布氏錐蟲來源內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的異源表達(dá)和活性鑒定

崔娟，喜多島敏彥，王寧，中西秀樹，高曉冬

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

糖基化是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要環(huán)節(jié)，糖鏈對(duì)于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的影響[1]。目前在醫(yī)藥用的蛋白中，70%以上都是糖蛋白。藥用糖蛋白表面的糖鏈具有改善藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，增強(qiáng)藥物的靶向性等功能[2]。然而，目前生產(chǎn)出來的重組藥用糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的非均一性造成了藥效下降及批次間不一致，甚至產(chǎn)生免疫副反應(yīng)，這些都嚴(yán)重影響了藥用糖蛋白的臨床應(yīng)用[3]。因此，如何生產(chǎn)糖鏈結(jié)構(gòu)均一的糖蛋白十分重要[4]。

目前糖苷內(nèi)切酶催化的轉(zhuǎn)糖基作用對(duì)于生產(chǎn)均一糖鏈的糖蛋白是一種重要的手段。ENGase(EC 3.2.1.96)是一種糖苷內(nèi)切酶，可以水解N糖鏈上2個(gè)N-乙酰葡糖胺之間的β-1,4糖苷鍵，分為糖苷水解酶18家族(glycoside hydrolase families 18, GH18)和GH85。屬于GH18的ENGase具有糖苷水解活性，例如來源于褶皺鏈霉菌(Streptomycesplicatus)的Endo-H[5]和來源于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Endo-S[6]等。屬于GH85的ENGase除了水解活性之外同時(shí)還具有轉(zhuǎn)糖基活性，可以將均一化的糖鏈轉(zhuǎn)移到糖蛋白上的β-N-乙酰氨基葡萄糖上，在2個(gè)GlcNAc之間形成新的均一化糖鏈從而應(yīng)用到生產(chǎn)均一糖鏈的糖蛋白上，例如來源于原生節(jié)桿菌(Arthrobacterprotophormiae)的Endo-A[7]和來源于凍土毛霉(Mucorhiemalis)的Endo-M[8]等。

目前Endo-A和Endo-M已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于均一化糖鏈糖蛋白的合成，但Endo-A只能利用高甘露糖型糖鏈作為糖基供體，Endo-M雖然可以利用高甘露糖型、復(fù)合型以及雜合型N-糖鏈，已經(jīng)被商業(yè)化利用，但是由于其難以從大腸桿菌中大量純化，導(dǎo)致價(jià)格昂貴[9]。通常ENGase的水解活性要比轉(zhuǎn)糖基活性高，合成產(chǎn)物容易被自身再次水解，導(dǎo)致產(chǎn)率降低。而且不同的ENGase由于其底物特異性不同，使用范圍受到限制。為了克服這些問題，該研究尋找到一種新的來源于布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)的ENGase，可以在大腸桿菌中大量表達(dá)和純化，通過檢測(cè)水解活性以及底物特異性，融合蛋白Nus-Endo Tb能夠作用于高甘露糖型和復(fù)合型糖鏈。并且用唾液酸糖肽作為糖基供體，檢測(cè)到 Nus-Endo Tb具有轉(zhuǎn)糖基活性。由于Nus-Endo Tb可以在大腸桿菌中大量表達(dá)和簡(jiǎn)單的純化，并且酶的性質(zhì)穩(wěn)定利于儲(chǔ)存，在對(duì)于N糖蛋白修飾的研究中有一定的實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌BL21(DE3)pLysS購(gòu)于博邁德公司；質(zhì)粒pET43a-10His-Nus由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；用于擴(kuò)增基因的引物在華大基因合成。

1.2 表達(dá)載體pET43a-10His-Nus-Endo Tb的構(gòu)建

以布氏錐蟲基因組作為模板，使用正向引物ETb-Fw0和反向引物ETb-Rv0對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Endo-Tb的基因片段。用XhoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶(TaKaRa)分別對(duì)基因片段和質(zhì)粒pBluescript II SK(+)進(jìn)行雙酶切，經(jīng)Ligation-Mix連接酶(TaKaRa)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于LB卡那抗性平板。挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR和限制性酶切的初步鑒定，將獲得的陽(yáng)性克隆送至上海六合華大基因測(cè)序，從而得到正確編碼的載體pBS-EndoTb。然后以pBS-EndoTb為模板，分別使用FL-43、D1-43、D2-43為正向引物，Rv-43為反向引物，擴(kuò)增3個(gè)不同長(zhǎng)度的基因片段，用EcoRI和XhoI分別對(duì)基因片段和質(zhì)粒pET43a-10His-Nus進(jìn)行雙酶切。連接轉(zhuǎn)化后涂布于LB氨芐抗性平板。鑒定后得到正確編碼的載體pET43a-10His-Nus-Endo Tb(FL)、pET43a-10His-Nus-Endo Tb(D1)和pET43a-10His-Nus-Endo Tb(D2)。構(gòu)建質(zhì)粒所用的引物在表1中列出。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 Nus-Endo Tb在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中的表達(dá)和純化

將重組表達(dá)載體pET43a-10His-Nus-Endo Tb(FL/D1/D2)分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS，挑取單菌落接種至5 mL LB氨芐液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，將菌液轉(zhuǎn)接至新的LB培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.8，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，16 ℃培養(yǎng)過夜。收集100 mL菌液，重懸于20 mL平衡緩沖液A(18 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L Na2HPO4，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4)，置于冰上超聲破碎后14 000 r/min離心30 min收集上清。使用蛋白純化系統(tǒng)AVANT(AKTA)純化上清中蛋白。首先，用平衡緩沖液A平衡親和層析柱HisTrpTMHP，上樣之后分別用含有12%、20%、40%、100%的洗脫緩沖液B(18 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L Na2HPO4，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.4)進(jìn)行梯度洗脫，收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。將目的蛋白透析除去高濃度咪唑后，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。

1.4 Nus-Endo Tb的水解活性檢測(cè)

初步反應(yīng)以0.1 pmol的NGA2-Asn-Fmoc作為底物，加入150 ng蛋白酶液，100 mmol/L的醋酸緩沖液(pH 5.5)，37 ℃反應(yīng)1 h。進(jìn)行反應(yīng)溫度優(yōu)化時(shí)，反應(yīng)溫度分別為25～50 ℃，其他條件相同。進(jìn)行pH優(yōu)化時(shí)，所用緩沖液為100 mmol/L pH值為3.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，其他條件相同。在95 ℃加熱5 min終止反應(yīng)，然后在10 μL的反應(yīng)體系中加入40 μL去離子水，高效液相色譜分析底物的轉(zhuǎn)化率。檢測(cè)條件：Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱，流動(dòng)相為0.3%的醋酸銨溶于57%的乙腈，流速1 mL/min，洗脫25 min，激發(fā)波長(zhǎng)265 nm，發(fā)射波長(zhǎng)315 nm，柱溫40 ℃，熒光檢測(cè)器檢測(cè)[10]。

1.5 Nus-Endo Tb底物特異性分析

以10 pmol不同的PA-糖鏈為底物，加入100～1 000 ng不等的蛋白酶液(調(diào)整使得每種底物轉(zhuǎn)化率在20%左右)，在100 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.5)中30 ℃反應(yīng)1 h，95 ℃加熱5 min終止反應(yīng)。在10 μL的反應(yīng)體系中加入40 μL去離子水，高效液相色譜法分析其底物的轉(zhuǎn)化率。所用色譜柱為Supelcosil LC18柱(2.1 mm×150 mm)，流動(dòng)相A為100 mmol/L醋酸-醋酸銨溶液，pH 4.0。流動(dòng)相B為100 mmol/L醋酸-醋酸銨溶液，0.5%正丁醇，pH 4.0。5%～50%的流動(dòng)相B線性洗脫25 min，流速為0.5 mL/min，在激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為400 nm的熒光條件下檢測(cè)，柱溫40 ℃[10]。

1.6 Nus-Endo Tb對(duì)糖蛋白的水解活性

分別以10 μg核糖核酸酶B和4 μg人類轉(zhuǎn)鐵蛋白作為糖蛋白底物，在20 μL反應(yīng)體系中加入10 μg蛋白酶液，在100 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.5)中30 ℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)樣品進(jìn)行SDS-PAGE，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，脫色觀察酶切效率。

1.7 Nus-Endo Tb的轉(zhuǎn)糖基活性

在10 μL反應(yīng)體系中，以100 μg唾液酸糖肽作為糖基供體，1.25 mmol/L MU-GlcNAc作為糖基受體，在100 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.5)中，加入10 μg Nus-Endo Tb酶液和5 mU來源于灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)的殼聚糖酶，在30 ℃分別反應(yīng)15，30，45 min。各取5 μL反應(yīng)液加入到96孔板中的250 μL甘氨酸緩沖液(150 mmol/L，pH 10.5)中混勻，在激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm的條件下讀取熒光值。將10 μg Nus-Endo Tb酶液在95 ℃加熱5 min使其滅活，同等條件下進(jìn)行反應(yīng)，作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Endo Tb的基因克隆及表達(dá)純化

通過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索從布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)的基因組中找到了ENGase的同源序列，通過用Clustal Omegae軟件進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)來源于布氏錐蟲的氨基酸序列和GH85家族的ENGase高度保守，如圖1-A(Endo-Tb的序列Tbr用黑色箭頭標(biāo)出)。在圖1(左)中，高保守氨基酸用白色字體黑色方框表示，相似氨基酸用白色字體灰色方框表示。保守氨基酸E538和N536在Endo-M及其他ENGase中被證實(shí)分別是活性催化位點(diǎn)必需氨基酸和噁唑啉中間體形成的必需氨基酸[11-13](黑色星號(hào)標(biāo)出)。在真核生物ENGases中高度保守的芳香族氨基酸已被報(bào)道是識(shí)別復(fù)合型糖鏈的必需氨基酸[14-15]，如圖1(右)，在Endo-Tb中相應(yīng)位點(diǎn)的苯丙氨酸也是芳香族氨基酸(黑色圓點(diǎn)標(biāo)出)，推測(cè)Endo-Tb有可能識(shí)別復(fù)合型糖鏈。

通過序列比對(duì)，確定Endo-Tb基因包含3個(gè)區(qū)域，分別為蛋白酶C97(6～146)區(qū)域[16]，PUB(230～300)區(qū)域[17]和GH85 (453～699)區(qū)域。GH85區(qū)域是ENGase酶的功能區(qū)域，為了探究前兩個(gè)區(qū)域的協(xié)助作用，本研究進(jìn)行了截短型突變，其中FL為全長(zhǎng)，D1截除了蛋白酶C97區(qū)域，D2截除了蛋白酶C97區(qū)域和PUB區(qū)域，如圖1-B所示。將3個(gè)長(zhǎng)度不同的基因連接到帶有Nus融合蛋白的原核表達(dá)載體pET43a-10His-Nus上。將pET43a-10His-Nus-Endo-Tb (FL/D1/D2)分別在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中誘導(dǎo)表達(dá)，然后通過HisTrpTMHP親和層析柱(GE)進(jìn)行純化，產(chǎn)量約為5 mg/L。Nus是一個(gè)61 kDa的蛋白標(biāo)簽，有助于增強(qiáng)融合蛋白的可溶性。Nus-Endo Tb (FL)融合蛋白大小為175 kDa，Nus-Endo Tb (D1)融合蛋白大小為159 kDa，Nus-Endo Tb (D2)融合蛋白大小為141 kDa。純化結(jié)果如圖1-C?？煽闯鯪us-Endo Tb (D1)的純度更高，無雜帶，但Nus-Endo Tb (FL)和Nus-Endo Tb (D2)蛋白有略微降解。

A-ENGases GH85家族氨基酸序列比對(duì)。Spn-肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)；Apr-原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacter protophormiae)；Bha-耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans)；Cci-灰蓋鬼傘(Coprinopsis cinereal)；Omi-Ogataeaminuta；Mhi-凍土毛霉(Mucorhiemalis)；Tbr-布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)；Ath-擬南芥(Arabidopsis thaliana)；Cel-秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditise legans)；Hsa-現(xiàn)代人類(Homo sapiens)。B-Nus-Endo Tb (FL/D1/D2)蛋白的區(qū)域分布。Nus-pET43a表達(dá)載體上的融合蛋白標(biāo)簽；Peptidase C97，蛋白酶C97區(qū)域；PUB-PUB區(qū)域；GH85-糖苷水解酶85家族區(qū)域。C-SDS-PAGE分析純化的融合蛋白Nus-Endo Tb(FL/D1/D2)。M-Marker；1，Nus-Endo Tb(FL)；2-Nus-Endo Tb(D1)；3-Nus-Endo Tb(D2)圖1 Endo-Tb的基因構(gòu)造和蛋白純化Fig.1 Construction and purification of Endo-Tb

2.2 Nus-Endo Tb的水解活性檢測(cè)

2.2.1 對(duì)NGA2-Asn-Fmoc的水解活性

以NGA2-Asn-Fmoc為底物，分別添加150 ng純化酶液Nus-Endo Tb (FL/D1/D2)，反應(yīng)后通過高效液相色譜法檢測(cè)到熒光產(chǎn)物GlcNAc-Asn-Fmoc(圖2)，說明3種蛋白酶液都可以水解NGA2-Asn-Fmoc中2個(gè)N-乙酰葡糖胺之間的β1-4糖苷鍵，驗(yàn)證了在Endo Tb基因的3個(gè)區(qū)域中GH85區(qū)域是酶的功能區(qū)域。由于在蛋白純化之后獲得D1的純度明顯高于FL和D2，而且在純化之后對(duì)酶液存儲(chǔ)的過程中，D1的酶液相對(duì)于FL和D2更穩(wěn)定，不易出現(xiàn)降解和蛋白質(zhì)沉淀，說明PUB區(qū)域?qū)τ诰S持酶的穩(wěn)定性是有一定幫助的，所以本文最終選擇只用含有PUB區(qū)域和GH85區(qū)域的D1進(jìn)行后續(xù)的研究。

圖2 HPLC檢測(cè) Nus-Endo Tb的水解活性Fig.2 HPLC analysis of hydrolysis activity of Nus-Endo Tb

2.2.2 溫度和pH的優(yōu)化

為了確定酶的最適反應(yīng)溫度，在溫度25～50 ℃范圍內(nèi)，測(cè)定D1對(duì)NGA2-Asn-Fmoc的水解活性，以最大酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖3-A。當(dāng)溫度在25～35 ℃時(shí)酶活較穩(wěn)定，溫度大于35 ℃時(shí)酶的活性迅速下降，最適溫度為30 ℃。然后在不同pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，測(cè)定pH值對(duì)酶活性的影響，以最大酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖3-B。當(dāng)pH低于4.0時(shí)酶失活，pH在6.0～7.0之間酶活較穩(wěn)定，當(dāng)pH大于7.0酶活迅速下降，最適反應(yīng)pH為6.5。

圖3 溫度和pH對(duì)酶活力的影響Fig.3 Optimization of temperature and pH

2.2.3 Nus-Endo Tb底物特異性分析

以各種結(jié)構(gòu)的PA-糖鏈作為底物，添加不同濃度的Nus-Endo Tb (D1)酶液，使得底物轉(zhuǎn)化率在20%左右，計(jì)算每種底物的比活力，然后以酶對(duì)三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的活力為100%，比較不同糖型相對(duì)于三甘露糖核心的相對(duì)活性。結(jié)果如表2中所示，Nus-Endo Tb (D1)對(duì)高甘露糖型的特異性更高，其中對(duì)7個(gè)甘露糖的糖鏈的活性最高，是三甘露糖核心的6倍以上，對(duì)6個(gè)甘露糖的糖鏈的活性是三甘露糖核心的4倍以上。但Nus-Endo Tb (D1)對(duì)短鏈的高甘露糖活性較低，對(duì)雙天線復(fù)合型糖鏈的活性約為三甘露糖核心的一半，而且不能作用于三天線復(fù)合型糖鏈。

表2 不同PA-糖鏈的相對(duì)酶活Table 2 Relative activities toward various PA-sugar

注：ND，無活性；●，甘露糖；■，N-乙酰氨基葡萄糖。

2.3 Nus-Endo Tb對(duì)糖蛋白的水解活性

天然牛胰核糖核酸酶B的N-糖鏈類型是高甘露糖型，糖鏈從5個(gè)甘露糖到9個(gè)甘露糖不等。人類轉(zhuǎn)鐵蛋白的糖鏈?zhǔn)峭僖核峄碾p天線型和三天線型的寡糖。以天然牛胰核糖核酸酶B和人類轉(zhuǎn)鐵蛋白為底物，檢測(cè)Nus-Endo Tb對(duì)糖蛋白的水解活性。以Endo-H和PNGase F作為對(duì)照，其中Endo-H可以切除高甘露糖中2個(gè)GlcNAc之間的連鍵，PNGase F可以水解N-糖蛋白中GlcNAc和天冬酰氨之間的連鍵，將糖蛋白上的糖鏈切除[18]。圖4結(jié)果顯示，Nus-Endo Tb可以完全切除核糖核酸酶B的高甘露型糖鏈，由于人類轉(zhuǎn)鐵蛋白含有三天線型寡糖，糖鏈不能被Nus-Endo Tb完全切除。

2.4 Nus-Endo Tb的轉(zhuǎn)糖基活性

A-M-Marker；1-未處理RNase B;2-Nus-Endo Tb酶切RNase B；3-Endo-H酶切RNase B B-M-Marker；1-未處理transferrin；2-Nus-Endo Tb酶切transferrin；3-PNGase F酶切transferrin圖4 核糖核酸酶B和人類轉(zhuǎn)鐵蛋白的水解Fig.4 Digestion of the N-glycan from RNase B and transferrin

來源于灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)的殼聚糖酶，作為一種糖苷內(nèi)切酶，可以水解GlcNAc2-MU中的熒光基質(zhì)底物四甲基傘形酮[19]，但是不能水解N-糖鏈中的核心殼二糖，也不能水解MU-GlcNAc中的四甲基傘形酮[20]。以SGP作為糖基供體，MU-GlcNAc作為糖基受體，首先SGP在Nus-Endo Tb的作用下發(fā)生水解，接著Nus-Endo Tb(D1)將水解后的糖鏈轉(zhuǎn)移到MU-GlcNAc受體上，殼聚糖酶可以水解掉GlcNAc2-MU中的熒光基質(zhì)底物MU，MU在堿性條件下變構(gòu)，在365 nm激發(fā)光照射下，發(fā)出460 nm發(fā)射光，根據(jù)熒光值的強(qiáng)度，可以檢測(cè)到Nus-Endo Tb轉(zhuǎn)糖基活性的大小。將這個(gè)Nus-Endo Tb(D1)和殼聚糖酶同時(shí)作用的復(fù)合酶反應(yīng)體系，在30 ℃分別反應(yīng)15，30，45 min，用pH 10.5甘氨酸緩沖液終止反應(yīng)。通過MU的熒光值檢測(cè)到在反應(yīng)的初始階段反應(yīng)速度較快，30 min之后趨于平衡。以高溫滅活的Nus-Endo Tb作為陰性對(duì)照，相同條件下可以檢測(cè)到輕微熒光值，說明殼聚糖酶對(duì)熒光底物MU-GlcNAc具有輕微的水解作用，當(dāng)Nus-Endo Tb存在時(shí)顯著增長(zhǎng)的熒光值驗(yàn)證了Nus-Endo Tb的轉(zhuǎn)糖基活性。

圖5 Nus-Endo Tb的轉(zhuǎn)糖基活性Fig.5 transglycosylation activity of Nus-Endo Tb

3 討論

在本研究中，發(fā)現(xiàn)了一種新的來源于布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)的ENGase，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的大量表達(dá)。在前期的工作中，曾嘗試通過His標(biāo)簽純化Endo-Tb蛋白，但由于蛋白表達(dá)量很低，而且容易降解，難以純化。后來嘗試pET系統(tǒng)的不同載體及標(biāo)簽，最后在pET43a載體上通過與N端的Nus標(biāo)簽融合表達(dá)，大大提升了蛋白的表達(dá)量和穩(wěn)定性，成功純化出Nus-Endo Tb融合蛋白。后來嘗試切除Nus標(biāo)簽，但切除后發(fā)現(xiàn)蛋白的穩(wěn)定性降低，所以選擇使用融合蛋白進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

在Endo-Tb基因的全長(zhǎng)序列中包含3個(gè)區(qū)域，即GH85區(qū)域之前還含有蛋白酶C97和PUB兩個(gè)區(qū)域。后來通過比較，發(fā)現(xiàn)PUB區(qū)域有利于維持蛋白的穩(wěn)定性，減少蛋白質(zhì)的降解。通過檢測(cè)水解活性以及底物特異性，Nus-Endo Tb能夠作用于高甘露糖型和復(fù)合型糖鏈，對(duì)含有7個(gè)甘露糖的糖鏈活性較高，其次是含有6個(gè)甘露糖的糖鏈，但是對(duì)三天線的雜合型糖鏈無活性。然后以天然牛胰核糖核酸酶B和人類轉(zhuǎn)鐵蛋白作為底物，檢測(cè)Nus-Endo Tb對(duì)糖蛋白的水解活性，Nus-Endo Tb對(duì)含有高甘露糖鏈的核糖核酸酶B的活性相對(duì)較高。當(dāng)用唾液酸糖肽作為糖基供體，GlcNAc-MU作為糖基受體，通過來源于灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)的殼聚糖酶的作用，在這個(gè)復(fù)合酶體系中，檢測(cè)到Nus-Endo Tb的轉(zhuǎn)糖基活性。

由于Nus-Endo Tb水解活性很高，轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物很快就被自身再次水解，所以通過其他方法難以檢測(cè)到轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物。在后續(xù)的研究中，還需要尋找一些能夠提高Nus-Endo Tb轉(zhuǎn)糖基活性的突變體，同時(shí)通過化學(xué)法合成合適的糖基噁唑啉作為糖基供體[21]，實(shí)現(xiàn)化學(xué)酶法合成新的糖肽和糖蛋白。