高產(chǎn)舍雷肽酶的粘質(zhì)沙雷氏菌誘變選育

梅建鳳, 蔡少芬, 李靚, 易喻, 應(yīng)國清

1(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州，310014) 2(浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司，浙江 杭州，310012)

舍雷肽酶(serrapeptase，serratiopeptidase或serralysin)，又稱沙雷肽酶、沙雷蛋白酶等，是一種堿性蛋白水解酶。該酶最初是從腸桿菌粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)E15中分離出的一種胞外酶[1-3]，因其強(qiáng)大的抗炎活性，被人們稱之為“奇跡之酶”。舍雷肽酶具有良好的抗炎、抗腫脹、促進(jìn)痰液、膿液溶解與排泄以及鎮(zhèn)痛作用，臨床用于手術(shù)后及外傷的消炎、副鼻竇炎、乳汁潴留性乳腺炎、膀胱炎、附睪炎、智齒周圍炎及牙槽膿腫時(shí)的消炎，以及治療支氣管炎、肺結(jié)核、支氣管哮喘時(shí)痰液不易咳出等[4-5]。早在19世紀(jì)70年代就在日本上市，隨后在歐洲、亞洲等多個(gè)國家上市[6]，因出色的功效和無副作用，近年來，該酶作為輔助藥物和保健食品市場需求旺盛。

舍雷肽酶主要由粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)，目前主要生產(chǎn)國家是日本和印度，國內(nèi)雖有一些企業(yè)在銷售舍雷肽酶，但并非采用粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵，而是采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵，嚴(yán)格來說，此類產(chǎn)品不能稱為舍雷肽酶。李靚[7]已從家蠶腸道中分離獲得1株產(chǎn)舍雷肽酶的粘質(zhì)沙雷氏菌，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，酶活單位達(dá)到1 000 U/mL以上，但隨著菌種的傳代使用，產(chǎn)酶活力逐漸下降至500 U/mL左右。為了提高和穩(wěn)定該菌株的產(chǎn)酶能力，實(shí)驗(yàn)采用紫外線和微波對該菌株進(jìn)行連續(xù)誘變，篩選高產(chǎn)且傳代穩(wěn)定的舍雷肽酶突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)LL-413菌株，從家蠶(Bombyxmori)腸道內(nèi)分離，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC M2015780。

1.1.2 試劑與儀器

酪蛋白：生物試劑，百奧萊生物試品有限公司；酪氨酸：生物試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；福林酚試劑：分析純，上海滬試化工有限公司；以及其他普通分析純試劑或生物試劑。

紫外-可見分光光度計(jì)(UV2600型)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(LS-B50L型)，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱(SPX-250B型)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床(HWY-2112型)，上海智城分析儀器制造有限公司；微波爐(G8023CTL-K3型)，中山格蘭仕家用電器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基(g/L)：麥芽浸粉12.2，牛肉膏6.6，酵母浸出粉11.0，NaCl 5.0，MgSO4·7H2O 1.0，瓊脂20.0，pH 8.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。種子和產(chǎn)酶培養(yǎng)基除不加瓊脂外，其他成分同平板培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝50 mL種子或產(chǎn)酶培養(yǎng)基，8層紗布扎口，121 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 酶活的測定

采用Folin-酚法測定舍雷肽酶的活力[8]。發(fā)酵液離心后，上清液經(jīng)過適當(dāng)倍數(shù)稀釋后待測，取1 mL酶液和1 mL酪蛋白溶液(20 g/L，pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制)于試管中，充分混合后于37 ℃水浴中保溫10 min，再加入2 mL的三氯乙酸(TCA，0.4 mol/L)終止反應(yīng)，繼續(xù)水浴保溫20 min，經(jīng)8 000×g離心5 min。取1 mL上清液，加入5 mL的Na2CO3(0.4 mol/L)和1 mL福林酚試劑，37 ℃水浴保溫顯色30 min，以TCA滅活的酶液相同處理為參比，測定A660，依據(jù)酪氨酸濃度-A660標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶解液中酪氨酸濃度，再按舍雷肽酶的活力定義計(jì)算發(fā)酵液中舍雷肽酶的活力。舍雷肽酶活力的定義：在37 ℃反應(yīng)條件下，1 min水解質(zhì)量濃度為20 g/L的酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的所需的酶量(mL)為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。

1.2.2 菌種誘變

菌懸液的制備：取培養(yǎng)至對數(shù)生長期(16 h)的培養(yǎng)液1 mL，離心收集菌體，加入等量無菌生理鹽水重懸菌體，再次離心收集菌體，重復(fù)2次。用100 mL無菌生理鹽水重懸菌體于三角瓶中，加入1根無菌回形針于磁力攪拌器上攪拌20 min后備用。

紫外線誘變[9]：直徑9 cm無菌培養(yǎng)皿7副，分別加入制備好的菌懸液2 mL。打開培養(yǎng)皿蓋，在距離15 W紫外燈30 cm處邊攪拌邊照射，分別照射0、40、60、80、100、120、140 s。完畢后將各菌液用生理鹽水稀釋至103～105倍，取0.1 mL稀釋菌液涂布平板，平板黑布包裹于30 ℃下培養(yǎng)24 h。

微波誘變[10]：微波爐高火預(yù)熱和殺菌消毒5 min，5 mL菌懸液于試管中，試管于冰水浴中，在微波爐800 W的功率下處理0、40、60、80、100、120、140 s。完畢后將各菌液用生理鹽水稀釋103～105倍，取0.1 mL稀釋菌液涂布平板，于30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 菌株的初篩與復(fù)篩

初篩：選取致死率90%以上的平板，挑取菌落轉(zhuǎn)接平板培養(yǎng)24 h后，挑取菌體接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基(不做重復(fù)樣)，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液4 ℃、8 000×g離心5 min，測定上清液舍雷肽酶活力。

復(fù)篩：接種初篩獲得的菌株菌體至種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后，按5%的體積比接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后測定舍雷肽酶的活力，每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)

將誘變后的菌株以及原始菌株LL-413在平板培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，每代菌體都經(jīng)過種子擴(kuò)培和產(chǎn)酶培養(yǎng)(3個(gè)重復(fù))，測定產(chǎn)酶活力，傳代4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變

2.1.1 紫外線誘變的致死率

測定粘質(zhì)沙雷氏菌在30 ℃、180 r/min條件下的生長曲線，培養(yǎng)16 h進(jìn)入對數(shù)生長的中期，制備的菌體經(jīng)不同時(shí)長的紫外線照射，測得紫外線誘變的致死率見圖1。

圖1 紫外線照射對粘質(zhì)沙雷氏的致死率Fig.1 Fatality rate of Serratia marcescens irradiated by UV

由圖1可以看出，隨著紫外線照射時(shí)間的延長，致死率逐漸增加，當(dāng)照射100 s時(shí)，致死率91.4%。一般認(rèn)為致死率在90%～99.9%時(shí)，誘變效果較好[11]，所以從紫外線照射時(shí)長100 s以上誘變后的平板中挑取突變株。

2.1.2 紫外線誘變菌種的篩選

從紫外線照射時(shí)長100 s以上誘變后的平板中挑取突變株50株，誘變菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)24 h后測定舍雷肽酶活力，從中選取酶活提高30%的10個(gè)突變菌株進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩的10個(gè)菌株產(chǎn)舍雷肽酶的活性見表1。

表1 紫外線誘變突變菌種的復(fù)篩產(chǎn)酶活力Table 1 Serrapeptase activity of the strains after the 1st UV mutation in re-screening

經(jīng)過復(fù)篩后，UV1-26、UV1-37和UV1-39菌株的產(chǎn)酶活力提高幅度較大，且均達(dá)到了極顯著差異水平(p<0.01)，其中UV1-39突變菌株不產(chǎn)靈菌紅素，菌落呈乳白色(圖2)。不產(chǎn)靈菌紅素菌株發(fā)酵生產(chǎn)舍雷肽酶，有利于提高酶產(chǎn)品的外觀品質(zhì)，在篩選產(chǎn)酶活力提高的前提下，優(yōu)先選擇此類突變株。

圖2 UV1-39株紫外誘變菌株和出發(fā)菌株LL-413菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain UV1-39 and strain LL-413

2.1.3 二次紫外線誘變菌株的篩選

對復(fù)篩后的3株菌株再次用紫外線照射100 s，誘變后UV1-39為出發(fā)菌株長出的菌落均不產(chǎn)靈菌紅素，UV1-26和UV1-37為出發(fā)菌株長出的菌落也有少數(shù)不產(chǎn)靈菌紅素。從UV1-39平板中挑取了18株不產(chǎn)靈菌紅素的突變菌株，產(chǎn)酶培養(yǎng)24 h后檢測舍雷肽酶活力。從中選取產(chǎn)酶活力提高15%的6個(gè)突變菌株進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩的6個(gè)菌株產(chǎn)舍雷肽酶活力見表2。

表2 二次紫外線誘變突變菌種的復(fù)篩產(chǎn)酶活力Table 2 Serrapeptase activity of the strains after the 2nd UV mutation in re-screening

從表2可知，UV2-6產(chǎn)酶活力提高幅度較大，且達(dá)到了極顯著差異水平(p<0.01)，較其出發(fā)菌株UV1-39提高了18.1%，較原始出發(fā)菌株LL-413提高了37.9%，該菌株不產(chǎn)靈菌紅素，所以選其作為進(jìn)一步微波誘變的出發(fā)菌株。

2.2 微波誘變

2.2.1 微波誘變的致死率

以UV2-6為出發(fā)菌株，在設(shè)定微波功率為800 W的條件下，采用不同時(shí)長的微波輻射，測定微波誘變對粘質(zhì)沙雷氏菌的致死率，結(jié)果見圖3。

圖3 微波輻射對粘質(zhì)沙雷氏的致死率Fig.3 Fatality rate of Serratia marcescens irradiated by microwave

隨著微波輻射時(shí)間的增加，菌體死亡率不斷的提高。輻射100 s時(shí)致死率為90.8%，所以從微波輻射時(shí)長100 s以上誘變后的平板中挑取突變株。

2.2.2 微波誘變突變菌種的篩選

從微波輻射時(shí)長100 s以上誘變后的平板中挑取突變株30株，搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)24 h，測定各菌株產(chǎn)舍雷肽酶的活力，選取了產(chǎn)酶活力提高30%的10個(gè)菌株進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩的10個(gè)菌株產(chǎn)舍雷肽酶的活力見表3?？梢钥闯觯鄶?shù)菌株產(chǎn)酶活力提高的幅度較大，且均達(dá)到了極顯著差異水平(p<0.01)。產(chǎn)酶活力提高30%的菌株有7株，說明微波對粘質(zhì)沙雷氏菌誘變提高舍雷肽酶的效果非常顯著。

表3 微波誘變突變菌種的復(fù)篩產(chǎn)酶活力Table 3 Serrapeptase activity of the strains after micro-wave mutation in re-screening

2.3 突變菌株的傳代穩(wěn)定性

將經(jīng)微波誘變后的MW-4，MW-6，MW-7，MW-9，MW-11，MW-14，MW-21，與原始菌株LL-413一起在平板上劃線培養(yǎng)，傳代4次，且每代均做3個(gè)重復(fù)的搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)，檢測舍雷肽酶活力，結(jié)果見表4。

從表4以看出，原始菌株LL-413穩(wěn)定性較好，產(chǎn)舍雷肽酶活力穩(wěn)定；MW-4、MW-6、MW-11和MW-21菌株所產(chǎn)舍雷肽酶活力逐代下降；MW-9和MW-14兩個(gè)突變菌株產(chǎn)酶活力穩(wěn)定，分別為982 U/mL和956 U/mL，是原始菌株LL-413的1.98倍和1.92倍。

表4 突變菌株產(chǎn)舍雷肽酶活性的傳代穩(wěn)定性Table 4 Hereditary stability of the mutant strains for producing serrapeptase

3 結(jié)論

從家蠶腸道中分離的原始菌株粘質(zhì)沙雷氏菌LL-413，經(jīng)紫外線和微波連續(xù)誘變后，篩選到2株產(chǎn)舍雷肽酶活力提高較大的突變株MW-9和MW-14，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶活力分別為982 U/mL和956 U/mL，分別是原始菌株LL-413的1.98倍和1.92倍。目前，國內(nèi)未見關(guān)于利用粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)舍雷肽酶的研究報(bào)道；國外研究中，由粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)舍雷肽酶活力最高報(bào)道是2 155 U/mL[12]。

此外，突變菌株MW-9和MW-14在30℃下培養(yǎng)均不產(chǎn)靈菌紅素，發(fā)酵液不再是暗紅色，這一特性有利于改善成品舍雷肽酶的外觀顏色。