兩株具有緩解代謝綜合征功能的人源益生菌的安全性評價(jià)

朱廣素，王剛*，王園園，馬方勵(lì)，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州，510623)

人體腸道是一個(gè)多元化、充滿活力的微生態(tài)系統(tǒng)，為微生物的生長繁殖提供了絕佳的營養(yǎng)環(huán)境[1-2]。人體腸道菌群按照生理功能不同分為3類：共生菌、條件致病菌和病原菌[3]。雙歧桿菌屬和乳桿菌屬是腸道共生菌中重要的兩類菌，因其在促進(jìn)消化、改善胃腸道健康、增強(qiáng)腸道免疫、抑制致病菌生長、調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用，被作為益生菌，廣泛地用于膳食補(bǔ)充劑和特定的功能性食品[4-7]。

參照聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)/世界衛(wèi)生組織(WHO)和歐盟制定的益生菌安全性評估指南[8-9]，對于將作為益生菌使用的乳酸菌，需從以下步驟判斷其安全性：1)傳統(tǒng)的生理生化檢測，以確定其生物學(xué)分類及菌株培養(yǎng)等基本信息；2)體外致病基因檢測，確保該菌株無致病性基因；3)抗生素抗性實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌易位實(shí)驗(yàn)，檢測菌株是否具有耐性藥和轉(zhuǎn)移性；4)體內(nèi)致病性檢測，包括動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)。按照我國《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范2003版》[10]的要求，安全性毒理學(xué)評價(jià)實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)階段：1)急性毒性試驗(yàn)；2)遺傳毒性試驗(yàn)，30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，傳統(tǒng)致畸實(shí)驗(yàn)；3)亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)——90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)、繁殖試驗(yàn)、代謝試驗(yàn)；4)慢性毒性試驗(yàn)(包括致癌試驗(yàn))。對于有長期安全使用歷史的乳酸菌，可以先進(jìn)行第一、二階段的毒性試驗(yàn)，經(jīng)初步評價(jià)后，決定是否需要進(jìn)行下一階段的毒性試驗(yàn)。

本研究團(tuán)隊(duì)前期對來自中國不同地區(qū)長壽村健康人體糞便樣品中的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，研究了其耐酸耐膽鹽等生理生化特性及生理功能，并對其全基因組信息進(jìn)行了分析檢測。在上述研究的基礎(chǔ)之上，參照相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)要求[10-13]，對其中具有顯著緩解代謝綜合征功能的青春雙歧桿菌Z25和羅伊氏乳桿菌138-1進(jìn)行安全性評價(jià)，包括急性毒性實(shí)驗(yàn)、28 d短期毒理實(shí)驗(yàn)、致畸實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌移位實(shí)驗(yàn)，以確定其是否能作為安全、可食用的益生菌用于后續(xù)的產(chǎn)品研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

主要試劑：MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；生理鹽水，辰欣藥業(yè)股份有限公司；本研究所用試劑盒均購于南京建成生物技術(shù)公司；其他常用試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備：高溫高壓滅菌鍋，SANYO；厭氧工作站，Electrotek；大容量冷凍離心機(jī)，Thermo；冷凍干燥機(jī)，Virtis；多功能酶標(biāo)儀，Thermo；全自動脫水機(jī)，Leica；半自動切片機(jī)，Leica；全自動染色機(jī)，Leica；KD-160型電子秤，東莞百利達(dá)健康器材有限公司；精密電子天平EL3002，Mettler Toledo；電子分析天平BSA124S，Sartorius；CELLtac α型血球分析儀，NIHON KOHDEN；光學(xué)顯微鏡，OLYMPUS；正置生物顯微鏡，OLYMPUS；體視顯微鏡，OLYMPUS；游標(biāo)卡尺，成都成量工具集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)用菌株均來自于食品生物技術(shù)中心菌種保藏中心(Culture Collection of Food Microorganisms, CCFM)。青春雙歧桿菌Z25(CCFM8630)分離自湖北省鐘祥市95歲健康男性糞便，羅伊氏乳桿菌138-1(CCFM8631)分離自廣西省巴馬縣57歲健康女性糞便。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及適應(yīng)性喂養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中所使用動物為清潔級SD大鼠(雌雄各半)，體重180～220 g，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2014-0001。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，環(huán)境溫度為22±2 ℃，濕度為(55±5)%，光照為12 h光暗交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)、28 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和致畸實(shí)驗(yàn)的需要進(jìn)行隨機(jī)分組。除致畸實(shí)驗(yàn)外，實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，自由飲水，同室分籠飼養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 受試菌懸液的制備

將菌株接種于含0.5 g/LL-半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基中，置于厭氧工作站37 ℃活化兩代后用于制備動物實(shí)驗(yàn)所需凍干粉。將培養(yǎng)好的菌液以8 000×g離心20 min，無菌PBS緩沖液清洗菌體2遍，用100 g/L的脫脂乳、30 g/L海藻糖和30 g/L的蔗糖作為凍干保護(hù)劑重懸菌體，冷凍干燥制成菌粉，并對其進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。參照文獻(xiàn)報(bào)道[14]，用無菌生理鹽水將菌粉調(diào)整為2×108(低劑量)、2×109(中劑量)、2×1010CFU/mL(高劑量)，制備成3種劑量不同的菌懸液，用于后續(xù)動物實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

按照GB 15193.3—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》[11]和《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范2003版》[10]要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選取雌雄大鼠分為3組，每組雌雄各10只，分別為對照組、青春雙歧桿菌Z25高劑量組(BA-H)和羅伊氏乳桿菌138-1高劑量組(LR-H)。其中對照組大鼠灌喂滅菌凍干保護(hù)劑稀釋液，實(shí)驗(yàn)組大鼠灌喂益生菌稀釋液。每天定時(shí)經(jīng)口灌胃1次，劑量為2 mL/只，連續(xù)灌胃7 d。給予受試菌懸液后，觀察并記錄大鼠的行為、死亡情況和中毒表現(xiàn)等。在實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)，用KD-160型電子秤稱取并記錄動物體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠，進(jìn)行解剖檢查，記錄心、肝、脾、肺、腎變化并用精密電子天平EL3002稱重，計(jì)算臟器指數(shù)，出現(xiàn)病變時(shí)應(yīng)做病理組織學(xué)檢測。

1.4.3 28天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

按照GB 15193.22—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)28天經(jīng)口毒性試驗(yàn)》[12]和《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范2003版》[10]要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選取雌雄大鼠分為7組，每組雌雄各10只，分別為對照組、青春雙歧桿菌Z25低劑量組(BA-L)、青春雙歧桿菌Z25中劑量組(BA-M)、青春雙歧桿菌Z25高劑量組(BA-H)和羅伊氏乳桿菌138-1低劑量組(LR-L)、羅伊氏乳桿菌138-1中劑量組(LR-M)、羅伊氏乳桿菌138-1高劑量組(LR-H)。其中對照組大鼠灌喂滅菌凍干保護(hù)劑稀釋液，實(shí)驗(yàn)組大鼠灌喂不同劑量的益生菌稀釋液。每天定時(shí)經(jīng)口灌胃1次，劑量為2 mL/只，連續(xù)灌胃28 d。給予受試菌懸液后，觀察并記錄大鼠的行為表現(xiàn)、死亡情況和中毒體征等。在實(shí)驗(yàn)期間，用KD-160型電子秤稱取并記錄體重和攝食量，計(jì)算食物利用率；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，計(jì)算動物體重增長量、總攝食量和總食物利用率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠，進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類、血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)等血液學(xué)指標(biāo)測定；進(jìn)行血生化檢查，測定指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血蛋白(ALB)、總蛋白(TP)；先對高劑量組和對照組大鼠進(jìn)行臟器組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較低劑量組相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查，檢測臟器包括心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸。

1.4.4 致畸實(shí)驗(yàn)

按照GB 15193.14—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)致畸試驗(yàn)》[13]和《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范2003版》[10]要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選取健康、性成熟清潔級SD大鼠，1∶1合籠交配，飼料為大鼠營養(yǎng)繁殖飼料，自由飲水。每日對雌鼠檢查陰栓，查出陰栓當(dāng)日作為受孕0 d，用KD-160型電子秤稱量體重。孕鼠分籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分為7組，每組12只。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置同1.4.3，在孕期第7～16天，每天定時(shí)經(jīng)口灌胃1次，根據(jù)母體體重調(diào)整灌胃體積；在母鼠受孕的第0，7，12，16，20天用KD-160型電子秤稱體重。

于大鼠孕第20天麻醉放血處死孕鼠，迅速取出子宮，逐個(gè)檢查胎鼠有無外觀異常，用KD-160型電子秤稱量懷孕子宮重、子宮胎盤重和胎盤重，用精密電子天平EL3002稱取卵巢和子宮的重量。將一半胎鼠放入Bouin氏液中固定，檢查內(nèi)臟。另一半胎鼠去皮、去內(nèi)臟及脂肪后，放入0.01%茜素紅液染色，并經(jīng)透明液脫色后檢查骨骼發(fā)育情況。

1.4.5 細(xì)菌易位實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)28 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的大鼠處死后，無菌環(huán)境下解剖，用無菌手術(shù)刀取心、肝、脾、肺、腎等臟器并切開，用一次性無菌棉簽擦拭各臟器切面，涂布于含0.5 g/L半胱氨酸的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置厭氧培養(yǎng)24～48 h，觀察有無特征菌落生長[15]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Graphpad Prism5進(jìn)行繪圖，使用SPSS 22.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。相同字母標(biāo)注代表無顯著性差異，p<0.05則認(rèn)為差異顯著。與雌性對照組之間有顯著差異：p<0.05標(biāo)注*，p<0.01標(biāo)注**，p<0.001標(biāo)注***；與雄性對照組之間有顯著差異：p<0.05標(biāo)注#，p<0.01標(biāo)注##，p<0.001標(biāo)注### 。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 急性毒性試驗(yàn)對大鼠體重的影響

不同菌株灌胃大鼠，實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠生長、行為和精神狀態(tài)良好，未見中毒癥狀或死亡現(xiàn)象。圖1所示為各實(shí)驗(yàn)組大鼠的體重增量(圖1-A)及進(jìn)食量(圖1-B)，灌喂益生菌組體重增幅較對照組均有較明顯的降低，且表現(xiàn)出較明顯的性別差異，BA對雌性體重增幅影響較雄性略明顯；同時(shí)，與對照組相比，灌胃益生菌降低了大鼠的進(jìn)食量。

圖1 益生菌對急性毒性大鼠體重增量及進(jìn)食量的影響Fig.1 Weight gain and food intakeof acute toxicity test

2.1.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)對大鼠臟器指標(biāo)的影響

7 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對大鼠進(jìn)行解剖，觀察臟器并稱重。觀察結(jié)果表明，大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺及腎臟均無可見病變。各組大鼠的臟器指數(shù)如表1所示，灌胃不同益生菌的試驗(yàn)組大鼠與對照組相比，均無顯著性差異。

表1 急性毒性實(shí)驗(yàn)臟器指數(shù)Table 1 Organ index of acute toxicity test

2.2 28 d喂養(yǎng)毒性試驗(yàn)

2.2.1 不同菌株對大鼠體重及食物利用率的影響

用不同劑量的益生菌灌胃大鼠28 d，大鼠生長、行為和精神狀態(tài)良好，未見中毒癥狀或死亡現(xiàn)象。圖2所示為各實(shí)驗(yàn)組大鼠的體重增量(圖2-A)及食物利用率(圖2-B)，結(jié)果表明各組大鼠體重增量與食物利用率均表現(xiàn)出性別差異，灌喂不同劑量益生菌組的雌性大鼠體重增幅較對照組均有降低，與食物利用率的結(jié)果相一致；灌胃青春雙歧桿菌Z25對體重增量和食物利用率的影響大于羅伊氏乳桿菌138-1，提示該2株菌具有潛在的減肥功能。

2.2.2 大鼠臟器指標(biāo)的影響

圖2 益生菌對28 d喂養(yǎng)大鼠體重增量及食物利用率的影響Fig.2 Weight gain and food utilization rate of 28 day feeding toxicity test

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對大鼠進(jìn)行解剖，觀察臟器并稱重。結(jié)果表明，大鼠肝臟、脾臟及腎臟均無可見病變。各組大鼠的臟器指數(shù)均無顯著性差異。

2.2.3 不同菌株對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

不同劑量的益生菌灌胃28 d后，對各組大鼠血液的血脂指標(biāo)(TC、TG)、肝功能指標(biāo)(ALT、AST)、葡萄糖(GLU)及蛋白指標(biāo)(ALB、TP)、腎功能指標(biāo)(BUN、Cr)等進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。灌胃益生菌28 d后，與對照組相比，雌性BA-L、LR-M及雄性BA-L組TC含量有所提高；雌性BA-M、LR-L、LR-M及雄性BA-L組TG含量有所升高；雄性BA-L和LR-L組ALT含量有所增加，雄性LR-M和LR-H組AST含量有所下降，雌性大鼠的ALT和AST指標(biāo)與對照組均無顯著差別。

圖3 益生菌對28 d喂養(yǎng)大鼠血脂及肝功能指標(biāo)的影響Fig.3 Blood lipid and liver function index of 28 day feeding toxicity test

如圖4所示，灌胃不同濃度的益生菌，血液中的葡萄糖含量也呈現(xiàn)部分的升高，與對照組相比，雄性BA-M、BA-H和LR-M組GLU含量少量升高，而雌性大鼠組別中GLU升高的為BA-L和LR-H組。

2.2.4 不同菌株對大鼠血液學(xué)檢查的影響

灌胃不同濃度的益生菌28 d后，對各組大鼠進(jìn)行血液學(xué)檢查，各實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類、血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)等指標(biāo)均無顯著差異。

2.2.5 不同菌株對大鼠組織病變的影響

對灌胃28 d高劑量益生菌大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸、卵巢、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸和胰腺等器官固定后，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片和H&E染色，光鏡觀察組織病理學(xué)改變(圖5～圖6)。

鏡檢結(jié)果顯示：各實(shí)驗(yàn)組雄性及雌性大鼠中，部分肺組織樣本均出現(xiàn)不同程度的支氣管性肺炎，與對照組相比，未見明顯加重，提示非益生菌相關(guān)性病變；且因?qū)嶒?yàn)動物為清潔級SD大鼠，出現(xiàn)一定比例的支氣管性肺炎屬正常現(xiàn)象，發(fā)病的試驗(yàn)大鼠也并未表現(xiàn)出明顯異常。各實(shí)驗(yàn)組雄性及雌性大鼠肺臟組織偶見出血，發(fā)生率較低，且與對照相比，未見明顯加重或發(fā)生率升高，提示非益生菌相關(guān)性病變。各實(shí)驗(yàn)組雌雄大鼠，除肺臟之外的其他組織，均未見明顯的組織病變。

2.3 致畸實(shí)驗(yàn)

2.3.1 不同乳酸菌灌胃對孕鼠生殖功能的影響

不同劑量的益生菌灌胃孕鼠，對其生殖功能及胚胎形成的影響如表2所示。與NC組相比，益生菌組終末期體重(GD20)均有不同程度的下降，其中LR組有顯著差異；灌胃益生菌組的孕鼠子宮胎盤重、子宮重及子宮臟體系數(shù)均高于NC組；而懷孕子宮重、卵巢重、卵巢臟體系數(shù)、黃體數(shù)等指標(biāo)，各實(shí)驗(yàn)組孕鼠均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3.2 不同乳酸菌灌胃對胎仔外觀的影響

不同劑量的益生菌灌胃孕鼠，比較各組胎仔總數(shù)、總重、均重、身長、尾長、雌雄比及外觀畸形率等指標(biāo)，未見明顯差異，各組胎仔外觀畸變率均為0。

2.3.3 不同乳酸菌灌胃對胎仔內(nèi)臟的影響

不同劑量的益生菌灌胃孕鼠，對各實(shí)驗(yàn)組胎仔窩別內(nèi)臟變異率及畸形率進(jìn)行檢查。結(jié)果顯示，各組胎仔窩別內(nèi)臟變異率均為0，NC組胎仔窩別內(nèi)臟畸形率為(1.39±4.81)%，畸變類型為腎異位；其余各組未見明顯異常改變。

表2 對孕鼠生殖功能及胚胎形成的影響Table 2 Effects on reproductive function and embryo formation in pregnant rats

注：臟體系數(shù)/%=臟器質(zhì)量/動物體質(zhì)量×100。

2.3.4 不同乳酸菌灌胃對胎仔骨骼的影響

結(jié)果顯示，各組胎仔窩別骨骼畸形率從NC組至LR-H組依次為3.47%、6.88%、6.35%、5.83%、7.74%、7.94%和9.29%，與NC組相比，灌胃益生菌組畸變率略有升高，但仍處于較低的比率范圍，同時(shí)無顯著性差異，且部分升高并無明顯的劑量效應(yīng)；畸變類型主要為間頂骨、胸骨、肋骨、腰椎、骶椎缺失、胸骨分離和胸骨分叉，其中間頂骨、胸骨、腰椎、骶椎缺失可能與孕鼠孕期未到有關(guān)。

2.4 細(xì)菌易位實(shí)驗(yàn)

對灌胃益生菌28 d的大鼠臟器無菌切開，取其切面涂布于含0.05%半胱氨酸的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置厭氧培養(yǎng)24～48 h后，均無特征性菌落生長，該結(jié)果表明2株菌在宿主體內(nèi)未發(fā)生細(xì)菌易位現(xiàn)象。

3 討論

作為腸道共生微生物，乳桿菌和雙歧桿菌因其在食品和膳食補(bǔ)充劑中較長的使用歷史被認(rèn)為是無致病性、安全可食用的。然而，從理論上講益生菌可能存在以下副作用：進(jìn)入血液引發(fā)系統(tǒng)性感染；產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物；對敏感人群的過度免疫刺激；耐藥基因的轉(zhuǎn)移[9]。近年來，越來越多的新的益生菌菌種(如羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌)被開發(fā)使用，鑒于其使用歷史不長，因此其安全性還需進(jìn)一步評價(jià)[16]。

本研究按照相關(guān)文件進(jìn)行了毒理學(xué)評價(jià)，與李金敏[14]等的報(bào)道一致，益生菌灌胃不會對大鼠的臟器和行為造成影響。灌喂不同劑量的益生菌組體重增幅較對照組均有降低，且表現(xiàn)出明顯的性別差異，青春雙歧桿菌Z25對雌性體重增幅影響較雄性略明顯；同時(shí)，檢測到灌胃益生菌可降低大鼠的進(jìn)食量及食物利用率。以上結(jié)果表明，青春雙歧桿菌Z25和羅伊氏乳桿菌138-1可以通過降低大鼠的食欲，從而進(jìn)一步影響其體重，提示該2株菌具有潛在的減肥功能[17-18]。

血液成分或細(xì)胞發(fā)生異常，可以反映全身血液系統(tǒng)、組織器官的病變，因此動物血液學(xué)檢查在毒理學(xué)研究中十分重要。有研究表明，菌血癥的發(fā)生與乳桿菌(主要是鼠李糖乳桿菌)有關(guān)，免疫功能低下的病人更容易感染[19]。本研究結(jié)果表明，血液中蛋白指標(biāo)、肝功能指標(biāo)、腎功能指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，證實(shí)該實(shí)驗(yàn)用益生菌不會對肝腎造成損傷。益生菌灌胃對雄性血脂指標(biāo)(TC、TG)無明顯影響，中劑量的羅伊氏乳桿菌138-1會導(dǎo)致雌性大鼠TC和TG含量略微升高，但仍處于報(bào)道的正常范圍內(nèi)[20]，而針對這2株菌的前期研究表明，這2株菌對由高糖高脂飼料導(dǎo)致的大鼠代謝綜合征具有顯著的緩解作用。已有多個(gè)研究表明，補(bǔ)充益生菌能緩解高脂飲食引發(fā)的血糖升高[21-23]，而益生菌對正常飲食大鼠血糖的影響鮮有報(bào)道。從本研究結(jié)果來看，針對正常飲食的健康大鼠，這2株益生菌雖然對血糖血脂有一定的影響，但血糖血脂的變化都在正常范圍內(nèi)，且并沒有明顯的劑量效應(yīng)，提示該變化可能與大鼠血糖血脂水平的正常浮動有關(guān)。

致畸實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益生菌各劑量組對胎仔發(fā)育、外觀及內(nèi)臟畸形均無明顯影響，提示2株益生菌無致畸作用。細(xì)菌易位是指位于腸道中的細(xì)菌或內(nèi)毒素穿過腸上皮屏障，經(jīng)粘膜固有層進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)，經(jīng)人體循環(huán)至肝、腎、脾等無菌的組織器官的過程[24]。與宋靜頤[25]等人的研究一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量的益生菌灌胃大鼠，均未在肝、腎、脾等部位檢測到特征菌落，證實(shí)2株實(shí)驗(yàn)菌株在大鼠體內(nèi)不會發(fā)生細(xì)菌易位。相反，王堅(jiān)鏘[26]等通過給腹腔感染的大鼠補(bǔ)充嗜酸乳桿菌，發(fā)現(xiàn)益生菌補(bǔ)充能明顯降低大鼠血、肺臟、肝臟和腸系膜淋巴結(jié)等組織的細(xì)菌易位；李京京[27]等通過建立大鼠缺血再灌注模型，證實(shí)了植物乳桿菌L2能夠抑制腸道損傷導(dǎo)致的細(xì)菌易位。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可初步證實(shí)青春雙歧桿菌Z25和羅伊氏乳桿菌138-1對于大鼠安全，可以應(yīng)用于產(chǎn)品研發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)。

4 結(jié)論

通過對青春雙歧桿菌Z25和羅伊氏乳桿菌138-1進(jìn)行系統(tǒng)的安全性評價(jià)，急性毒性實(shí)驗(yàn)和28 d毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃不同劑量的益生菌，實(shí)驗(yàn)期間大鼠除體重增長幅度略有下降以外，日常表現(xiàn)及體征一切正常，均未表現(xiàn)出明顯的組織病變和中毒現(xiàn)象；致畸實(shí)驗(yàn)表明，益生菌實(shí)驗(yàn)組大鼠體重略有下降，對孕鼠生殖功能、胎仔外觀及內(nèi)臟均無明顯影響；血液學(xué)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)；2株菌株均未發(fā)生細(xì)菌易位現(xiàn)象。綜上所述，青春雙歧桿菌Z25和羅伊氏乳桿菌138-1對大鼠安全，且相對于人體重，安全性評價(jià)中大鼠益生菌的攝入比例遠(yuǎn)高于產(chǎn)品推薦的消費(fèi)者日常益生菌攝入比例，因此該2株菌可用于后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)及實(shí)際生產(chǎn)。