GLI-1信號途徑參與低氧誘導的宮頸癌Hela細胞侵襲的作用機制研究

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(1.重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400050；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400042；3.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400038；4.重慶市九龍坡區(qū)西彭鎮(zhèn)衛(wèi)生院外科，重慶 401326)

宮頸癌是臨床上常見的婦科惡性腫瘤之一，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的半數(shù)以上，其發(fā)病率和病死率均居發(fā)展中國家婦女惡性腫瘤前列[1-2]。宮頸癌的遠處浸潤性侵襲轉(zhuǎn)移是導致宮頸癌患者死亡的最主要原因[3]，抑制宮頸癌細胞的侵襲能力是有效治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，然而目前關(guān)于細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制并不十分清楚，這成為制約宮頸癌治療的瓶頸，因此，研究宮頸癌細胞的浸潤和侵襲機制有重要的臨床意義。

惡性實體腫瘤在快速生長過程中，由于腫瘤細胞的過度增殖必然會造成局部組織嚴重缺氧，造成供氧與耗能之間的不平衡[4]。局部低氧微環(huán)境是實體瘤的特征之一，其對維持腫瘤細胞能量代謝、新生血管形成以及增強腫瘤細胞侵襲能力起重要作用[5]。低氧能夠通過激活一系列下游信號通路，從而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展各個階段進行調(diào)控[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog(Hh)信號傳導通路在低氧環(huán)境下能夠激活，且在結(jié)腸癌、乳腺癌以及肝癌等多種惡性腫瘤組織中異常高表達，與惡性腫瘤的異常增殖和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-11]。有研究表明，GLI-1作為Hh信號通路的轉(zhuǎn)錄因子激活并轉(zhuǎn)錄了Hh信號通路大部分靶基因，并有可能參與了宮頸癌細胞的遠處侵襲[12]。而在低氧環(huán)境下，GLI-1基因在宮頸癌遠處侵襲中的研究尚未見報道。本研究旨在模擬低氧微環(huán)境，探討低氧微環(huán)境對人宮頸癌Hela細胞侵襲能力的調(diào)控及其可能分子機制，進一步揭示GLI-1在宮頸癌細胞遠處侵襲中的作用機制，為宮頸癌的臨床診斷及治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點。

1 資料與方法

1.1 材料

人宮頸癌Hela細胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)；Silencer TM Select GLI-1 siRNA委托上海吉瑪生物科技公司設計合成；總RNA 提取試劑盒購自日本寶(Takara)生物科技公司；β-actin、GLI-1、MMP2和MMP9 PCR引物由上海天一輝遠生物公司設計合成；多克隆兔抗人GLI-1、HIF-1α和β-actin抗體購自美國Abcam公司，辣根酶標記羊抗兔IgG購自武漢博士德生物公司；中分子量Protein marker購自Thermo Fisher公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司；胎牛血清購自杭州四季青生物科技公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國GIBCO公司；細胞及組織蛋白裂解液(RIPA)購自碧云天生物技術(shù)研究所；Pierce BCA蛋白分析試劑盒購自美國Thermo Scientific公司;0.45 mm PVDF膜購自美國Millipore公司；6孔板、25 cm2塑料培養(yǎng)瓶均購自海貍生物科技有限公司；24孔transwell小室(孔徑8 μm)購自美國Corning公司；侵襲實驗所用基底膜基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國BD公司；Co170R-230-0200三氣細胞培養(yǎng)箱(用于模擬缺氧細胞培養(yǎng)環(huán)境)購自德國Eppendorf公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；水平電泳槽、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽購自北京六一電子儀器公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人宮頸癌Hela細胞株在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件的細胞培養(yǎng)箱中用含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。采用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取第三、四代處于對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。細胞培養(yǎng)至融合70%～80%后，用無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，再將細胞分別置入常氧和低氧環(huán)境下處理指定時間，按實驗要求分組。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)

β-actin 引物序列:上游5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3’，下游5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’；GLI-1 引物序列:上游5’-CCGTCATCTCCGACTTCATCT-3’，下游5’-GTGTCTCCTCCCTGTTGTTCTG-3’；HIF-1α引物序列:上游5’-TCAACACGACACCGGATAAA-3’，下游5’-CCGCGAGCTATCTTTCTTCA-3’。PCR反應條件:94 ℃預變性2 min，94 ℃ 變性20 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共進行32個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，擴增產(chǎn)物4 ℃保存。對實時定量PCR儀結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.4 Western blot檢測

將Hela細胞分別置于常氧和低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，處理完畢后將6孔板中的貼壁細胞用預熱的PBS洗滌3次后在RIPA裂解液中進行裂解。隨后用塑料細胞刮將細胞輕柔刮下，并轉(zhuǎn)移到EP管，置于冰上裂解15 min。隨后于12 000 r/min離心5 min，棄去沉淀，將收集到的上清液置于-20 ℃凍存。使用BCA法測蛋白濃度，隨后上樣，先用80 V電泳積聚蛋白，隨后用120 V電壓使蛋白分離并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。使用多克隆兔抗人GLI-1、HIF-1α和β-actin抗體分別與PVDF膜接觸4 ℃孵育過夜后，用TBST在脫色搖床下洗膜5 min×3次，隨后加辣根酶標記羊抗兔IgG，室溫下孵育1 h后，用TBST洗膜5 min×3次。隨后加入ECL化學發(fā)光液進行曝光，圖片掃描，用Quality One分析軟件將圖片上的特異條帶灰度值數(shù)字化， 并與內(nèi)參灰度值比較得出每次實驗的相對數(shù)值。

1.5 小干擾RNA轉(zhuǎn)染

提前在4 ℃融解Matrigel基質(zhì)膠，每個聚碳酸酯微孔膜表面鋪以40 μL稀釋的Matrigel膠(matrigel與無血清培養(yǎng)基之比為1∶3)，放入培養(yǎng)箱待用。選取對數(shù)生長期的細胞以每孔3×105個細胞接種至于6孔板上，培養(yǎng)24 h后待細胞密度達到50%～60%，更換無血清培養(yǎng)基并按照LipofectamineTMRNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑說明書進行GLI-1干擾引物的轉(zhuǎn)染，同時設立空白對照組(Control SiRNA)。每組各設2個孔，每孔GLI-1 siRNA及空白對照siRNA的濃度均為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染6 h后更換新的無血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后提取各組樣本的mRNA及蛋白，實驗重復3次。

1.6 Transwell 細胞侵襲實驗

細胞侵襲試驗：提前在4 ℃融解Matrigel基質(zhì)膠，每個聚碳酸酯微孔膜表面鋪以40 μL稀釋的Matrigel膠(matrigel與無血清培養(yǎng)基之比為1∶3)，放入培養(yǎng)箱中4 h凝固備用。將處于對數(shù)生長期的Hela細胞在無血清RPMI 1640培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后,使用0.25% EDTA胰蛋白酶消化，接著無血清RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮成單細胞懸液。將200 μL的不含血清Hela細胞懸液以1×108/L接種于Transwell上室(Corning)，下室加入600 μL的含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，每組設3個復孔。實驗按如下分組:常氧對照組、低氧組、常氧對照+GLI-1 siRNA組，低氧+GLI-1 siRNA組。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，棄培養(yǎng)液，甲醇固定20 min，將小室室溫風干5 min，采用0.1%結(jié)晶紫染色20 min;PBS洗3遍，濕棉簽擦盡上室面細胞，光學顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)小室下室面的細胞數(shù)，每組設3復孔，取平均值做統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 低氧微環(huán)境促進宮頸癌Hela細胞體外侵襲能力

在不同氧濃度下培養(yǎng)Hela細胞48 h，以正常培養(yǎng)細胞為對照組，結(jié)果顯示，低氧處理組中Hela細胞的侵襲能力顯著增強，與常氧組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

2.2 低氧微環(huán)境上調(diào)Hela細胞HIF-1α、GLI-1基因表達

經(jīng)過常氧和低氧環(huán)境下分別處理后24 h后，RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示，與常氧培養(yǎng)組相比，低氧培養(yǎng)的Hela細胞的HIF-1α、GLI-1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(圖2)。

2.3 GLI-1 siRNA 靶向抑制Hela細胞 GLI-1 mRNA和蛋白表達水平

轉(zhuǎn)染GLI-1特異性siRNA及GLI-1-NC siRNA于Hela細胞48 h后，分別采用RT-PCR和Western blot檢測GLI-1 mRNA和蛋白表達。結(jié)果顯示，與GLI-1陰性對照組和空白對照組相比，GLI-1 siRNA組的GLI-1明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

a:常氧；b:低氧;c:Transwell實驗各組穿膜細胞數(shù)統(tǒng)計分析 *：與常氧組比較，P<0.05

a:RT-PCR檢測HIF-1α、GLI-1 mRNA表達；b：Western blot檢測HIF-1α、GLI-1蛋白表達；c：Western blot結(jié)果定量分析 *：與常氧組比較，P<0.05

圖2低氧微環(huán)境對宮頸癌Hela細胞GLI-1基因表達水平的影響

a：GLI-1 si-RNA轉(zhuǎn)染熒光圖( ×400)；b：RT-PCR檢測GLI-1 mRNA表達；c：Western blot檢測GLI-1蛋白表達；d：Western blot結(jié)果定量分析 *：與陰性對照組比較，P<0.05

圖3GLI-1siRNA在Hela中有效沉默GLI-1基因表達

2.4 沉默GLI-1表達減弱低氧誘導的體外侵襲能力

為進一步驗證GLI-1是否對低氧微環(huán)境誘導的Hela細胞侵襲產(chǎn)生影響，在Transwell小室侵襲實驗中，我們發(fā)現(xiàn)與低氧組和低氧+NC siRNA組相比，使用GLI-1 siRNA阻斷其表達后，低氧培養(yǎng)的Hela細胞的侵襲能力被顯著削弱(圖4)。

a:常氧;b:低氧;c:低氧+si NC;d:低氧+si GLI-1;e:Tanswell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力統(tǒng)計分析

圖4沉默GLI-1抑制低氧微環(huán)境誘導的Hela細胞侵襲(結(jié)晶紫染色×200)

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，60%的患者確診時已發(fā)展為浸潤癌并伴隨不同程度的遠處侵襲轉(zhuǎn)移，嚴重影響了宮頸癌的治療和預后[13]。臨床上一旦發(fā)生局部浸潤，患者生存率則顯著降低，而遠處侵襲則是導致患者預后差的主要原因[14]。因此，如果能尋找有助于早期預測宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子，那么對宮頸癌實施個體化治療及改善預后都具有重要意義。

大多數(shù)實體瘤具有缺氧的微環(huán)境，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中一個關(guān)鍵的步驟是腫瘤細胞對缺氧的適應[15-16]。為了適應低氧代謝應激條件，腫瘤細胞能夠通過激活一系列信號調(diào)控機制，如促進周邊新生血管生成、增強細胞新陳代謝、遷移等，促進了細胞的異常增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等。缺氧微環(huán)境可通過調(diào)控多種基因表達，從而促進惡性腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，其中Hedgehog(Hh)信號通路在這一過程中發(fā)揮重要作用[17-19]。Hh信號通路在哺乳動物胚胎發(fā)育和胚胎形成后細胞的生長和分化過程中具有重要作用，其異常激活幾乎參與人體各系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生[20-21]。GLI-1是Hh信號通路下游分子，其作為核轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合而激活靶基因轉(zhuǎn)錄。研究表明在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤組織中該通路成員SHH、SMO、PTCH、GLI均存在異常激活，表明此通路的激活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[22-26]。配體SHH可與受體PTCH結(jié)合，解除PTCH對SMO的抑制，活化的SMO激活其下游轉(zhuǎn)錄因子GLI-1，從而進入細胞核內(nèi)促進其下游基因轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤細胞侵襲和浸潤[27]。因此，GLI-1不僅是Hh信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其上調(diào)激活也是該通路活化的標志。研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸鱗狀細胞癌組織中存在GLI-1基因的一場高表達，其可能參與了宮頸癌的發(fā)病[28]。

本實驗中，我們首先驗證了體外低氧微環(huán)境對宮頸癌Hela細胞系侵襲能力的影響。結(jié)果表明，與常氧對照組相比，Hela細胞經(jīng)過低氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h后，細胞侵襲能力顯著增強。進一步研究低氧環(huán)境下這一現(xiàn)象的分子機制發(fā)現(xiàn)，與常氧對照組相比，低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后Hela細胞中Hh信號通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GLI-1顯著激活，提示其可能參與低氧環(huán)境下肺癌的侵襲過程。為了進一步明確GLI-1在低氧微環(huán)境下Hela細胞侵襲中的作用機制，我們采用特異性GLI-1 si-RNA來阻斷其表達，并進一步檢測其對細胞侵襲的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在靶向沉默GLI-1基因之后，低氧介導的細胞侵襲現(xiàn)象被阻斷，表明GLI-1在這一過程中起著關(guān)鍵作用?；谝陨涎芯?，我們推測低氧通過GLI-1基因來調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活，從而促進宮頸癌細胞的遠處侵襲，最終促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本文初步證實在宮頸癌Hela細胞系中低氧微環(huán)境能夠通過激活Hh信號通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GLI-1來促進腫瘤細胞的遠處侵襲，這將有助于進一步認識宮頸癌的發(fā)病機制。因此，深入研究GLI-1基因在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其調(diào)節(jié)機制，通過靶向阻斷GLI-1基因表達，從而抑制腫瘤細胞的遠處侵襲，這將為宮頸癌的特異性治療提供新的思路和依據(jù)，具有廣泛的臨床意義和良好的應用前景。