng)的重要異種抗原[15-17]，當(dāng)發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)，Neu5Gc能被HD抗體（Hanganutziu-Deicher）識(shí)別，引發(fā)炎癥[18-19]。然而豬體內(nèi)的Neu5Gc是由CMAH催化N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）而生成，CMAH屬于胞苷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶家族，是催化Neu5Gc合成的關(guān)鍵酶[20]。CMPNeu5Ac羥化酶是Rieske超家族很重要的成員，是從N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）合成N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc）的關(guān)鍵酶，其中Neu5Gc和Neu5Ac被認(rèn)為是唾液酸細(xì)胞表面糖類家族的成員。而且除人類以外的所有哺乳動(dòng)物在其細(xì)胞表面都具有Neu5Gc突變體[21]。有研究者應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在豬胎兒成纖維細(xì)胞（PFFs）中同時(shí)靶向敲除GGTA1和CMAH基因，以此為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與來(lái)自GGTA1敲除豬的細(xì)胞相比，來(lái)自GGTA1/CMAH雙基因敲除豬的細(xì)胞中，人類的抗體結(jié)合及抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性顯著降低，這表明雙基因敲除豬在異種移植過(guò)程中降低免疫排斥反應(yīng)有更好的優(yōu)勢(shì)[22]。

本研究以版納微型豬近交系為試驗(yàn)材料，克隆豬CMAH基因的CDS全序列，分析其核酸和蛋白序列特征，利用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)對(duì)CMAH蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析；采用熒光定量PCR技術(shù)分析其在BMI 27個(gè)不同組織中的mRNA表達(dá)，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)BMI 9個(gè)組織中的CMAH蛋白表達(dá)特征，通過(guò)生物信息學(xué)分析其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為CMAH基因在異種器官移植排斥反應(yīng)的功能研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

屠宰BMI成年公豬3頭，分別采集免疫組織（肝、脾、脊髓、淋巴結(jié)、扁桃體、頜下腺、舌下腺），性腺及副性腺組織（附睪、睪丸、精囊腺），消化組織（胃、盲腸、結(jié)腸、直腸、空腸、回腸），重要的內(nèi)分泌組織（甲狀腺、腎上腺）以及其他普通組織（心、肺、腎、肌肉、舌頭、下丘腦、大腦、小腦、皮膚）共27種樣品，用于RNA水平和蛋白水平的實(shí)驗(yàn)研究。購(gòu)買寶生物公司的高保真聚合酶ExTaq、熒光定量染料SYBR GreenⅡ，ABI公司的抗體以及碧云天公司的蛋白濃度檢測(cè)試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和引物設(shè)計(jì)

提取組織總RNA，經(jīng)電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量較好的反轉(zhuǎn)錄為cDNA。下載豬的CMAH完整CDS序列（登錄號(hào)：NM_001113015）以及豬CMAH部分mRNA序列（登錄號(hào)：Y15010），利用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)F1/R1特異引物（F1：ATGAGCAGCATCGAAC AAAC，R1：TTCATGTTGTTGGGCACC）來(lái)擴(kuò)增CMAH基因編碼區(qū)序列1 774 bp，設(shè)計(jì)F2/R2特異引物（F2：GATGATTGAGACAGATGAGGAC，R2：GAGCAGAC CATTCTTTACCA）擴(kuò)增169 bp，熒光定量分析多組織表達(dá)譜。

1.2.2 RT-PCR分離CMAH基因mRNA

35.75 μL 滅菌水，5 μL 10×GC BufferⅠ（含 Mg2+），4 μL dNTP Mixture，3 μL 睪丸 cDNA 模板，各 1 μL 10 μmol/L 上、下游引物，0.25 μL Ex TaqE，退火溫度為60℃。將產(chǎn)物進(jìn)行電泳，回收，測(cè)序。

1.2.3 多組織表達(dá)分析

分別用目的基因和內(nèi)參基因的熒光定量引物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以200 ng/μL起始濃度的淋巴結(jié)cDNA，進(jìn)行5倍倍比連續(xù)稀釋獲得7個(gè)濃度梯度的模板，篩選合適的模板濃度，再進(jìn)行多組織qPCR檢測(cè)。

1.2.4 CMAH蛋白Western Blot分析

選取BMI肝臟、脾臟、脊髓、淋巴結(jié)、回腸、大腦、皮膚、睪丸及扁桃體9種固有免疫系統(tǒng)占主導(dǎo)的器官組織提取蛋白進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，以βtubulin（54 kD）為內(nèi)參蛋白。通過(guò)提取組織蛋白、BCA法測(cè)定蛋白濃度、變性、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、曝光、洗膠片等過(guò)程獲得結(jié)果。

1.2.5 序列確定和數(shù)據(jù)分析

利用DNAStar軟件進(jìn)行序列組裝、CDS預(yù)測(cè)、蛋白序列推導(dǎo)及預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量（Mw）和等電點(diǎn)（pI）。統(tǒng)計(jì)27個(gè)組織的熒光定量數(shù)據(jù)結(jié)果，采用2-ΔΔCt處理數(shù)據(jù)，分析多組織mRNA相對(duì)表達(dá)水平。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast程序及ESpript網(wǎng)站進(jìn)行多物種間氨基酸序列比較分析。利用Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)、ProtParamtool、SOPMA、ProtScale、Prosite、TMHMM2.0、SignaIP4.1等程序分別推測(cè)基因結(jié)構(gòu)、預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、活性位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽。

2 結(jié)果與分析

2.1RT-PCR擴(kuò)增CMAH基因結(jié)果

對(duì)CMAH基因進(jìn)行擴(kuò)增，長(zhǎng)度為1 774 bp，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 CMAH的電泳結(jié)果Figure1 Electrophoresis result of CMAH

2.2 CMAH基因核酸及氨基酸序列

擴(kuò)增出的版納微型豬近交系CMAH基因CDS為1 734 bp，包含577個(gè)氨基酸，GenBank中核酸和氨基酸登錄號(hào)分別為KM098147和AIS36193。下劃線標(biāo)出的第6～112 AA和135～252 AA位氨基酸分別屬于Rieske和UlaG超家族，見圖2。

2.3 CMAH基因組、mRNA和蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)搜索CMAH基因組DNA，發(fā)現(xiàn)該基因位于豬7號(hào)染色體NC_010449.5的21032289-21109183位置，其全長(zhǎng)76 894 bp，包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，繪制的CMAH基因組、mRNA和蛋白結(jié)構(gòu)見圖3。

2.4 多組織熒光定量表達(dá)分析

以脊髓組織作為中度表達(dá)的組織，采用2-ΔΔCt法分析各組織中的相對(duì)表達(dá)水平繪制出柱狀圖，結(jié)果表明BMI CMAH mRNA在頜下腺、脾、舌下腺等組織中高度表達(dá)，均極顯著高于其他組織（P＜0.01）；在淋巴結(jié)、肝、回腸、扁桃體和肺等組織中中度表達(dá)（由高到低）；在睪丸、空腸、脊髓、結(jié)腸、直腸、盲腸、胃和腎等組織中低度表達(dá)（由高到低）；在腎上腺、精囊腺、小腦、甲狀腺、皮膚、下丘腦、附睪、大腦、心、舌頭和肌肉等組織中表達(dá)極弱（由高到低），見圖4。

圖2 BMI CMAH基因核酸序列與基酸序列Figure2 BMI CMAH gene nucleic acid sequence and amino acid sequence

圖3 BMI CMAH基因組結(jié)構(gòu)Figure3 Genomic structure of BMI CMAH gene

2.5 Western blot分析

采用以β-tubulin為內(nèi)參的Western Blot分析CMAH蛋白在肝臟、脾臟、脊髓、淋巴結(jié)、回腸、大腦、皮膚、睪丸及扁桃體9種固有免疫系統(tǒng)占主導(dǎo)的器官組織。如圖5所示，BMI CMAH蛋白在脊髓和大腦中沒有表達(dá)，其他組織中均有表達(dá)。

2.6 CMAH蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和氨基酸序列信息

CMAH含有577個(gè)氨基酸，分子量66.63 kD，等電點(diǎn)6.37，正、負(fù)電荷殘基分別有77個(gè)和72個(gè)，分子式 C3023H4641N797O853S26，不穩(wěn)定系數(shù) 43.27，平均疏水性-0.441，脂肪系數(shù)82.08。有32.58%的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（188 AA），31.37%的α-螺旋結(jié)構(gòu)（181 AA），22.88%的延伸鏈結(jié)構(gòu)（132 AA），13.17%的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（76 AA）。其N末端親水，C末端疏水，最大疏水值1.589（第14 AA位），最小疏水值-3.011（第506和507 AA位）；存在1個(gè)亮氨酸富集的核輸出信號(hào)（23-26 AA）；存在N端信號(hào)肽序列，剪切位點(diǎn)在蛋白質(zhì)35～36 AA處；不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)；不含有信號(hào)肽序列；含有N-糖基化位點(diǎn)、N-?；稽c(diǎn)及4類磷酸化位點(diǎn)。

圖4 BMI CMAH基因的相對(duì)表達(dá)水平Figure4 Relative expression levels of BMI CMAH gene

圖 5BMI CMAH蛋白在不同組織中的表達(dá)結(jié)果Figure5 The protein levels of BMI CMAH in different tissues

2.7 CMAH蛋白質(zhì)序列多物種相似度計(jì)算及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將BMICMAH的蛋白質(zhì)序列與牛Bos taurus（XP_617171）、黑猩猩 Pan troglodytes（NP_001009041）、小鼠Mus musculus（NP_001104580）和大鼠 Rattus norvegicus（NP_001019444）等5個(gè)物種的蛋白質(zhì)序列導(dǎo)入MegAlign計(jì)算相似度，相似度分別為：93.9%、92.9%、89.4%、89.1%。之后將這5條序列導(dǎo)入MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖6。

圖6 5個(gè)物種CMAH蛋白質(zhì)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure6 The phylogenetic tree CMAH protein sequences of 5 species

3 討論

目前，豬已被科學(xué)界公認(rèn)為是最合適的器官移植供體[1-2]。關(guān)于豬到非人靈長(zhǎng)類異種器官移植的臨床試驗(yàn)方面，目前主要集中在探索心臟和腎臟器官的移植。在基于動(dòng)物異種移植的背景下，N-羥乙酰神經(jīng)氨酸的表達(dá)引發(fā)炎癥并促成延遲的組織排斥[23-24]。目前，N-羥乙酰神經(jīng)氨酸已經(jīng)在豬的心臟，腎臟，肝臟，胰腺等多數(shù)組織中被發(fā)現(xiàn)其阻礙異種移植的應(yīng)用[25-26]。有研究顯示，敲除基因CMAH的小鼠，會(huì)缺乏N-羥乙酰神經(jīng)氨酸，表明CMAH是唯一可以合成N-羥乙酰神經(jīng)氨酸的基因[27]。因此研究CMAH基因的基本特征以及表達(dá)情況的分析，對(duì)將來(lái)研究其分子機(jī)理起著很重要的作用。

本研究通過(guò)基因組結(jié)構(gòu)分析表明該基因位于豬7號(hào)染色體，含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。實(shí)時(shí)熒光定量多組織表達(dá)譜分析表明BMI CMAH mRNA在頜下腺、脾和舌下腺組織中表達(dá)最高，且極顯著高于其他組織，腺體和脾是重要的免疫器官，證明CMAH基因確實(shí)與免疫相關(guān)。Song K.H.等[20]的研究表明，豬CMAH外顯子1～3在小腸中最高表達(dá)，在直腸、舌頭、脾、睪丸、肝臟和結(jié)腸中中度表達(dá)。我們的研究結(jié)果中該基因在頜下腺、脾和舌下腺中表達(dá)最高，在淋巴結(jié)、肝、回腸、扁桃體和肺等組織中中度表達(dá)；在睪丸、空腸、結(jié)腸、直腸和腎等組織中表達(dá)較低，在舌頭組織中幾乎不表達(dá)。與Song K.H.等[20]的研究結(jié)果存在一定差異，這可能與品種差異等因素有關(guān)，需要進(jìn)一步的探索和驗(yàn)證。此外本試驗(yàn)中Western blot結(jié)果表明CMAH蛋白在皮膚組織中表達(dá)，但皮膚組織mRNA水平檢測(cè)不到CMAH基因，造成這種結(jié)果的原因可能是該基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程以及轉(zhuǎn)錄后翻譯為蛋白質(zhì)過(guò)程中的表達(dá)量有所不同，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。在此研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，可對(duì)該基因在體外和體內(nèi)的亞細(xì)胞定位研究提供基礎(chǔ)資料，也為臨床試驗(yàn)研究的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

BMI CMAH蛋白含有Rieske和UlaG兩個(gè)超家族結(jié)構(gòu)域。在Rieske非血紅素鐵加氧酶系統(tǒng)以及植物的葉綠體b6f和線粒體細(xì)胞色素bc復(fù)合物中常見的[2Fe-2S]簇結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，Rieske超家族結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，一端是不完整的反向平行β-桶狀結(jié)構(gòu)，另一端是鐵硫結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Rieske的鐵硫中心含有一個(gè)參與電子轉(zhuǎn)移的[2Fe-2S]簇，并被連接成兩個(gè)組氨酸和兩個(gè)存在保守序列中的半胱氨酸殘基（被稱為Rieske基序）[28]。在反滲透系統(tǒng)中，α亞基N-末端的Rieske結(jié)構(gòu)域充當(dāng)電子，通過(guò)穿梭接受來(lái)自還原酶或鐵氧還蛋白組分的電子，并將其轉(zhuǎn)移至α亞基C-末端結(jié)構(gòu)域中的單核鐵以用于催化。L-抗壞血酸代謝蛋白UlaG，是β-內(nèi)酰胺酶超家族重要的一員，是負(fù)責(zé)碳水化合物的運(yùn)輸和新陳代謝的結(jié)構(gòu)域。β-內(nèi)酰胺酶超家族除了β-內(nèi)酰胺酶之外，其他蛋白質(zhì)都含有該結(jié)構(gòu)域，包括硫醇酯酶，乙二醛酶Ⅱ家族的成員，其催化乳酰谷胱甘肽的水解以形成谷胱甘肽和乳酸，并且可能由參與轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DNA攝取[29-30]。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾對(duì)于調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用，對(duì)其進(jìn)行深入的鑒定和分析可以使人們對(duì)于機(jī)體內(nèi)的生理和病理發(fā)生過(guò)程機(jī)制有更加深入的了解。CMAH蛋白含有磷酸化、糖基化、?；箢惞δ芪稽c(diǎn)，蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程是很重要的調(diào)節(jié)機(jī)制，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞分化和發(fā)育，細(xì)胞增殖凋亡等[31]。乙?；^(guò)程一般是通過(guò)代謝酶進(jìn)而調(diào)節(jié)新陳代謝通路的。糖基化在復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，如細(xì)胞通信、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，CMAH在催化合成NeuGc的過(guò)程中，這些修飾位點(diǎn)起著很重要的作用。通過(guò)計(jì)算，發(fā)現(xiàn)5個(gè)物種的相似性均在80%以上。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，BMI與牛聚為一類，大鼠與小鼠聚為一類，均符合物種的系統(tǒng)分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，而且分支節(jié)點(diǎn)支持率數(shù)值較高，表明該基因比較保守。

綜上所述，本研究對(duì)CMAH的基因水平，mRNA水平以及蛋白水平進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，并確定了其核酸序列和氨基酸序列，確定了其組織表達(dá)特征，對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能生物信息學(xué)分析，為后續(xù)對(duì)其在免疫排斥方面的功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)，也將為進(jìn)一步研究該基因所在的重要信號(hào)通路以及分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。