腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展

馬步鵬，陳曉波，吳志宏

（1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，3中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，4中國(guó)再生醫(yī)學(xué)國(guó)際集團(tuán)，北京100730）

1 腫瘤干細(xì)胞概述

在對(duì)白血病的研究過(guò)程中，研究人員提出并逐步證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）理論。在1937年，F(xiàn)urth等［1］將白血病小鼠的細(xì)胞種植到同系正常小鼠內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)約5%的移植實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虺晒Α?963年，Bruce等［2］首次在體內(nèi)對(duì)具有克隆形成能力的淋巴瘤細(xì)胞的比例進(jìn)行定量檢測(cè)，顯示大約1%的移植細(xì)胞具有克隆形成能力。1997年，Bonnet等［3］從白血病患者體內(nèi)分離出一類表面標(biāo)志為CD34＋CD38－的細(xì)胞，此類細(xì)胞具有明顯的增殖分化、自我更新能力，可在非肥胖型糖尿?。匕Y聯(lián)合免疫缺陷（non?obese diabetes／serve combined immunodeficiency，NOD／SCID）小鼠體內(nèi)形成白血病。而其它類型的白血病細(xì)胞不能在NOD／SCID小鼠體內(nèi)長(zhǎng)出腫瘤。因此，這證實(shí)了白血病干細(xì)胞（leukemia stem cell，LSC）的存在，并明確地提出了“白血病干細(xì)胞”的概念。

在此之后，在實(shí)體腫瘤中，如乳腺癌［4］、腦瘤［5］、結(jié)腸癌［6］、胰腺癌［7］、惡性黑色素瘤［8］、肝癌［9］、肺癌［10］、前列腺癌［11］和卵巢癌［12］、胃癌［13］等，相繼成功分離出了CSC。

CSC具有以下幾個(gè)特點(diǎn)。（1）無(wú)限的自我更新能力：CSC能夠產(chǎn)生與親代完全相同的子代細(xì)胞，并通過(guò)自我更新維持著腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)。（2）分化潛能：CSC能夠產(chǎn)生不同分化的子代瘤細(xì)胞。（3）高致瘤性，即很少量的CSC即能在體外培養(yǎng)生成集落，很少量的CSC注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)即可形成腫瘤，而一般腫瘤細(xì)胞形成腫瘤非常困難，或需要大量細(xì)胞。（4）耐藥性，CSC具有耐藥性有幾個(gè)原因：①多數(shù)CSC處于靜止或休眠狀態(tài)，不處在細(xì)胞的分裂期；②CSC膜上多數(shù)表達(dá) ATP?binding cassette（ABC）家族膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這類蛋白大多可運(yùn)輸并外排包括代謝產(chǎn)物、藥物、毒性物質(zhì)、內(nèi)源性脂類物質(zhì)、多肽、核苷酸及固醇類等多種物質(zhì)，使之對(duì)許多化療藥物產(chǎn)生耐藥。③CSC的DNA修復(fù)能力非常強(qiáng)大。目前認(rèn)為CSC的存在是導(dǎo)致腫瘤化療和放療失敗的主要原因［15］。

2 CSC的研究進(jìn)展

在過(guò)去的幾年中，CSC研究領(lǐng)域的重點(diǎn)已從利用培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系的研究轉(zhuǎn)移到利用新鮮分離的腫瘤樣本和早期代數(shù)腫瘤細(xì)胞的異種移植的研究。越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到異種移植實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)CSC存在的關(guān)鍵［16］。這里，我們綜述這一快速發(fā)展領(lǐng)域內(nèi)的幾個(gè)方面的近期進(jìn)展情況，包括CSC的各種不同表型、個(gè)體腫瘤中存在的多個(gè)CSC群、CSC的遺傳進(jìn)化能力、非腫瘤干細(xì)胞（non?CSC）轉(zhuǎn)化成 CSC的潛力等。這些研究結(jié)果突顯出了CSC的動(dòng)態(tài)本質(zhì)。

2．1 CSC的不同表型 CSC必須通過(guò)異種移植而非單獨(dú)通過(guò)免疫學(xué)表型來(lái)進(jìn)行功能上的界定。許多免疫標(biāo)記分子已被證實(shí)可用于標(biāo)記從多種白血病和實(shí)體瘤中分離富含CSC的細(xì)胞亞群，這些標(biāo)記分子包括 CD133、CD44、EpCAM、ALDH 等（表 1）［17］。 如，對(duì)白血病而言，CD34、CD38和IL3Ra的組合可有效分離出潛在的LSC。但必須指出的是，這些標(biāo)記并非完全為L(zhǎng)SC所特有。

表1 鑒定和富集血液腫瘤和實(shí)體瘤CSC的常用免疫標(biāo)記分子

越來(lái)越多的證據(jù)表明：即使腫瘤屬于同一亞型，不同患者的干細(xì)胞表型也不相同。如在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，CD133、SSEA?1／CD15／LewisX、CD133／α6?整合素均被證實(shí)可作為 CSC 的標(biāo)記分子［18－20］；在乳腺癌中，盡管CD44和CD24已經(jīng)廣泛用于分離CSC，但在 ER?陰性和triple陰性的乳腺癌中，CD44和CD24并無(wú)法選擇性地富集 CSC，因?yàn)樵贑D44＋CD24?和 CD44＋CD24＋細(xì)胞群體中均發(fā)現(xiàn) CSC 的存在［21］。 同時(shí)，分別用 ALDHhi和 CD44hiCD24lo富集的同一乳腺癌的干細(xì)胞群體幾乎沒(méi)有重疊［22］。類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在直腸癌中，EPCAMhiCD44＋的CSC亞群和 CD133＋亞群僅有很小部分重疊［23］。

同一腫瘤類型來(lái)源的干細(xì)胞表型之間有限重疊反映了多個(gè)CSC群的存在。這種有限重疊或者是由所用技術(shù)的不同所致：如酶解條件的不同；使用培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞或者原代分選的細(xì)胞；多次傳代的細(xì)胞或早期傳代細(xì)胞等。另一個(gè)干擾因素為是否進(jìn)行嚴(yán)格的連續(xù)異種移植以驗(yàn)證CSC的自我更新能力。

盡管如此，不同標(biāo)記的組合仍可以提高分離CSC的效率。例如，CD44的表達(dá)結(jié)合酪氨酸激酶受體c?Met的高水平表達(dá)提供了胰腺癌干細(xì)胞的強(qiáng)有力的選擇［24］；ALDH高表達(dá)再結(jié)合CD133的表達(dá)可富集卵巢癌干細(xì)胞［25］。

2．2 腫瘤內(nèi)CSC的高度可變比例 由于異種移植，生長(zhǎng)因子及其受體的種屬差異以及免疫識(shí)別的水平，大多數(shù)人類腫瘤中CSC的真實(shí)比例可能被低估。然而在很多實(shí)體腫瘤中，即使在更寬容的條件下測(cè)定其比例，CSC 的含量仍舊很低［26－27］。 CSC 在漿液性卵巢癌中比例非常低（＜0．04%），并且不同患者的差異非常明顯［26］。與之類似，在異種移植條件下對(duì)LSC的評(píng)估表明 LSC的比例范圍變化很大，為1 ／103～1／106［27］。

但是，CSC并非總是腫瘤細(xì)胞的一小部分。在特定的同系小鼠淋巴瘤和白血病模型中發(fā)現(xiàn)了較高比例的白血病干細(xì)胞，而在上皮性腫瘤和其他實(shí)體瘤的小鼠模型中，干細(xì)胞比例較低［28］。

“克里斯蒂娜，加油?！卑瑺柡暗?，低沉的聲音出奇的大。她看著他。艾爾拍著手，大聲喊道，“加油，繼續(xù)抓住欄桿，加油，你可以做到的！抓住欄桿。”

雖然目前利用 NOD／SCID／IL2Rγnull小鼠來(lái)測(cè)定CSC的比例比之前利用NOD／SCID小鼠更為準(zhǔn)確，但依然只能相對(duì)衡量小鼠體內(nèi)CSC的比例［16］。理想的動(dòng)物模型應(yīng)準(zhǔn)確地模擬人體內(nèi)CSC的生存環(huán)境。

盡管如此，測(cè)定CSC的比例仍然是有實(shí)際意義的。CSC比例的增加通常意味著更高的侵襲能力［29－30］。

2．3 CSC 表型的不穩(wěn)定性 已有報(bào)道［20，26］表明CSC的免疫分型在原發(fā)性腫瘤不同于其在異種移植腫瘤。大多數(shù)的原發(fā)漿液性卵巢癌包含CD133＋干細(xì)胞，而移植瘤中卻含大量 CD133－的CSC［26］。 原發(fā)腫瘤和異種移植腫瘤之間的這種差異提示遺傳學(xué)改變可促使腫瘤的發(fā)展，雖然這種差異不能排除由多種亞克隆的預(yù)先存在所致。這些數(shù)據(jù)不僅可以反映CSC的異質(zhì)性，也提示CSC的表型在異種移植中可能無(wú)法穩(wěn)定的傳代［26］。雖然在卵巢癌和乳腺癌的移植瘤中，干細(xì)胞頻率保持不變［20，26］，但已觀察到干細(xì)胞的比例在多次移植中有所增加，從而強(qiáng)調(diào)了CSC的不穩(wěn)定性［25，29］，也提示了 non?CSC 向 CSC 轉(zhuǎn)化的可能性。

2．4 同一腫瘤中可以存在多個(gè)CSC群 腫瘤組織中可含有多個(gè)不同的CSC群。通過(guò)檢測(cè)CD34，CD38和／或IL3Ra的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)不同的LSC群。在大多數(shù)AML患者中，兩個(gè)不同的LSC群可以共存。這些群體更接近于正常祖細(xì)胞亞型，而非正常造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell， HSC），提示這些祖細(xì)胞異常地獲得了干細(xì)胞的某些特性［32］。通過(guò)對(duì)大量AML患者的研究［28，33］發(fā)現(xiàn)：在祖細(xì)胞和更原始的造血干細(xì)胞樣的組分中均包含LSC。這些現(xiàn)象表明在患者樣本中LSC存在很大的異質(zhì)性。至少在一部分患者中，不同LSC亞群存在著層次關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)表明LSC可以去分化或者表型相互轉(zhuǎn)化。

同一腫瘤中存在多個(gè)CSC群現(xiàn)象的最可能的原因是原先的腫瘤（干）細(xì)胞獲得了新的突變或表觀遺傳學(xué)的改變，從而形成了一種新的CSC。在腫瘤細(xì)胞克隆進(jìn)化等級(jí)模型中，早期體細(xì)胞突變（“主干枝”突變）傾向于在多個(gè)甚至全部克隆中發(fā)生，而后發(fā)突變僅在某些克隆中發(fā)生（“進(jìn)化枝”突變）。發(fā)病機(jī)制相關(guān)的驅(qū)動(dòng)突變往往發(fā)生于早期，而更混雜的進(jìn)化枝突變可能賦予腫瘤的額外特征［34］。

2．5 腫瘤細(xì)胞的可塑性 腫瘤細(xì)胞的可塑性是指non?CSC可以轉(zhuǎn)化為CSC，即CSC和其分化的子代細(xì)胞間可能產(chǎn)生相互轉(zhuǎn)化。

特殊微環(huán)境中的生長(zhǎng)因子或應(yīng)激因素可以誘導(dǎo)某些分化的腫瘤細(xì)胞向CSC轉(zhuǎn)化。如腸癌中HGF可使non?CSC向CSC樣表型轉(zhuǎn)化［35］。由低氧微環(huán)境所誘導(dǎo)的HIF2a可以維持成膠質(zhì)細(xì)胞瘤并促進(jìn)非干細(xì)胞（CD133－）向干細(xì)胞樣細(xì)胞（CD133＋）轉(zhuǎn)化［36］。另外，正如間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化（mesenchymal?epithelial transition，MET）和上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition， EMT）的現(xiàn)象在胚胎發(fā)生過(guò)程中廣泛存在一樣，這一現(xiàn)象也存在于腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中：上皮樣的腫瘤細(xì)胞（可能是non?CSC）可以在周圍環(huán)境的作用下（如 TGF?β 和Wnt信號(hào)），轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞（干細(xì)胞樣細(xì)胞），引發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移；（干細(xì)胞樣的）間質(zhì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至特定部位后，又轉(zhuǎn)化為上皮樣腫瘤細(xì)胞［37］。

non?CSC和CSC的雙向轉(zhuǎn)化并不包含于目前的CSC模型中。實(shí)際上，即使存在這種可塑性，依然不能削弱CSC的概念：在一個(gè)腫瘤細(xì)胞群體的任何時(shí)刻，依然存在表型和功能不同的CSC亞群和non?CSC亞群，不管是否存在中間類型的轉(zhuǎn)化細(xì)胞［38］。

但是，如果這種雙向轉(zhuǎn)化高頻率的存在，則CSC模型的意義大大縮減了：區(qū)分是否是CSC已經(jīng)不重要了。 到目前為止的研究［35－38］表明，這種高頻率的雙向轉(zhuǎn)化并不存在，CSC以一種比較穩(wěn)定的狀態(tài)存在，它們可以無(wú)限制地保持干細(xì)胞狀態(tài)；而且non?CSC向CSC的轉(zhuǎn)化，在大多數(shù)情況下，發(fā)生的概率很低，在某些腫瘤中，也許并不存在。這提示不同類型的腫瘤中non?CSC具有不同的轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞的能力［38］。

盡管這種可塑性目前看來(lái)只是以較小的概率發(fā)生，但仍然會(huì)對(duì)腫瘤治療帶來(lái)巨大的影響。目前的腫瘤治療（放、化療）主要針對(duì)處于生長(zhǎng)周期的分化的non?CSC，而不是CSC。因此，發(fā)展針對(duì)CSC的治療方案是非常必要和急需的。但是，如果non?CSC能夠轉(zhuǎn)化為CSC，則只針對(duì)CSC的治療方案也將是不完善的，因?yàn)榇婊畹膎on?CSC依然可以轉(zhuǎn)化為CSC，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此，如果將來(lái)真正能治愈腫瘤的方案能夠?qū)崿F(xiàn)，那么這種治療方案應(yīng)該既針對(duì)CSC，又針對(duì) non?CSC。

研究發(fā)現(xiàn)如果一個(gè)腫瘤的CSC比例越高，越容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后越差，說(shuō)明CSC與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。由于CSC的耐藥性，傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物不能有效殺滅CSC，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療失敗。因此，只有殺滅CSC，才能達(dá)到根治腫瘤的目的。

3 針對(duì)CSC的治療方案

根據(jù)CSC的特點(diǎn)，可以通過(guò)以下策略來(lái)發(fā)展以CSC為靶標(biāo)的治療方案：①刺激靜止的CSC進(jìn)入細(xì)胞周期，導(dǎo)致其分裂和分化，從而使其對(duì)化療或放療敏感。例如，細(xì)胞因子G?CSF能夠有效地誘導(dǎo)AML的“休眠”的白血病干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，G?CSF與化療的結(jié)合治療能有效地誘導(dǎo)LSC的凋亡和去除［39］。②抑制CSC的DNA修復(fù)機(jī)制，結(jié)合放療或化療可使CSC的DNA損傷，易于凋亡。③針對(duì)CSC特異的自我更新機(jī)制，研發(fā)針對(duì)CSC特定信號(hào)通路的治療。這一策略的關(guān)鍵是找出特異性抑制CSC自我更新或生存的同時(shí)不危害正常組織干細(xì)胞和其它正常組織的試劑。事實(shí)上，某些已有的藥品可能正是在這個(gè)方面發(fā)揮了作用。例如維A酸通過(guò)抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）干細(xì)胞自我更新并誘導(dǎo)其分化凋亡治療APL，而維A酸對(duì)正常造血干細(xì)胞幾乎沒(méi)有影響。④研發(fā)針對(duì)CSC特異的表面標(biāo)記的單克隆抗體。例如針對(duì)AML干細(xì)胞的抗 CD44、IL?3R 抗體等［40－41］。

在新藥研發(fā)平臺(tái)中，使用小分子藥物、miRNA或siRNA文庫(kù)進(jìn)行高通量篩選已成為熱點(diǎn)領(lǐng)域。應(yīng)用針對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的小分子藥物庫(kù)高通量篩選，找出了以前未被作為抗癌藥物的一類化合物——salino?mycin（鹽霉素），它能減緩乳腺癌的生長(zhǎng)及肺轉(zhuǎn)移，可能直接作用于乳腺癌干細(xì)胞［42］。以microRNA為基礎(chǔ)的療法正在成為腫瘤治療的新型模式。值得一提的是，miR?34靜脈給藥能夠抑制小鼠前列腺癌的轉(zhuǎn)移并延長(zhǎng)存活時(shí)間［43］。 這與 miR?34以 CD44（前列腺癌干細(xì)胞上高表達(dá)的表面標(biāo)記）為靶標(biāo)相關(guān)。

最后，必須再次提及non?CSC向CSC轉(zhuǎn)化的可能，因此對(duì)于大多數(shù)腫瘤而言，新型抗CSC的療法必須與傳統(tǒng)的針對(duì)non?CSC的治療（如化療）相結(jié)合，才是最終治愈腫瘤之道。

4 CSC研究的意義

隨著CSC在更多的不同腫瘤組織中分離成功，更有力地證明了CSC的存在，同時(shí)為深入探討腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及評(píng)價(jià)預(yù)后等提供了新的理論依據(jù)，也為腫瘤的治療帶來(lái)了新的思路。

研究發(fā)現(xiàn)如果一個(gè)腫瘤的CSC比例越高，越容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后越差，說(shuō)明CSC與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。由于CSC的耐藥性，傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物不能有效殺滅CSC，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療失敗。因此，只有殺滅CSC，才能達(dá)到根治腫瘤的目的。