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    一例豬偽狂犬病野毒感染的實驗室診斷

    2018-09-07 02:29:46韓濤濤吳思雯唐青海何麗芳王芳宇
    中國動物檢疫 2018年9期
    關(guān)鍵詞:病料肺臟家兔

    黎 露,韓濤濤,吳思雯,唐青海,楊 海,何麗芳,劉 最,王芳宇,張 倩

    (衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)重點實驗室,湖南衡陽 421008)

    偽狂犬?。≒seudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的多種家畜的急性傳染病,1周齡內(nèi)仔豬易感,多出現(xiàn)發(fā)熱、奇癢、昏睡、共濟失調(diào)等神經(jīng)癥狀,妊娠母豬后期感染可發(fā)生流產(chǎn),產(chǎn)死胎,甚至木乃伊胎[1]。以往,育肥豬感染一般不發(fā)生死亡,僅出現(xiàn)增重減慢、體溫升高等輕微癥狀[2-3]。近年來,研究發(fā)現(xiàn),PRV對育肥豬的致病性顯著增強,并以呼吸道和發(fā)育障礙為主要癥狀[4],但僅靠臨床診斷,無法確診PRV感染,需要借助實驗室診斷。

    目前,PR主要依靠接種商品化的減毒活疫苗和基因缺失疫苗進行預(yù)防。PRV核酸為雙鏈 DNA,其編碼的gE蛋白是一種重要的神經(jīng)毒性因子,在基因缺失疫苗毒株中,該基因通常被剔除[5-6]。因此,在實驗室診斷中,通常采用PCR檢測gE基因,以區(qū)分野毒和疫苗毒,亦可配合gE蛋白特異性抗體檢測進行鑒別診斷[7-8]。2017年4月衡陽市某豬場育肥豬發(fā)生疑似PR疫情。為確診疫情,采集發(fā)病豬脾臟進行了實驗室診斷。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    Vero細(xì)胞:衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)重點實驗室培養(yǎng)保存;PRV強毒株陽性對照和PRV陽性血清:衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)重點實驗室制備保存;血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒:購自天根生化科技(北京)有限公司;胎牛血清:購自Gibico公司;MEM培養(yǎng)基:購自北京清大天一科技有限公司;Premix Ex Taq酶:購自寶生物工程(大連)有限公司;體重1.5 kg左右雌性新西蘭大白兔:購自南華大學(xué)實驗動物中心。

    1.2 方法

    1.2.1 病料采集與處理 采集發(fā)病豬脾臟,研磨加入MEM 細(xì)胞培養(yǎng)液制成組織懸液,反復(fù)凍融 3 次后,3 000 r/min離心2 min,取上清,用0.22 μm濾膜過濾,濾液于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 DNA提取與PCR檢測 取1.2.1中濾液200μL,用血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒提取DNA樣本。根據(jù) GenBank 中PRV HN1201毒株的基因組序列(KP722022.1)設(shè)計1對特異性引物(PRV-gE-F/R和PRV-gG-F/R)進行PCR檢測(表1)。PCR反應(yīng)體系包含:模板DNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,Taq 12.5 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃10 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,35個循環(huán);72 ℃10 min,4 ℃保存。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL,用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

    1.2.3 病毒分離培養(yǎng)與血清學(xué)鑒定 當(dāng)Vero細(xì)胞生長至密度為80%的匯合度時,去培養(yǎng)液,用PBS洗滌1次,加入無血清MEM培養(yǎng)基,按照體積比10:1的比例加入1.2.1中濾液,搖勻后,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1 d觀察1次。當(dāng)80%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時,收集培養(yǎng)物,反復(fù)凍融3次,取凍融物接種健康細(xì)胞,進行傳代培養(yǎng)。將分離的病毒,采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞染色法(IPMA)進行血清學(xué)鑒定,根據(jù)文獻[16]改進后進行。將Vero細(xì)胞接種35 mm培養(yǎng)皿中,當(dāng)Vero細(xì)胞生長至密度為80%的匯合度時,接種培養(yǎng)物,1 d后棄培養(yǎng)基;將細(xì)胞用2 mL PBS洗滌3次,真空干燥,加入1.5 mL 30 %丙酮-PBS固定30 min,干燥,加入1.5 mL 稀釋好的PRV多克隆抗體(1∶100),37 ℃孵育1 h;用PBS洗滌3次,加入1.5 mL酶標(biāo)二抗HRP-SPA(1∶3 000),37 ℃孵育1 h;用PBS洗滌3次,加入1.5 mL AEC底物顯色液,37 ℃孵育15 min;棄掉反應(yīng)液,用蒸餾水洗滌1次,在顯微鏡觀察結(jié)果。

    表1 引物序列及其反應(yīng)條件

    1.2.4 家兔感染試驗 將實驗家兔分成3組,每組2只:A組腹腔注射F3代分離培養(yǎng)物1 mL,B組注射F3代分離培養(yǎng)物4 mL,C組為不接種對照。每隔12 h觀察癥狀。待出現(xiàn)明顯臨床癥狀后,進行剖檢觀察病理變化,并取心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織,提取DNA進行PRV核酸檢測。

    2 結(jié)果

    2.1 PCR檢測

    取病料處理液進行PCR檢測,發(fā)現(xiàn)病豬脾臟組織為PRV-gE和gG基因核酸陽性(圖1)。

    2.2 病毒細(xì)胞培養(yǎng)與血清學(xué)鑒定

    將處理過的病料接種Vero細(xì)胞,培養(yǎng)3 d,發(fā)現(xiàn)接種細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變——細(xì)胞變圓、脫落、拉絲、融合成合胞體(圖2-A),未接種病毒對照細(xì)胞生長正常(圖2-B)。連續(xù)接種培養(yǎng)3代,均表現(xiàn)出一致CPE。

    IPMA結(jié)果顯示,接種病毒的培養(yǎng)皿中,被感染的Vero細(xì)胞反應(yīng)呈陽性,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均染成棕紅色,細(xì)胞質(zhì)著色濃于細(xì)胞核,未感染的細(xì)胞無著色(圖3-A)。未接種病毒的對照細(xì)胞無任何著色(圖3-B)。

    圖1 脾臟組織病料中PRV核酸的PCR檢測

    圖2 病毒的分離培養(yǎng)

    圖3 細(xì)胞傳代病毒(F3代)的血清學(xué)鑒定

    2.3 家兔感染試驗

    2.3.1 臨床癥狀 A組家兔:腹瀉,偶有瘙癢,用爪子撓腹部,撓癢頻率較高,接種病毒后約60 h死亡。B組精神萎靡,腹瀉、食欲不振,只飲水,劇烈撓腹部,隨后四肢麻痹,角弓反張死亡,接種病毒后30 h死亡。健康對照兔子觀察1周無任何癥狀,存活。

    2.3.2 家兔臟器的PRV-gE核酸檢測 PCR檢測結(jié)果表明,A組中肝臟和脾臟為PRV-gE核酸陽性,心臟、肺臟、腎臟為PRV-gE陰性(圖4);B組中肝臟、脾臟、肺臟為PRV-gE核酸陽性,心臟、腎臟為PRV-gE陰性(圖5)。

    圖4 A組臟器中PRV-gE PCR核酸檢測

    圖5 B組臟器中PRV-gE核酸的PCR檢測

    3 討論

    本研究應(yīng)用病毒分離傳代培養(yǎng)、PCR檢測和動物感染試驗等方法,對一例疑似PRV感染病例進行了鑒定。實驗室檢測結(jié)果表明,該病例為PRV野毒感染。

    發(fā)病豬脾臟組織樣品的PRV-gE和PRV-gG核酸陽性。病料接種Vero細(xì)胞3 d后,出現(xiàn)典型的PRV細(xì)胞病變——細(xì)胞變圓和細(xì)胞融,且培養(yǎng)物連續(xù)培養(yǎng)3代,均表現(xiàn)出穩(wěn)定的特征性CPE。這與其他研究人員將病毒接種到MDCK、雞胚成纖維細(xì)胞、BHK-21、PK-15也出現(xiàn)同樣CPE的結(jié)果一致[9-11]。

    用分離培養(yǎng)的PRV F3代病毒感染家兔,可使家兔出現(xiàn)腹瀉、奇癢、四肢麻痹神經(jīng)癥狀,而未感染家兔精神狀況良好。A組家兔從接種PRV到死亡共存活60 h,B組家兔存活30 h,與劉瀾等[12]、祁賢等[13]報道的結(jié)果相似。但本試驗未觀察到江煥賢等[14]報道的接種部位被毛脫落、皮膚撕破等現(xiàn)象。推測這可能是其在研究過程中病毒接種劑量較大引起的。取感染家兔的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織進行PCR擴增,發(fā)現(xiàn)A組肺臟為PRV-gE核酸陰性,而B組為PRV-gE核酸陽性,且B組中肺臟病毒含量比其他臟器大。郭麗靜[15]采用PRV強毒株對4頭19日齡未免疫的斷奶仔豬攻毒,取攻毒仔豬扁桃體等臟器組織進行PRV-gE核酸檢測,發(fā)現(xiàn)脾臟檢出率為100%,而肺臟檢出率僅為50%。這種病毒臟器分布的差異性可能跟病毒的感染嗜性、接種劑量及病程有關(guān),具體機制尚待進一步研究。

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