副豬嗜血桿菌熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用

崔 沛，王東方，閆若潛，王淑娟，冉曉龍，班付國

（河南省動物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450008）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬上呼吸道中常在的一種機(jī)會致病菌，在特定條件下能夠侵入機(jī)體，引發(fā)以纖維素性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和漿膜炎為主要特征的全身性疫病[1]，是目前影響?zhàn)B豬業(yè)最嚴(yán)重的病原之一。HPS在環(huán)境中普遍存在，只感染豬[2]，可影響2周齡至4月齡的青年豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，通常見于5～8周齡豬群，發(fā)病率一般在10%～15%之間，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)50%[3]。HPS還常由豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病病毒和豬呼吸道冠狀病毒等引起繼發(fā)感染[4]。

近幾年，HPS感染使許多大規(guī)模豬場的經(jīng)濟(jì)效益受到較大沖擊[5]。因此，建立一種快速、敏感、特異的HPS檢測診斷方法尤為重要。根據(jù)臨床癥狀、剖檢病變進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定是HPS的經(jīng)典診斷方法。然而該菌培養(yǎng)條件苛刻，很難從患病動物中分離到，尤其是經(jīng)抗生素治療后，其分離更加困難復(fù)雜[6]。目前，用于檢測HPS抗體的方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗、間接血凝試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗。但血清學(xué)檢測存在操作麻煩、檢測周期長、敏感性和特異性低等不足。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，PCR診斷技術(shù)已廣泛用于各個領(lǐng)域。張盼鋒等[7]、萬世平等[8]建立了HPS PCR檢測方法，但常規(guī)PCR方法只能定性，并且敏感性有待提高。隨著熒光定量PCR技術(shù)的快速發(fā)展，該技術(shù)開始被廣泛用于動物疫病檢測。該技術(shù)靈敏度比普通PCR提高了100倍，并能減少假陽性概率，而且由于不用電泳，減少了污染，節(jié)省了時間，使檢測結(jié)果更為直觀[6]。于江等[9]根據(jù)infB基因序列建立了SYBR Green I熒光定量 PCR檢測方法。SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR方法雖然敏感性高，但特異性較差，容易出現(xiàn)假陽性。羅寶正等[10]根據(jù)轉(zhuǎn)錄起始因子infB基因序列，建立了TaqMan探針熒光PCR技術(shù)。但該方法的探針只是基于傳統(tǒng)的TaqMan探針，在敏感性、特異性方面仍有提高的空間。本研究以HPS的16S rRNA基因作為檢測目標(biāo)，建立了TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌毒株及檢測樣品 重組質(zhì)粒pGEM-T/HPS：河南省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室保存；HPS菌株（血清1—15型）：河南農(nóng)科院惠贈；豬鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：河南省動物疫病防控制中心實驗室提供；臨床疑似HPS感染樣品（病死豬組織、心包積液、關(guān)節(jié)液）：采自河南省部分豬場。

1.1.2 主要儀器與試劑 KingFisher全自動核酸提取儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；分光光度計（UV-2450）：日本島冿公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀（ABI 7500）：美國ABI公司產(chǎn)品；梯度PCR儀：德國Biometra公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)：美國AlphaInnotech公司產(chǎn)品。Ex Taq DNA聚合酶、Rnase Inhibitor、DL2000DNA Marker、DNA 回 收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒等：均購自寶生物工程（大連）有限公司；pGEM-T easy載體：購自Promega公司；DNA/RNA磁珠提取試劑盒：購自Abmion公司。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中HPS 16S rRNA基因序列（登陸號CP005384.1），利用Primer Premier 6.0分析軟件，設(shè)計1對特異引物P1/P2（P1：5'-AGCAGCCGCGGTAATACG-3'；P2：5'-CCTTTACGCCCAGTCATTCC-3'）和探針Probe-P3（FAM-5'- AGGGTGCGAGCGT-3'-MGB）。引物和探針由Invitrogen公司合成。

1.2.2 DNA提取 利用Kingfisher全自動核酸提取儀，參照磁珠法核酸提取試劑盒說明書，提取HPS、豬鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157及疑似HPS感染樣品的DNA。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)模板建立 復(fù)壯pGEM-T/HPS 重組質(zhì)粒的工程菌，利用DNA小量純化試劑盒提取重組質(zhì)粒，用分光光度計測定OD260、OD280及OD260/OD280值，共重復(fù)5 次；參考Kim等[11]介紹的方法計算其濃度，定量并稀釋至1.0×1010拷貝/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 用矩陣法對FQ-PCR循環(huán)參數(shù)、引物和探針濃度，以及所選引物與探針的組合等進(jìn)行篩選優(yōu)化，得到最佳的熒光定量PCR反應(yīng)條件。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 用含1.0×1010拷貝/μL pGEM-T/HPS重組質(zhì)粒作標(biāo)準(zhǔn)品，10倍系列稀釋成 1.0×101～1.0×109拷貝 /μL，共 9 個稀釋度，以不同濃度的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行FQ-PCR檢測。以起始模板數(shù)的對數(shù)為X軸，以FQ-PCR循環(huán)次數(shù)Ct值為Y軸作回歸曲線，建立HPSFQ-PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 特異性試驗 按照1.2.4中確定的最佳反應(yīng)體系和條件，以1.2.2中提取的HPS、豬鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157的DNA為模板進(jìn)行FQ-PCR檢測，并設(shè)空白對照，以檢驗本方法的特異性。

1.2.7 敏感性試驗 利用本研究建立的HPS FQPCR方法對101～106拷貝/μL的HPS重組質(zhì)粒進(jìn)行敏感性擴(kuò)增試驗，同時與HPS常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較。

1.2.8 重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗 利用本研究建立的HPS FQ-PCR方法，對3個不同濃度（1.0×106～1.0×108拷貝 /μL）的 pGEM-T/HPS 重組質(zhì)粒，分別設(shè)3個重復(fù)，分3個批次進(jìn)行試驗，以檢驗該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.9 與常規(guī)PCR檢測靈敏度的比較 以pGEM-T/HPS重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，10倍系列稀釋成 1.0×100～1.0×106拷貝 /μL，以其為模板進(jìn) FQPCR，同時利用河南省動物疫病預(yù)防控制中心建立的常規(guī)PCR檢測方法進(jìn)行對照檢測，比較兩種方法的檢測靈敏度。

1.2.10 臨床應(yīng)用試驗 利用建立的HPS FQ-PCR方法，對1.2.2中提取的疑似HPS感染樣品DNA進(jìn)行檢測，并以pGEM-T/HPS為陽性對照、無菌雙蒸水為陰性對照，同時進(jìn)行常規(guī) PCR檢測，驗證二者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化及結(jié)果判定

采用矩陣法優(yōu)選引物和探針最佳濃度的結(jié)果表明，采用終濃度為0.5 μmol/L的引物和0.8 μmol/L的探針，對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，可獲得較小的反應(yīng)循環(huán)數(shù)（Ct值）和較大的熒光信號（△Rn）。FQPCR循環(huán)條件優(yōu)化結(jié)果表明，雙溫循環(huán)及60 ℃的退火溫度為最佳循環(huán)條件。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸40 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。在每個循環(huán)延伸結(jié)束時進(jìn)行熒光信號檢測，熒光模式設(shè)為FAM/NONE標(biāo)記模式，Passive reference設(shè)為NONE。陰性對照的檢測結(jié)果應(yīng)無特定的擴(kuò)增曲線，且Ct值＞38.0或無，陽性對照Ct值≤25.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，判定檢測結(jié)果成立。在檢測結(jié)果成立的前提下，若樣品檢測結(jié)果Ct值≤36.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，判定為陽性；Ct值＞38.0或無，且無特定的擴(kuò)增曲線，判定為陰性；38.0≥Ct值＞36.0且有特定擴(kuò)增曲線，樣品判定為可疑，需重復(fù)驗證。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)pGEM-T/HPS重組質(zhì)粒（1.0×101～1.0×106拷貝 /μL）為模板進(jìn)行 FQPCR檢測，根據(jù)檢測結(jié)果所計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.998，斜率為-3.62，截距為38.88，從而可以得出拷貝數(shù)（X）與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式為：Ct= -3.62×logX+38.88。將由儀器讀取的Ct值代入上述表達(dá)式，即可算出初始拷貝數(shù)。

圖1 HPS熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性試驗

特異性試驗結(jié)果顯示，以pGEM-T/HPS重組質(zhì)粒為陽性對照，有熒光信號，而豬鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157等對照病原體、陰性對照無熒光響應(yīng)（圖2），說明所建立的HPS FQ-PCR檢測方法具有好的特異性。

2.4 穩(wěn)定性和重復(fù)性

以 3 個濃度（1.0×106～1.0×108拷貝 /μL）的pGEM-T/HPS重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次重復(fù)測定。結(jié)果顯示，批內(nèi)試驗和批間試驗的Ct值差異極小，變異系數(shù)均小于0.1（圖3、表1），表明該方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖2 HPS 熒光定量PCR特異性試驗

圖3 HPS熒光定量PCR重復(fù)性試驗

表1 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 與常規(guī)PCR檢測靈敏度比較

以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)pGEM-T/HPS重組質(zhì)粒（1.0×100～1.0×106拷貝/μL）為模板進(jìn)行FQ-PCR檢測，當(dāng)重組質(zhì)粒濃度稀釋為1.0×101拷貝/μL時，能夠出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，但質(zhì)粒濃度稀釋為1.0×100拷貝/μL時，未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，表明該方法的靈敏度為1.0×101拷貝/μL（圖4）。采用常規(guī)PCR方法檢測，當(dāng)模板重組質(zhì)粒濃度稀釋為1.0×102時能擴(kuò)增出條帶，但稀釋到1.0×101時不能擴(kuò)增出條帶，說明常規(guī)PCR方法檢測的極限靈敏度為1.0×102拷貝/μL（圖5），表明FQ-PCR方法的檢測靈敏度是常規(guī)PCR檢測方法的10倍。

圖4 HPS 熒光定量PCR敏感性試驗

圖5 HPS PCR敏感性試驗

2.7 與商品化試劑盒及常規(guī) PCR方法比較

利用所建立的HPS FQ-PCR方法對疑似HPS感染的30份組織樣品進(jìn)行檢測，并與常規(guī)PCR進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，HPS FQ-PCR檢出19份陽性，而商品化的 HPS FQ-PCR檢測試劑盒和HPS 常規(guī) PCR均檢出17份陽性。對HPS FQ-PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，序列比對結(jié)果證明19份陽性產(chǎn)物均為HPS基因片段，表明本研究建立的HPS FQ-PCR方法可用于臨床樣品檢測，并且敏感性高于商品化的 HPS FQ-PCR檢測試劑盒及常規(guī)PCR檢測方法。

3 討論

HPS是現(xiàn)階段造成我國哺乳和保育階段仔豬死亡的重要原發(fā)或繼發(fā)病原，特別是在飼養(yǎng)管理條件不好的豬場能夠造成豬只大量死亡，給豬場帶來較大經(jīng)濟(jì)損失[12]。由于HPS各血清型之間存在交叉反應(yīng)，血清學(xué)方法的準(zhǔn)確性得不到保證。而HPS的實驗室分離培養(yǎng)又比較困難，所以很有必要建立一種快速、敏感，特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的HPS檢測方法。吳靜波等[13]建立的HPS PCR方法的靈敏度為100 拷貝/μL；苗立中等[14]建立的HPS SYBR Green I FQ-PCR檢測方法，特異性良好、敏感性高。FQ-PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性好、操作簡單快捷等優(yōu)點，給檢測工作帶來很大便利。FQ-PCR技術(shù)分為染料法和探針法兩種。Jamnikar等[15]對染料法和探針法進(jìn)行了比較，認(rèn)為探針法用于定量比SYBR Green I 染料法更準(zhǔn)確。與傳統(tǒng)TaqMan探針比較，探針3端加上MGB，使探針長度縮短，可使探針的Tm值提高10 ℃左右，提高配對與非配對模板間的Tm值差異；由于探針3端的Quencher基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并且與Report基團(tuán)的空間位置更接近，從而可以使試驗結(jié)果更精確，敏感性更高，而且試驗條件優(yōu)化后，步驟簡單，重復(fù)性大大提高[16]。

4 結(jié)論

本研究以HPS 16S rRNA序列為模板設(shè)計1對特異性引物和1條TaqMan-MGB探針，通過對FQ-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，可從pGEM-T/HPS重組質(zhì)粒中檢測出陽性，而其他4種病原對照均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，對質(zhì)粒模板最低檢出濃度為10 拷貝/μL，與常規(guī)PCR 檢測結(jié)果相比，敏感性高約10倍，表明該方法具有較好的特異性和敏感性。批內(nèi)試驗和批間試驗的Ct值差異極小，變異系數(shù)均小于0.1，表明穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。在30份臨床疑似HPS感染的組織樣品中檢出了陽性樣品，比常規(guī) PCR的陽性檢出率高，表明本研究所建立的方法適用于臨床樣品的快速檢測。本方法的建立對于HPS的快速診斷、綜合防控及凈化等具有重要意義。