豬圓環(huán)病毒2型青海分離株的分子鑒定及進化分析

趙玉清

（青海省海北藏族自治州畜牧獸醫(yī)科學研究所，青海海北 812200）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）的DNA病毒，其基因組為環(huán)狀單鏈DNA分子，長度約1 767 bp，主要有Rep和Cap兩個基因完成病毒的復制組裝等功能[1-2]。PCV有多種血清型，如PCV1、PCV2和PCV3型等。其中：PCV1無致病性；PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning pigs multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要毒株[3-4]；PCV3是在美國首先報道發(fā)現(xiàn)的新毒株，能引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應，目前在我國河北、福建、廣西等多個省份都能檢測到，與PCV1和PCV2處于不同的進化分支，屬于新型PCV[5-8]。

PCV主要通過垂直傳播（透過胎盤屏障）和水平傳播（通過陽性帶毒豬的鼻腔液、糞便和尿液等排泄物）而感染其他豬群[9-10]。血清流行病學調查發(fā)現(xiàn)：德國豬群的PCV血清抗體陽性率高達85%，英國為86%，北愛爾蘭為92%；我國江西、天津、北京、山東、河南、河北、吉林、福建等8個省份豬群的抗體陽性率都在50%以上[11-13]?？梢?，PCV在全球流行廣泛，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經濟損失。

本研究對青海省不同豬場發(fā)病豬群樣品，通過PCR檢測PCV2 ORF2基因，分析基因序列、氨基酸序列和進化樹，從而為我國PCV感染的診斷、預防控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料與毒株

采自青海省3個豬場的發(fā)病豬群。對表現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、精神沉郁、行動遲緩、皮膚蒼白、被毛臟亂、厭食消瘦、生長遲緩的豬進行剖檢，采集剖檢豬的淋巴、脾臟、腎臟和肝臟組織。每個豬場采集樣品6份，共18份樣品，用PBS液勻漿離心（5 000 r/min，20 min）取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

PCR-Premix Taq?（TaKaRa Taq? Version 2.0 plus dye）和DNA marker DL 2000：購于寶生物工程（大連）有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒：購自天根生化科技（北京）有限公司。其他均為國產常規(guī)試劑。PCR引物合成及PCR產物測序，均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。主要儀器包括PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、離心機、電子天平、蒸汽滅菌器、干燥箱、無菌操作臺、微量移液器等。

1.3 分子鑒定

參照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書，提取糞便基因組DNA并以此作為模板。VP2基因擴增全長片段預期為702 bp。引物如下：PCVCapF：5'- ATGACGTATCCAAGGAGGC-3'和 PCVCapR：5'- TTAGGGTTTAAGTGGGGGGT-3'。PCR擴增反應體系（50.0 μL）如下：Premix Taq 25.0 μL，上下游引物（濃度 10.0 μmol/L）各 2.0 μL，模板 DNA 3.0 μL，補充水 18.0 μL。擴增后將PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳（電壓120 V，時間30 min），電泳完成后在凝膠成像儀中觀察結果并拍照。PCR陽性產物測序委托金唯智生物科技有限公司完成，采用Sanger雙脫氧鏈終止法進行雙向測序。測序結果經峰圖分析后，在GenBank上采用BLAST方法（https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）進行同源序列搜索；應用MEGA 5.0軟件和Clustal Omega在線軟件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進行核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析。

1.4 PCV2-Cap蛋白特性分析

利用Prot Param程序（http://web.expasy.org/protparam/）計算VP2蛋白的分子量、等電點和氨基酸組成等理化指標；用SignalP程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和DAS-TMfilter server程 序（http://mendel.imp.ac.at/sat/DAS/DAS.html）分析其信號肽位點及跨膜結構；用SOPMA軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html）進行EM19抗原蛋白二級結構預測。通過ABCPred軟件（http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）對VP2蛋白的B細胞抗原表位進行預測分析。

1.5 進化分析

對克隆的PCV-Cap基因序列與已發(fā)表的PCV1和PCV2參考株的Cap基因序列和氨基酸序列，利用軟件中的 Meg Align 功能分別進行比對；利用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹；選擇Kimura 2-parameter模式，進行重復2 000次的自舉檢驗，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析PCV分離毒株和不同經典毒株的親緣關系及進化特點。

2 結果

2.1 分子鑒定

利用基因組DNA提取試劑盒，對病料提取DNA后，基于特異性引物進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳，可以獲得預期大小的片段（圖1），并發(fā)現(xiàn)有4個組織樣品呈陽性，陽性率為22.2%（4/18）。將4個陽性樣品進行膠回收測序，經過序列測定獲得完整的Cap基因核苷酸序列全長為705 bp，與GenBank參考毒株（PCV2）的核苷酸序列同源性均在99%以上，將其命名為PCV2-QH1株。

圖1 臨床病料樣品PCV-Cap基因PCR擴增檢測鑒定結果

2.2 PCV2-Cap蛋白特性

經過ExpASy在線系統(tǒng)分析，PCV2-Cap蛋白長度為234個氨基酸，分子量大小約為28.06 kDa，等電點（pI）為10.84；帶正（Arg+ Lys）負（Asp + Glu）電荷氨基酸殘基數(shù)分別為41個和16個。假定所有的半胱氨酸都形成二硫鍵，PCV2-Cap蛋白在280 nm處的摩爾消光系數(shù)為48 360 L·mol-1·cm-1及 0.1% 濃度（1g/L）的Abs值為1.724；假定所有的二硫鍵打開時，蛋白在280 nm處的摩爾消光系數(shù)為 48 360 L·mol-1·cm-1及 0.1%濃 度（1g/L） 的 Abs值 為 1.724。PCV2-Cap蛋白在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為56.61，推測PCV2-Cap蛋白為不穩(wěn)定蛋白。PCV2-Cap蛋白的脂肪族指數(shù)為65.30，親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.844，蛋白總體親水性非常高，可溶于水。PCV2-Cap蛋白序列信號肽預測值為0.182（cutoff值為0.450），不具有信號肽位點；軟件DAS-TMfilter server也顯示其不具有潛在的信號肽。PCV2-Cap蛋白二級結構預測分析發(fā)現(xiàn)，α螺旋比例為7.26%，β轉角比例為4.70%，無規(guī)則卷曲比例為61.54%，延伸鏈比例為26.50%?？梢姡琍CV2-Cap蛋白的二級結構以無規(guī)則卷曲為主。根據(jù)ABC Pred在線軟件預測出抗原表位結果見表1，有多個有效的抗原表位。

2.3 PCV-Cap基因進化關系分析

通過Clustal Omega軟件，將分離毒株PCV2-QH1的Cap基因與GenBank中相關毒株Cap基因的核苷酸序列和氨基酸序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)核苷酸同源性均在99%以上，氨基酸序列同源性均為100%，無氨基酸突變（表2）。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，PCV-QH1分離株與PCV2美國分離株（KU697156）組成一個微小分支，并與其它PCV2分離株處于同一個大支上，從進化角度上鑒定此分離株屬PCV2株（圖2）。

3 討論與結論

PCV對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害，除了引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征外，還能造成豬生殖系統(tǒng)紊亂、神經系統(tǒng)病變和呼吸道疾病綜合征，以及腸炎和增生性壞死性肺炎，也能引起豬皮炎腎病綜合征等[14]。已有研究表明，豬群除了會同時感染不同基因型的PCV（PCV1，PCV2a/b）外，還會與豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬細小病毒等形成共同感染[15]，對于屬單鏈DNA病毒PCV基因組中的基因易造成突變、插入和缺失等變異現(xiàn)象；同時隨著各種疫苗的大規(guī)模普遍使用，新的變異重組毒株可能經常出現(xiàn)。

表1 基于ABCPred軟件分析PCV2-Cap蛋白B細胞抗原表位結果

表2 PCV2-QH1與不同毒株Cap基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比較 單位：%

圖2 豬圓環(huán)病毒PCV-Cap基因的進化分析

臨床實踐中，從豬組織細胞中純化分離培養(yǎng)PCV較困難，所以本研究對疑似PCV感染組織病料直接進行DNA基因組的提取及PCV特異性引物的篩選鑒定，通過測序確定為PCV2。該方法適用于分子流行病學調查研究，有助于基因和蛋白序列比較及遺傳進化分析，同時可節(jié)省時間。

本研究表明，PCV2-Cap基因核苷酸序列與不同國家或地區(qū)的同源性均在99%以上，而蛋白序列同源性均為100%，無氨基酸突變。PCV2-Cap蛋白為病毒的衣殼蛋白，是主要的結構蛋白，也是主要的抗原表位。本地區(qū)PCV的Cap蛋白的氨基酸序列無突變，說明使用市場通用疫苗可收到良好的免疫效果。

同時，本研究對不同地區(qū)的PCV分離株進行了序列比較分析，并繪制了系統(tǒng)進化樹。結果表明，青海株（PCV-QH1）與美國3株毒株、韓國毒株聚在一支，表明它們之間的親緣關系最近；我國不同地區(qū)的毒株聚在一起，同時與韓國毒株親緣關系較近。歐洲毒株（法國和英國）與印度毒株親緣關系較近，澳大利亞毒株和日本毒株分別聚在一起，親緣關系較近。在進化角度上講，中國株與韓國株和美國株的親緣關系較近，說明中國株PCV病毒不是從單一的祖先進化而來的。這表明中國株與我國的國際進口引種貿易相關，但尚待進一步研究。本次對青海PCV分離株的Cap基因序列、蛋白氨基酸序列和抗原表位及系統(tǒng)進化的研究，可為我國PCV分子流行病學調查提供數(shù)據(jù)參考，同時提示豬場應按照疫苗免疫保健計劃進行疫苗免疫預防。