鳥嘌呤和異亮氨酸促進(jìn)丁酸梭菌生長(zhǎng)

劉穎，楊華，宋昭，陳雄，黃亞男，王志*

1(湖北工業(yè)大學(xué)，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430068) 2(河南省南街村(集團(tuán))有限公司，河南 臨潁，462600)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是低G-C含量的革蘭氏陽(yáng)性嚴(yán)格厭氧菌，芽孢偏心或次端生、中部膨大呈梭狀、周生鞭毛、具有運(yùn)動(dòng)性[1]，廣泛存在于腸道、土壤、白酒釀造窖泥和奶酪中。丁酸梭菌因具有調(diào)節(jié)腸道平衡、增強(qiáng)免疫的功能[2]而受到關(guān)注，如：戚薇采用單因素和正交優(yōu)化，培養(yǎng)32 h的活菌數(shù)達(dá)到 4.1×108CFU/mL[3]；袁華偉等在最適條件下清液培養(yǎng)源于酒窖泥的丁酸梭菌48 h，細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.64×108CFU/mL[4]；趙建新等在優(yōu)化條件下培養(yǎng)ClostridiumbutyricumZ-10，發(fā)酵12 h生物量達(dá)到3.6×108CFU/mL[5]，夏會(huì)麗等在10 L罐水平(基料體積5 L)批培養(yǎng)丁酸梭菌HBUT-01，細(xì)胞數(shù)達(dá)到9.39 ×108CFU/mL[6]。

丁酸梭菌液體發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生大量丁酸、乙酸等分子使培養(yǎng)基pH迅速降低，并伴隨著支鏈淀粉粒[7]積累，而且淀粉粒隨著芽孢生成程序啟動(dòng)[8]又被消耗。這使?fàn)I養(yǎng)體細(xì)胞生長(zhǎng)周期變短、限制了生物量的進(jìn)一步增加?？莶輻U菌的芽孢程序啟動(dòng)需要Spo0A蛋白的磷酸化[9]，涉及到全局調(diào)控子CodY(幫助細(xì)胞適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)貧乏狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白)。當(dāng)效應(yīng)分子(GTP和/或支鏈氨基酸BCAAs)與其結(jié)合后，會(huì)引起CodY構(gòu)型轉(zhuǎn)變，CodY-GTP或CodY-BCAA才能結(jié)合于靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，起到調(diào)控蛋白的作用[10]，并通過阻遏KinB蛋白的表達(dá)來抑制芽孢的形成[11]。雖然梭狀芽孢桿菌基因組中無spo0F和spo0B基因，不存在磷酸傳遞系統(tǒng)[12]，但有文獻(xiàn)報(bào)道：激活狀態(tài)的CodY可能通過調(diào)控芽孢形成相關(guān)基因sinR和opp來抑制Clostridiumdifficile芽孢的形成[13]，使細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)。

微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)分子的利用存在一般性規(guī)律，如：枯草芽孢桿菌從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏的發(fā)酵后期，其胞內(nèi)GTP和BCAAs水平大幅度下降，分別從2 mmol/L和15 mmol/L下降至0.3 mmol/L和2 mmol/L，過程中CodY的調(diào)控活性逐步下降，從而使阻遏的靶基因脫阻遏而表達(dá)[14]。盡管丁酸梭菌Spo0A的磷酸化過程還沒有闡明、CodY對(duì)芽孢調(diào)控的細(xì)節(jié)特征也沒有明確的報(bào)道，但是，由于在Clostridiumbutyricum[15]、Clostridiumacetobutylicum[16-17]和Clostridiumbotulinum[18]中確實(shí)存在CodY，因此，有必要在丁酸梭菌發(fā)酵葡萄糖生長(zhǎng)過程中，通過補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)分子(如：嘌呤類分子、支鏈氨基酸)來觀察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和芽孢啟動(dòng)的影響。

為了延緩丁酸梭菌芽孢的形成，進(jìn)一步提高丁酸梭菌的生物量及生長(zhǎng)效率，本文在厭氧瓶水平確定了鳥嘌呤和支鏈氨基酸對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)的影響，并在20 L發(fā)酵罐水平研究了其對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)、酸代謝和芽孢生成的影響，確定了鳥嘌呤和Ile的促生長(zhǎng)功能和對(duì)丁酸合成調(diào)控的基本特征，進(jìn)一步提高了丁酸梭菌的生物量，為丁酸梭菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

丁酸梭菌HBUT-01(ClostridiumbutyricumHBUT-01)，為本實(shí)驗(yàn)室菌株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC M 2016628)。

DELTA 320 pH計(jì)，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TG18M臺(tái)式高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；Nikon ECLIPSE E100生物顯微鏡，上海光學(xué)儀器五廠；Aglient 7890B氣相色譜儀， HNY-211B全溫振蕩培養(yǎng)箱，天津歐諾儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，島津。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10；胰蛋白胨10；牛肉浸膏 10；酵母浸粉3；瓊脂20。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖16.1，蛋白胨25，酵母浸粉 7；CaCO34.3；MgSO4·7H2O；0.8；K2HPO40.5; MnSO4·H2O 0.02。

所有培養(yǎng)基均分裝至100 mL厭氧瓶中，裝液量30 mL，加0.6 g/L半胱氨酸，0.5 g/L刃天青(無氧條件(Eh值在-40 mV)下呈無色狀態(tài);有氧條件下為紅色)，pH 7.2，通氮?dú)獬? min，115 ℃滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

種子懸液制備：將-20 ℃保存的丁酸梭菌甘油管接種至厭氧管斜面，37 ℃活化12 h。加3 mL無菌水至種子斜面，制備種子菌懸液。

一級(jí)種子液制備：將種子菌懸液以體積分?jǐn)?shù)為2.5%的接種量接至厭氧瓶(種子培養(yǎng)基，裝液量30 mL)中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h。

厭氧瓶發(fā)酵方法：將一級(jí)種子液以體積分?jǐn)?shù)為2.5%的接種量接至厭氧瓶(發(fā)酵培養(yǎng)基,裝液量30 mL)中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，周期取樣。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素優(yōu)化

配置15 g/L鳥嘌呤溶液，0.22 μm的濾膜過濾除菌。用1 mL無菌注射器向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同體積的鳥嘌呤溶液，使鳥嘌呤終質(zhì)量濃度梯度為0～0.4 g/L。發(fā)酵10 h取樣并滾管計(jì)數(shù)。

分別配置15 g/L的Ile、Leu和Val溶液，0.22 μm的濾膜過濾除菌。分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1 mL所配溶液(終濃度是0.5 g/L)，發(fā)酵10 h取樣并滾管計(jì)數(shù)。

配置15 g/L的Ile溶液，0.22 μm的濾膜過濾除菌。用1 mL無菌注射器向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同體積的Ile溶液，使其終濃度梯度為0～1.0 g/L。發(fā)酵10 h取樣并滾管計(jì)數(shù)。

1.4.2 20 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

一級(jí)種子液接種體積分?jǐn)?shù)為2.5%，發(fā)酵基料體積14 L。滅菌結(jié)束后通入氮?dú)庵两臃N(1 h左右)，轉(zhuǎn)速200 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h左右。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 細(xì)胞數(shù)測(cè)定

使用Hungate滾管計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)[19]。

1.5.2 葡萄糖測(cè)定

采用3,5二硝基水楊酸法測(cè)定[20]。

1.5.3 有機(jī)酸測(cè)定

揮發(fā)性有機(jī)酸丁酸和乙酸采用氣相色譜測(cè)定。采用氣相色譜法測(cè)定：安捷倫7890B GC，F(xiàn)ID檢測(cè)器，HP-INNOWax毛細(xì)管柱柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚1 μm；程序升溫條件：40 ℃保留5 min，后以20 ℃/min升到120 ℃，再以10 ℃/min 升到220 ℃，220 ℃ 保留3 min。流速 5 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器280 ℃[21]。

1.5.4 細(xì)胞染色

采用孔雀綠芽孢染色法，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.6%的孔雀綠加熱條件下染5 min，沖洗干燥后番紅染液復(fù)染2 min，芽孢染成綠色，細(xì)胞其他部分染成粉紅色。

2 結(jié)果與分析

2.1 厭氧瓶水平發(fā)酵基料添加鳥嘌呤對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)的影響

GMP在胞內(nèi)可以通過兩種途徑生成:從頭合成和補(bǔ)救合成。補(bǔ)救合成為磷酸核糖焦磷酸直接與嘌呤堿生成嘌呤核苷酸。因此，添加嘌呤可促進(jìn)胞內(nèi)GTP以及嘌呤核苷酸的代謝。

由圖1可知，添加鳥嘌呤可顯著提高丁酸梭菌的生物量。10 h對(duì)照生物量達(dá)到3.77×108CFU/mL。添加0.1～0.4 g/L鳥嘌呤組細(xì)胞數(shù)較對(duì)照提高了22.02%～50.92%。其中添加0.2 g/L組的生物量(5.59×108CFU/mL)僅低于0.3g/L和0.4 g/L組1.71%和1.06%。因此選擇0.2 g/L為最適添加質(zhì)量濃度。此外，鳥嘌呤還顯著影響了菌體的形態(tài)，如圖2所示：對(duì)照90%左右的菌體已經(jīng)開始形成芽孢，而添加鳥嘌呤明顯減少了芽孢形成的比例，0.2～0.4 g/L的添加量都可以使菌體依然為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)，延緩了芽孢形成。

圖1 鳥嘌呤對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of guanine on the growth of Clostridium butyricum

圖2 鳥嘌呤對(duì)丁酸梭菌(10 h)細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 The effect of gunanine on the cell morphology of Clostridium butyricum at 10 h

2.2 厭氧瓶水平發(fā)酵基料添加0.2 g/L鳥嘌呤對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)的影響

厭氧瓶水平添加鳥嘌呤對(duì)丁酸梭菌代謝的影響如圖3所示。添加組的生物量水平整體較高，6 h迅速生長(zhǎng)至5.05×108CFU/mL，并與8 h開始二次生長(zhǎng)，10 h達(dá)到峰值(5.71×108CFU/mL)，比對(duì)照8 h的峰值生物量(4.34×108CFU/mL)提高了31.57%。添加組胞外丁酸和乙酸濃度除了在10 h高于對(duì)照組外，均分別低于對(duì)照3.15%～7.23%和0.92%～24.32%，而且丁酸和乙酸的單位菌體的得率系數(shù)(Yp/x)分別為0.37 mg/108CFU和0.42 mg/108CFU，低于對(duì)照120.03%和16.67%。說明在厭氧瓶水平，鳥嘌呤可以提高丁酸梭菌生物量，減少丁酸、乙酸的合成。

圖3 添加0.2g/L鳥嘌呤對(duì)丁酸梭菌代謝的影響(空心標(biāo)識(shí)為對(duì)照組，實(shí)心標(biāo)識(shí)為添加組)Fig.3 The effect of 0.2 g/L gunanine on metabolism of Clostridium butyricum

2.3 支鏈氨基酸對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)的影響

芽孢程序啟動(dòng)過程Spo0A蛋白的磷酸化[9]涉及到了全局調(diào)控子CodY。GTP和/或BCAAs與之結(jié)合形成CodY-GTP或CodY-BCAA后，使得CodY構(gòu)型轉(zhuǎn)變而激活，才能結(jié)合于靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域[10]，通過阻遏KinB蛋白的表達(dá)來抑制芽孢的形成[11]。Clostridiumdifficile中激活狀態(tài)的CodY可能通過調(diào)控芽孢形成相關(guān)基因sinR和opp的表達(dá)來抑制芽孢的形成[13]，使細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)。

由于丁酸梭菌中關(guān)于BCAAs結(jié)合于CodY結(jié)構(gòu)域、進(jìn)而調(diào)控芽孢形成基因表達(dá)的特征沒有明確的報(bào)道，因此，需要確認(rèn)支鏈氨基酸的作用。BCAAs對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)代謝的影響如圖4所示。

圖4 支鏈氨基酸對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)(10 h)的影響Fig.4 The effect of BCAAs on the growth of Clostridium butyricum

發(fā)酵培養(yǎng)10 h，添加0.5 g/L的Leu和Ile組的生物量分別達(dá)到3.6×108CFU/mL和4.32×108CFU/mL，較對(duì)照3.5×108CFU/mL分別提高2.8%和20%。同時(shí)，支鏈氨基酸對(duì)菌體的形態(tài)和芽孢生成產(chǎn)生了顯著的影響，如圖5所示，Val組和對(duì)照組一樣在10 h已大量形成芽孢，結(jié)合其生物量?jī)H為對(duì)照的75%的數(shù)據(jù)，說明：Val對(duì)細(xì)胞的影響與枯草芽孢桿菌完全不同，或者0.5 g/L的Val已經(jīng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性。另外，Leu組芽孢生成也較為明顯，只有Ile組菌體形態(tài)基本上都維持在梭狀形態(tài)，而且無芽孢生成，因此選擇Ile進(jìn)行下一步研究。

圖5 支鏈氨基酸對(duì)丁酸梭菌細(xì)胞形態(tài)(10 h)的影響Fig.5 The effect of BCAAs on the cell morphology of Clostridium butyricum at 10 h

2.4 不同質(zhì)量濃度Ile對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)的影響

如圖6 所示，0.25～0.75 g/L的Ile添加量促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)酵10 h的細(xì)胞數(shù)在(3.92～4.25)×108CFU/mL，較對(duì)照(3.53×108CFU/mL)增加了10.73%～20.05%，并以0.5 g/L組為峰值。

圖6 不同質(zhì)量濃度異亮氨酸對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)(10 h)的影響Fig.6 The effect of different concentrations of Ile on the growth of Clostridium butyricum

2.5 20 L發(fā)酵罐水平鳥嘌呤和Ile對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)代謝的影響

20 L發(fā)酵罐水平基料添加鳥嘌呤對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)代謝的影響如圖7所示: 對(duì)照組(圖7-A)和添加組(圖7-B)的葡萄糖從2 h開始被快速利用，8 h分別剩余3.03 g/L和0.71 g/L。添加組糖耗速率較對(duì)照提高了26.23%。對(duì)照組胞外丁酸從2 h開始積累，6 h達(dá)到2.14 g/L，并持續(xù)積累至9 h的3.33 g/L。乙酸0～6 h積累至0.69 g/L。添加組的丁酸和乙酸在6 h的質(zhì)量濃度分別為1.28 g/L和0.47 g/L，9 h的乙酸質(zhì)量濃度積累至0.7 g/L，丁酸質(zhì)量濃度在10 h達(dá)到3.2 g/L。

A-對(duì)照；B-添加組圖7 20 L發(fā)酵罐基料添加0.2 g/L的鳥嘌呤對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)代謝Fig.7 The effect of 0.2 g/L guanine on the growth and metabolism of Clostridium butyricum in 20 L bioreactor

對(duì)照組細(xì)胞數(shù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至6 h達(dá)到峰值(4.32×108CFU/mL)，后自溶至9 h(3.19×108CFU/mL，減少26.16%)。9 h后開始二次生長(zhǎng)至10 h達(dá)到4.21×108CFU/mL。添加組從2 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至6 h，達(dá)到峰值生物量5.31×108CFU/mL，較對(duì)照6 h提高了22.91%。6 h后細(xì)胞自溶至9 h，減少了66%，9 h后二次生長(zhǎng)至10 h的4.23×108CFU/mL。

基料添加0.5 g/L的Ile對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)代謝的影響如圖8所示，丁酸梭菌從2 h開始對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至7 h達(dá)到峰值生物量4.65×108CFU/mL，較對(duì)照(圖7-A)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)1 h，峰值生物量提高7.64%。7 h后細(xì)胞自溶，10 h生物量?jī)H有2.56×108CFU/mL，比其峰值生物量減少了44.94%。添加Ile使糖耗減慢，7 h葡萄糖質(zhì)量濃度為6.71 g/L。胞外丁酸和乙酸從4 h開始積累，均在9 h基本達(dá)到峰值，分別為2.42 g/L和0.62 g/L，其中，乙酸含量與對(duì)照(圖7-A)接近，丁酸較對(duì)照組降低了25.38%。

圖8 20 L發(fā)酵罐基料添加0.5 g/L的Ile對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)代謝的影響Fig.8 The effect of 0.5 g/L Ile on the growth and metabolism of Clostridium butyricum in 20 L bioreactor

6 h細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值時(shí)，得率系數(shù)如表1所示，就細(xì)胞對(duì)糖的得率而言，鳥嘌呤和Ile效果接近，均提高了17%以上。而且糖酸轉(zhuǎn)化得率(Yp/s)降低了30%以上，與之相對(duì)應(yīng)的，單位菌體的丁酸得率(Yp/x)也下降了40%以上。說明鳥嘌呤和Ile還調(diào)控了丁酸合成途徑的碳通量，酸得率下降可以降低酸脅迫效應(yīng)，降低質(zhì)子外泵的額外能量消耗[22]，從而促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)效率。

表1 峰值生物量(6 h)得率系數(shù)Table 1 The yield coefficient at peak biomass

注：其中Yx/s表示單位葡萄糖細(xì)胞得率；Yp/s為單位葡萄糖丁酸得率；Yp/x為單位菌體丁酸得率，干重(Y)與*108CFU/mL (X)的關(guān)系為Y=1.13X+0.87，R2=0.993 1。

枯草芽孢桿菌中，GTP和Ile作為效應(yīng)分子協(xié)同或單獨(dú)與CodY結(jié)合，激活CodY的調(diào)控蛋白作用，而且Ile和GTP的作用效果可以累積[14]。為了確定鳥嘌呤和Ile是否對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)代謝具有協(xié)同積累調(diào)控作用，研究了基料同時(shí)添加0.2 g/L鳥嘌呤和0.5 g/L的Ile對(duì)其生長(zhǎng)的影響，如圖9所示。

丁酸梭菌從2 h開始對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至6 h達(dá)到峰值生物量5.4×108CFU/mL，較對(duì)照(圖7-A)提高了25%、較單獨(dú)添加Ile提高16.13%。說明兩者對(duì)丁酸梭菌的生長(zhǎng)確實(shí)存在類似于枯草芽孢桿菌的協(xié)同促進(jìn)作用。但是，CodY與效應(yīng)分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域與GTP的結(jié)合效率可能更高，因此，當(dāng)鳥嘌呤與Ile同時(shí)添加時(shí)，生物量較單獨(dú)添加鳥嘌呤組無顯著性差異。

圖9 20 L發(fā)酵罐基料添加0.2 g/L鳥嘌呤與0.5 g/L的Ile對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)代謝的影響Fig.9 The effect of 0.2 g/L guanine and 0.5 g/L Ile on the growth and metabolism of Clostridium butyricum in 20 L bioreactor

6～9 h細(xì)胞自溶(9 h，2.98×108CFU/mL)，后出現(xiàn)二次生長(zhǎng)現(xiàn)象，至10 h增加到3.25×108CFU/mL，但較6 h仍然減少了39.81%。細(xì)胞峰值時(shí)乙酸和丁酸的濃度分別為0.44 g/L和1.29 g/L，較對(duì)照(圖7-A)降低了36.23%和39.72%。

對(duì)比已有文獻(xiàn)[3-6]，本研究中使用的菌種在優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng)具有周期短、效率高、細(xì)胞生長(zhǎng)迅速的明顯優(yōu)勢(shì)，而有關(guān)培養(yǎng)周期、最大細(xì)胞生物量的差異則與不同的菌株、培養(yǎng)基組成、發(fā)酵工藝參數(shù)的控制、啟動(dòng)以及發(fā)酵過程厭氧條件的維持差異有關(guān)。

發(fā)酵批培養(yǎng)(圖7～圖9)過程存在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至峰值后大幅自溶的現(xiàn)象，這估計(jì)也與培養(yǎng)條件(如：厭氧啟動(dòng)基料體積為14 L)和細(xì)胞氧化脅迫[23]有關(guān)。接種前氮?dú)庵脫Q空氣1 h難以將溶氧完全去除，培養(yǎng)基中的痕量溶氧可能對(duì)丁酸梭菌細(xì)胞生長(zhǎng)(特別是啟動(dòng)階段的細(xì)胞)產(chǎn)生了氧化脅迫效應(yīng)，如：丁酸梭菌的碳代謝關(guān)鍵酶-丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶對(duì)溶氧很敏感，與氧接觸1 h，其酶活性降低50%[24]。本文對(duì)照批培養(yǎng)在10 L罐水平(基料體積5 L)條件下的發(fā)酵效率[6]就高于本文對(duì)照(圖7-A)，這估計(jì)也與前者基料體積小、厭氧發(fā)酵啟動(dòng)條件較好有關(guān)。

另外，若在培養(yǎng)過程中(如：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)外源補(bǔ)加鳥嘌呤和Ile，也涉及到了補(bǔ)料液的厭氧狀態(tài)以及補(bǔ)料過程對(duì)發(fā)酵體系厭氧狀態(tài)的擾動(dòng)問題。特別是在丁酸梭菌工業(yè)發(fā)酵的放大過程中，厭氧條件的維持問題會(huì)格外突出，因此，下一步將針對(duì)氧化脅迫效應(yīng)、以延長(zhǎng)細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期為目標(biāo)展開系統(tǒng)的研究，包括：補(bǔ)料因子(碳源、氮源、調(diào)控因子如鳥嘌呤和Ile)最適補(bǔ)加時(shí)間、發(fā)酵過程氧化還原電位的優(yōu)化等，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

3 結(jié)論

厭氧瓶水平基料添加鳥嘌呤(0.2 g/L)和Ile(0.5 g/L)能分別提高丁酸梭菌的生物量31.57%和20%，而基料添加Val(0.5 g/L)則促進(jìn)了芽孢生成、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。20 L發(fā)酵罐水平基料添加鳥嘌呤(0.2 g/L)和Ile(0.5 g/L)使丁酸梭菌峰值生物量分別達(dá)到5.31×108CFU/mL和4.65×108CFU/mL，較對(duì)照分別提高了22.91%和7.64%，同時(shí)丁酸的菌體得率系數(shù)(Yp/x)較對(duì)照分別降低了48.64%和40.54%；當(dāng)基料同時(shí)添加鳥嘌呤和Ile時(shí)，丁酸梭菌峰值生物量達(dá)到了5.4×108CFU/mL，較對(duì)照、單獨(dú)添加Ile分別提高了25%和16.13%，確定了鳥嘌呤和Ile的促生長(zhǎng)功能，為丁酸梭菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。