陜西不同產區(qū)蘋果香氣物質差異分析

劉瀟然，石金瑞，劉翠華，李 瑞，周 彬，張玉潔，任小林

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

蘋果的品質主要由外觀、風味及硬度決定。然而，隨著蘋果中品質概念的演變，消費者將越來越多的注意力集中在風味屬性上[1]。蘋果的風味作為一種既獨特又重要的品質特征，由味道和香氣決定[2]。味道主要由可溶性固形物和有機酸決定，而香氣則是由許多揮發(fā)性物質組成的復雜混合物[3]。關于蘋果中揮發(fā)性物質的研究已經超過50 a，共鑒定出300多種揮發(fā)性化合物[4-5]，主要包括醛類、醇類、酯類、酮類、醚類和萜烯類。醛類物質大多是具有青香或者青草香及新鮮水果的氣味，主要對蘋果香味譜的清香特點有貢獻。醇類物質的主要氣味為清香、新鮮水果味、甜花香和果香等氣味。而酯類物質作為蘋果香味最重要的貢獻者，是成熟果實中果香氣味的主要來源[6]。在這些揮發(fā)性物質中，僅有一部分香氣值大于1的特征香氣物質會對果實的總體香味譜起重要作用[7]，也可進一步對香氣值進行轉化，用lg(香氣值)>0來表示。另外，揮發(fā)物的種類和含量主要與品種[8-9]、產地[10]、栽培環(huán)境[11]、采后處理[12]及貯藏條件[13]等因素相關[14]。

陜西作為中國黃土高原優(yōu)質蘋果產區(qū)的重要省份之一[15]，所產蘋果以其獨特的外觀品質和風味優(yōu)勢贏得了國內外消費者的青睞[16]。根據(jù)中國統(tǒng)計局數(shù)據(jù)，2015年陜西蘋果總產量達1 037.3萬t?！皇俊云涔麄€大、果型好、肉質嫩細、多汁液、糖酸比高及耐貯運等諸多優(yōu)良品質，成為陜西省乃至中國的主栽果樹品種之一。研究發(fā)現(xiàn)，‘富士’蘋果的揮發(fā)性物質中酯類、醇類和醛類物質的相對含量較高[17]，但對陜西省不同海拔產地‘富士’揮發(fā)性物質之間的差異卻鮮有報道。本試驗采用氣相色譜與質譜聯(lián)用儀對陜西省不同海拔區(qū)域的‘富士’蘋果的揮發(fā)性成分進行分離鑒定。旨在通過分析比較各地區(qū)香氣組分的異同及其香氣活性組分，以期為進一步了解海拔因素對‘富士’蘋果揮發(fā)性物質的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 分別在韓城市、寶雞陳倉區(qū)、渭南白水縣、咸陽彬縣、榆林清澗縣、延安寶塔區(qū)、銅川宜君縣的商業(yè)果園中于商業(yè)采收期采收‘富士’蘋果。這些地區(qū)海拔見表1，其中韓城海拔最低為457 m，寶雞最高為1 300 m。選擇大小均勻及無機械損傷的果實進行研究。所有果實采摘后立即運回實驗室，然后統(tǒng)一放置于0 ℃，相對濕度85%～90%的冷庫中貯藏3個月。之后將蘋果樣品取出，利用四分法，取果皮和果肉的混合樣，于液氮中研磨成均勻的粉末，分別裝入10 mL的離心管中，置于-80 ℃條件下待測。

1.1.2 試劑 標準試劑：2-甲基-1-丙醇、1-丁醇、1-戊醇、1-己醇、2-甲基乙酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、乙酸己酯、丙酸己酯、己酸丁酯、丁酸己酯、己酸己酯、辛酸己酯、己醛、壬醛、反式-2-己烯醛、α-法呢烯，購于Sigma公司，2-甲基-1-丁醇、丙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、丁酸丁酯、法尼醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、6-甲基-5-庚烯-2-醇，購于Alfa公司，1,3-辛二醇購于Amatek公司，以上標準試劑均用于揮發(fā)性物質的定量、甲基叔丁基醚(MTBE)(HPLC高效液相色譜級)主要用于香氣物質的萃取，購于美國Tedia公司、用于計算保留指數(shù)(RI)的C7-C30烷烴混和標試劑購買自美國Supelco公司，用于香氣物質定性和定量分析的所有標準試劑見表2。

表1 7個地區(qū)平均海拔Table 1 Average altitude of seven areas

表2 香氣物質GC-MS分析所用的標準品試劑Table 2 Authentic standard of aroma compounds used in GC-MS analysis

1.2 儀器與設備

分析研磨機(A11 basic，德國艾卡)、旋渦混合器(QT-1，上海琪特股份有限公司)、超聲清洗儀(SB25-12 DTD，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司)和氮吹儀(MD-200，杭州奧盛儀器有限公司)，ISQ氣質色譜-質譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 香氣物質的提取和GC-MS分析

1.3.1 香氣物質的提取 稱取2 g研磨樣品于10 mL離心管內，加入3 mL超純水渦旋1 min，待樣品與超純水充分混合后，加入3 mL MTBE和10 μL內標[V(3-壬酮)∶V(甲醇)=5∶30 000]，使用旋渦混合儀混合均勻。然后將其置于超聲清洗儀中超聲萃取30 min后取出離心(4 ℃，11 000g) 15 min。離心結束后，吸取900 μL上清液至2 mL離心管中，在氮吹儀下緩慢將其濃縮至300 μL，使用0.22 μm的有機濾膜進行過濾后轉移至進樣瓶，待測。

1.3.2 GC-MS分析 利用氣相和ISQ的質譜進行，進樣量為1 μL，色譜柱為VF-WAXms(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)。色譜柱升溫程序為：起始溫度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至150 ℃，以8 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。進樣口溫度為230 ℃，采用不分流進行模式。傳輸線和離子源的溫度均為240 ℃。載氣為高純He(99.999%)，流速為1 mL/min；利用電子轟擊離子源，電子能量為70 eV 質譜掃描m/z為33～380。

1.4 揮發(fā)性物質的定性和定量

蘋果揮發(fā)性物質的定性通過NIST庫(NIST2014)進行質譜比對，同時結合保留指數(shù)(RI)進行。GC-MS分析所得圖譜均利用Xcalibur和AMDIS 軟件進行解析。定量基于標準物質的校正因子(CF)。

香氣物質的定量：基于相應標準試劑的校正因子對各香氣組分進行定量計算，其中CF的計算公式為：

CF=[(C1/A1)/(C2/A2)]

其中，C1為標準試劑的濃度,A1為選擇離子模式下標準試劑的峰面積，C2為內標3-壬酮的濃度,A2為3-壬酮的峰面積(QI=113)；

進一步各香氣組分的計算公式為：

C3=CF×A3C4/A4

其中，CF為被測組分的校正因子，C3為被測組分的濃度，C4為被測樣品中內標的濃度，A3為被測組分在選擇離子下的峰面積，A4為被測樣品中內標的峰面積(QI=113)。

標準試劑品利用MTBE進行稀釋(體積比為1∶150 000)，同樣加入內標 [V(3-壬酮)∶V(MTBE)=1∶900 000]，然后進行GC-MS分析，進樣量1 μL，方法同上。

1.5 數(shù)據(jù)的處理

GC-MS原始數(shù)據(jù)文件經Xcalibur和 AMDIS解析，用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

不同海拔產地‘富士’蘋果揮發(fā)性物質的種類和質量分數(shù)如表3所示。表3可以看到，不同產地‘富士’蘋果中共檢測到34種揮發(fā)性物質。這些物質可以分為7類：醇類8種，酯類15種，醛類4種，有機酸類2種，倍半萜類2種，酚類2種、酮類1種。在韓城、寶雞、渭南、咸陽、榆林、延安和銅川分別檢測到27、30、34、31、30、29和32種揮發(fā)性物質。其中渭南地區(qū)檢測到的揮發(fā)性物質的種類最多，為34種，韓城地區(qū)檢測到的揮發(fā)性物質的種類最少，為27種，寶雞和榆林地區(qū)檢測到的揮發(fā)性物質的種類均為30種。

由圖1可知，7個地區(qū)的‘富士’蘋果中所檢測出的揮發(fā)性物質主要為醇類、酯類和醛類物質。這3類物質的質量分數(shù)均占總揮發(fā)性物質質量分數(shù)的93%以上。其中，延安地區(qū)的醇類和醛類占揮發(fā)性物質總量的比例最高，分別為45.64%和27.19%。而韓城的酯類物質占揮發(fā)性物質總量的比例最高，為38.56%。在7個地區(qū)的‘富士’蘋果中，韓城、寶雞和榆林這3個地區(qū)占比最高的揮發(fā)性物質為酯類，而其他4個地區(qū)占比最高的揮發(fā)性物質則為醇類。

7個地區(qū)的‘富士’蘋果中，1-丁醇和2-甲基-1-丁醇等丁醇類物質占醇類物質總質量分數(shù)的50%以上，在一定海拔范圍內，1-丁醇的質量分數(shù)隨著海拔的升高明顯增加，總體表現(xiàn)為先升后降趨勢。丁酯和己酯類物質是7個地區(qū)的‘富士’蘋果中最主要的酯類物質。乙酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸乙酯和己酸己酯這5種酯類物質的的質量分數(shù)占酯類物質總質量分數(shù)的80%以上。在海拔不同7個地區(qū)的‘富士’蘋果中，己醛和反式-2-己烯醛這2個醛類物質的質量分數(shù)占醛類物質總量的89%以上。

圖1 7個地區(qū)‘富士’蘋果中揮發(fā)性物質種類占總比例Fig.1 Mass fraction ratios of different volatile components of‘ Fuji’ apples in seven areas

由圖2可以看出，隨著海拔的升高，揮發(fā)性物質的質量分數(shù)呈先升后降趨勢。揮發(fā)性物質的總量及酯類物質的總質量分數(shù)在海拔960 m的榆林地區(qū)均達到最大，分別為42 778.66和17 725.42 μg/kg。醇類物質的總質量分數(shù)則是在海拔835 m的咸陽地區(qū)達到最高(16 468.02 μg/kg)。醛類物質的總質量分數(shù)隨海拔的變化出現(xiàn)先降再升趨勢，在海拔1 104 m的延安地區(qū)達到最大值(9 162.18 μg/kg)。倍半萜類物質即α-法呢烯質量分數(shù)變化趨勢與揮發(fā)性物質總量的變化趨勢相同，即先升后降，在榆林地區(qū)達到最大值(977 μg/kg)。有機酸類和酚類物質總含量的最大值分別出現(xiàn)在咸陽和延安地區(qū)。另外酮類只在渭南、咸陽以及銅川的‘富士’蘋果中檢測到。

圖2 醇類、酯類、醛類和倍半萜類物質隨海拔變化以及揮發(fā)性物質總質量分數(shù)隨海拔變化Fig.2 Alcohols，esters，aldehydes and sesquiterpenes concentration during altitudes and volatile components mass fraction during altitudes

香氣值為某種揮發(fā)性物質的含量與其香氣閾值的比值，lg(香氣值)>0的揮發(fā)性物質被認為是果實的特征香氣成分[38-39]，通過對所有揮發(fā)性物質香氣值的計算可得表4，由表4可知，在不同產地的‘富士’蘋果中共有16種特征香氣成分。其中，包含有4種醇類、9種酯類、2種醛類和1種酮類物質。

在韓城、寶雞、渭南、咸陽、榆林、延安和銅川的‘富士’蘋果中的特征香氣成分的種類分別為10、11、14、15、13、13和14種，特征香氣種類最多的咸陽地區(qū)香味最濃郁，而特征香氣最少的韓城地區(qū)香味在這7個地區(qū)中最不濃郁。具有蘋果香味的丙酸己酯是渭南地區(qū)的‘富士’蘋果中獨有的特征香氣物質。對陜西地區(qū)不同產地的‘富士’蘋果來說，具有果香氣味的酯類物質為其主要的香氣貢獻組分。

本試驗中檢測到的醛類物質己醛和反式-2己烯醛主要對蘋果的清香氣有貢獻，酯類物質，如2-甲基乙酸丁酯、乙酸己酯、乙酸丁酯和2-甲基丁酸己酯等主要對蘋果的果香有貢獻。檢測到的4種醇類物質則賦予了蘋果以更加豐富的氣味，如1-己醇具有青草香味，1-丁醇具有甜香味，2-甲基-1丁醇具有令人愉悅的香味，2-甲基-丙醇具有化學氣味。而酮類物質6-甲基-5-庚烯-2-酮則是唯一具有柑橘香和草莓香的物質。

主成分分析是多變量數(shù)據(jù)降維處理的分析方法[35]，根據(jù)香氣值大于1的所有香氣組分對各個地區(qū)‘富士’蘋果進行主成分分析。在檢測出的34種揮發(fā)性物質中，有16種特征香氣，這些特征揮發(fā)性物質能夠體現(xiàn)各個地區(qū)‘富士’蘋果的香氣特點[36]。因此選取香氣值大于1的這16種特征揮發(fā)性成分對7個地區(qū)的‘富士’蘋果進行主成分分析。

主成分分析顯示(表5)，提取出的6個主成分可以解釋初始數(shù)據(jù)集總方差的100%。其中，第1主成分(PC1)、第2主成分(PC2)和第3主成分(PC3)分別可以解釋總方差變異的55.36%、18.22%和12.72%，這3個PCs的累計方差貢獻率總和達到86.54%。

表5 各揮發(fā)性物質的貢獻Table 5 Contribution of volatile components

圖3顯示不同地區(qū)的‘富士’在前3個主成分上的得分分布，從圖中可以明顯地看出寶雞、韓城和渭南這3個地區(qū)集中在一起。其余地區(qū)在3D散點圖中并不能明顯的看出分布規(guī)律。以各個地區(qū)在PC1和PC2的得分做二維分布圖，可以將7個地區(qū)大致分在3個象限。榆林地區(qū)的富士蘋果在PC1上有極高的得分而在PC1上主要起主要貢獻作用的是2種醇類、6種酯類和1種醛類物質即 1-丁醇、1-己醇、乙酸丁酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、乙酸己酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯和反式-2-己烯醛，說明這些物質反應榆林地區(qū)‘富士’蘋果的香氣特點。延安地區(qū)在PC2上有極高的得分，在PC2上起主要貢獻作用的是1種酯類和1種醛類，即2-甲基乙酸丁酯和己醛，說明這2種揮發(fā)性物質對延安地區(qū)‘富士’的香氣特性有著很重要的作用。以各個地區(qū)在PC1和PC3上的得分做二維分布圖，可以明顯觀察到咸陽地區(qū)的‘富士’蘋果在PC3上有很高的得分，根據(jù)表4可得對PC3貢獻作用較大的是2種醇類2-甲基-1丙醇和2-甲基-1-丁醇和一種酮類6-甲基-5-庚烯-2-酮。

a.7個不同地區(qū)3D得分圖3-D score plot of the 7 different areas；b.7個不同地區(qū)在PC1-PC2上得分圖2-D biplots on PC1-PC2 plane scores plot of the 7 different areas；c.7個不同地區(qū)在PC1-PC3上得分圖2-D biplots on PC1-PC3 plane scores plot of the 7 different areas

3 討 論

趙峰等[17]的研究表明‘紅富士’蘋果的香氣成分中酯類、醛類和醇類化合物的相對含量均較高，其中以酯類物質的含量最高，因此，將紅富士蘋果歸為了“酯類型”蘋果品種，這可能與富士的親本為‘國光’(醇類型)和‘元帥’(酯類型)有關。這與本試驗得到的結果相同，所有地區(qū)的‘紅富士’蘋果的揮發(fā)性成分中醇類、酯類和醛類這3類物質的質量分數(shù)總和均占相應的揮發(fā)性物質總質量分數(shù)的93%以上，其中韓城、寶雞和榆林地區(qū)的‘紅富士’蘋果中占比最高的揮發(fā)性物質為酯類，而其他4個地區(qū)的‘紅富士’蘋果中占比最高的組分則為醇類物質。雖然不同地區(qū)的‘紅富士’蘋果中的醇類和酯類物質的質量分數(shù)占比不同，但從特征香氣的組成上來看，酯類物質的貢獻更大，因此可將‘紅富士’蘋果歸為“酯香型”蘋果品種。

本試驗檢測到的揮發(fā)性物質共有34種，其中己醛、反式-2-己烯醛、己醇、2-甲基-1-丁醇、1-丁醇、乙酸己酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、2-甲基丁酸己酯、2-甲基丁酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯和α-法呢烯在之前的研究中[10，17，37]均有檢測到，是‘富士’蘋果中最重要的揮發(fā)性物質。另外，陜西7個不同地區(qū)的‘富士’蘋果中均檢測到1，3-辛二醇，該物質在之前的研究中鮮有報道。

有研究表明，同一地區(qū)高海拔果園有利于酯類和醛類物質的積累和釋放，低海拔果園有利于果實中醇類和酮類等香氣物質的積累[40]。何義等[41]研究河北省不同產地‘富士’蘋果的香氣成分，結果表明海拔較高的承德(375 m)、石家莊(82 m)和邢臺(76.8 m)的‘富士’果實中酯類和醛類質量分數(shù)較高，海拔較低的秦皇島(2.1 m)、保定(17 m)的果實中醇類質量分數(shù)較高。在本研究中，‘富士’的揮發(fā)性物質總質量分數(shù)隨著海拔升高呈現(xiàn)先升后降趨勢，但不同種類揮發(fā)性物質達到最高質量分數(shù)的海拔不同。醇類物質總量在海拔835 m的咸陽地區(qū)最先達到峰值，而酯類和醛類物質的總量則分別在海拔980 m的榆林地區(qū)和海拔1 104 m的延安地區(qū)達到最大值。本試驗中醇類物質相比醛類和酯類物質出現(xiàn)高峰的海拔稍低一些。果實揮發(fā)物的合成受許多因素的共同影響，因此，在選取‘富士’蘋果栽培地區(qū)時也需要考慮海拔因素的影響。

4 結 論

本試驗共鑒定出‘富士’蘋果的34種揮發(fā)性物質組分，包括醇類、酯類、醛類、酸類、酚類、倍半萜類和酮類。從檢測到的香氣物質的種類和質量分數(shù)可得陜西省不同地區(qū)的‘富士’蘋果香氣組份均存在差異。通過香氣值的計算，特征香氣物質共有16種，主要包括酯類、醇類和醛類等主要香氣貢獻組份。主成分分析(PCA)結果表明，可以通過特征香氣物質的差異將不同產地的‘富士’蘋果區(qū)分開。榆林、延安和咸陽分別在PC1、PC2和PC3上有很高的得分，而這3個PC分別由酯類、醛類和醇類物質解釋。揮發(fā)性物質總含量隨著海拔的升高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中揮發(fā)性物質含量最高的地區(qū)是榆林42 778.65 μg/kg，最低為韓城20 969.20 μg/kg。酯類、醛類和醇類物質達到最高值的地區(qū)并不相同，分別為榆林、延安和咸陽。