甘藍(lán)型油菜種子特異表達(dá)油體蛋白啟動(dòng)子PBnOA03的克隆及功能分析

王海蘭，賈慶利，趙翠珠，楊 錚，王 凱，劉香伶，唐 通，宋 歡，張 猛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是基因功能分析和外源基因在植物中穩(wěn)定表達(dá)的一種不可或缺的強(qiáng)大工具。在植物遺傳工程中，引入的靶基因通常需要在特定的時(shí)期或組織器官中表達(dá)，這些問題通常通過特異表達(dá)的啟動(dòng)子來解決。啟動(dòng)子在起始和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中有著重要的作用，也是分子育種中的重要研究部分。目前已有很多啟動(dòng)子被鑒定，并在農(nóng)業(yè)基因工程中用來控制基因的表達(dá)。例如CaMV 35S啟動(dòng)子[1]、RuBisCo大型亞基啟動(dòng)子[2]和NOS啟動(dòng)子[3]。在大多數(shù)情況下，目標(biāo)基因是被一個(gè)組成型啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)而表達(dá)。例如CaMV 35S，這一啟動(dòng)子在植物的大部分組織中都具有較強(qiáng)的表達(dá)水平。然而，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的連續(xù)合成和大量的積累，會對轉(zhuǎn)基因植物的代謝過程造成干擾，從而產(chǎn)生一些不良的多效性反應(yīng)[4]，有時(shí)還會對組織產(chǎn)生毒性[5]。因此，有效利用特異表達(dá)的啟動(dòng)子，將會極大地滿足轉(zhuǎn)基因作物的需求[6]。這類啟動(dòng)子被稱為組織特異性啟動(dòng)子[7]，包括葉片、莖、根、果實(shí)、花粉和種子等特異性啟動(dòng)子。

油菜(BrassicanapusL.)是重要的油料作物之一，是植物油和植物蛋白的重要來源，在中國乃至全世界都有廣泛的種植[8]。油菜種子的產(chǎn)量及其品質(zhì)直接關(guān)系到油菜的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，除了作為食用油，油菜籽還可作為生物能源，這也是用來解決未來能源危機(jī)的途徑之一。因此，可以通過構(gòu)建一個(gè)種子特異性的啟動(dòng)子來讓基因在油菜種子中特異性表達(dá)，從而達(dá)到改良油菜種子特性、提高油菜的產(chǎn)量和改良油菜脂肪酸組分的目的[9]。目前，油菜中報(bào)道的特異性啟動(dòng)子的研究相對來說較少，并且大部分還受到專利的保護(hù)。因此，油菜組織特異性啟動(dòng)子的研究，對于油菜及其他作物的基因工程改良方面都會具有極其重要的作用。甘藍(lán)型油菜在種子特異性啟動(dòng)子的研究方面主要注重于油菜籽的特性改良，近些年來應(yīng)用最多最廣泛的屬于napin啟動(dòng)子。napin是十字花科植物中重要的儲藏蛋白，由多基因編碼，在種子發(fā)育后期開始表達(dá)。最早在1987年，Josefsson等[10]克隆到編碼儲藏蛋白napA的基因；隨后Ericson等[11]克隆到napB上游序列，發(fā)現(xiàn)了和擬南芥同源性較高的一些保守區(qū)域；Zhang等[12]從油菜基因組中分離出來300 bp的napinB基因，經(jīng)序列分析表明，該序列含有與種子特異相關(guān)的高度保守的順式元件，在煙草中轉(zhuǎn)化并通過GUS報(bào)告基因分析表明，它在胚和胚乳中特異性表達(dá)。另外，亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)， FAE1能在胚珠中特異性表達(dá)[13]。隨后有研究者對 FAE1的上游區(qū)域進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)上游序列中含有較多與種子特異表達(dá)相關(guān)的順式作用元件，例如RY-repeat[14]、G-box和E-box[15-16]。

油體蛋白(Oleosin)是一類存在于油體表面的小分子蛋白[17]，存在種子特異表達(dá)和非特異表達(dá)兩種類型。本研究中，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在對甘藍(lán)型油菜種子中油體蛋白基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，選擇種子特異表達(dá)的油體蛋白，開展啟動(dòng)子PBnOA03的克隆、序列分析以及轉(zhuǎn)基因株系的功能驗(yàn)證。這種種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子，可以作為農(nóng)作物基因工程種子改良新的工具。該啟動(dòng)子順式元件的分析，也為以后油體蛋白的調(diào)控研究提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為陜西省油菜雜交中心提供的甘藍(lán)型油菜‘秦油7號’；野生型擬南芥為Columbia生態(tài)型Col-0；試驗(yàn)所用大腸桿菌為DH5α；農(nóng)桿菌菌株為GV3101，表達(dá)載體為pBI121。

質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購置于Omega公司；T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶購置于Takara公司；DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、高保真DNA聚合酶購置于全式金公司；DNA Marker購置于西安擎科生物公司；試驗(yàn)中所涉及的引物均使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成，由西安擎科生物公司合成。

1.2 甘藍(lán)型油菜油體蛋白基因在組織中的表達(dá)量分析

通過表達(dá)量分析網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn& BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=SRA&SHOW_DEFAULTS=on)對備選基因在油菜種子不同發(fā)育時(shí)期和在根、子葉、葉片等不同組織的表達(dá)量進(jìn)行分析。首先，在NCBI的SRA中搜索相關(guān)的信息，找到油菜表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得其SRX號以及表達(dá)數(shù)據(jù)(N)；其次，在SRA的BLAST頁面中，將備選的基因序列與SRX進(jìn)行比對，表達(dá)量選擇參數(shù)為：Max target sequences=20 000、Expect threshold=0.000 000 000 1、indenity>100%，從而選擇出該基因的表達(dá)數(shù)據(jù)(N1)；最后，計(jì)算FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值，F(xiàn)PKM=N1×105/N。

1.3 啟動(dòng)子克隆

1.3.1 DNA提取 將油菜種子點(diǎn)播于營養(yǎng)土[V(基質(zhì))∶V(珍珠巖)∶V(蛭石)=3∶1∶1]中，待其生長20 d左右，用CTAB法[18]提取葉片的DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及基因克隆 參考擬南芥油體蛋白在種子及其他組織的表達(dá)模式，在油菜數(shù)據(jù)庫尋找甘藍(lán)型油菜的同源基因。根據(jù)這些同源基因的序列，利用甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫資料，分析相應(yīng)基因在不同組織中的表達(dá)水平。選擇種子特異表達(dá)且表達(dá)量最高的一個(gè)基因或重復(fù)基因，找到該基因的上游序列位置，在其末端與該基因起始密碼子的區(qū)段內(nèi)設(shè)計(jì)引物BnOA03-F/R(所涉及引物信息詳見表1)。以所提取的油菜DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：在50 μL的體系中加入1.5 μL油菜DNA，4 μL dNTP，10 μL 5×PS Buffer，0.5 μL Primer star，31.5 μL超純水以及1.5 μL BnOA03-F/R引物。經(jīng)過95 ℃預(yù)變性4 min后，95 ℃變性30 s ，57 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)紫外顯影顯示PCR產(chǎn)物與目標(biāo)片段大小一致。用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，再經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ雙酶切回收產(chǎn)物和PMD19-T后，進(jìn)行T4連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)行菌體PCR，選擇符合要求的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.4 啟動(dòng)子序列分析

將克隆的啟動(dòng)子PBnOA03的序列在啟動(dòng)子在線分析軟件PLACE(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?lang=en&pj=640& action=page&page=newplace)上進(jìn)行分析，并對分析得到的順式作用元件進(jìn)行分類總結(jié)。

1.5 表達(dá)載體構(gòu)建

對經(jīng)過測序的質(zhì)粒和表達(dá)載體pBI121進(jìn)行HindⅢ和XbaⅠ雙酶切處理，37℃酶切4 h，分別回收質(zhì)粒和表達(dá)載體pBI121的酶切產(chǎn)物。利用T4DNA連接酶連接，反應(yīng)體系為：1 μL 回收啟動(dòng)子質(zhì)粒片段，6 μL回收pBI121片段，2 μL 5×T4Buffer，1 μL T4連接酶，在PCR中25 ℃反應(yīng)10 min。然后用熱激法進(jìn)行大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。從過夜培養(yǎng)的平板中挑取單克隆于1 mL含有50 mg/L的卡那霉素液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以單克隆的菌液為模板，用BnOA03-Fy/Ry引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。然后將正確菌液擴(kuò)繁提取質(zhì)粒，經(jīng)凍融法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)驗(yàn)證引物BnOA03-Fy/Ry檢測后，用于遺傳轉(zhuǎn)化。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.6 擬南芥轉(zhuǎn)化及陽性苗鑒定

采用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥(方法參考Clough等[19])。轉(zhuǎn)化大約25 d后收取種子，將收獲的T1代種子消毒后撒播至含有50 mg/L的卡那霉素的1/2 MS平板上，一周后篩選陽性苗，移栽至營養(yǎng)土中，置于22 ℃，16/8 h光周期的培養(yǎng)室進(jìn)行生長。

待植株正常生長至抽薹時(shí)，用CTAB法提取葉片DNA，用BnOA03-Fy/Ry引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.7 轉(zhuǎn)基因陽性植株GUS染色

將T1代植株收獲的種子在含有卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上撒播，觀察生長，選擇有3∶1分離比的單位點(diǎn)插入轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)研究。將挑選的轉(zhuǎn)基因陽性植株轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土，分別取其萌發(fā)5 d的幼苗，開花時(shí)期的莖、莖生葉、蓮座葉和花，以及生長至成熟階段的種子，分別為開花后4、7、11、15、18、21 d的角果，對這些組織進(jìn)行GUS染色。另外選擇實(shí)驗(yàn)室?guī)в蠫US報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥材料作為陽性對照。染色液成分為：50 mmol/L NaPO4(pH=7.2)，0.5 mmol/L K3Fe(CN)6，0.5 mmol/L K4Fe(CN)6，2 mmol/L X-Gluc。GUS染色方法參見 Jefferson等[20]方法，用體式顯微鏡觀察擬南芥不同組織的GUS染色情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜油體蛋白的表達(dá)模式分析

在擬南芥的15個(gè)油體蛋白中有11個(gè)油體蛋白基因的表達(dá)模式可以搜索到。對這11個(gè)油體蛋白進(jìn)行分類分析，發(fā)現(xiàn)有3種類型，種子特異、非種子特異以及組成型表達(dá)。參考擬南芥油體蛋白的表達(dá)模式，選擇不同類型的油體蛋白進(jìn)行分析。為了簡潔，本文僅列出幾個(gè)有代表性的油體蛋白的結(jié)果。擬南芥OLE(AT2G25890)在種子中表達(dá)較高且在其他組織中也有表達(dá)，它在甘藍(lán)型油菜中存在2個(gè)同源基因，分別命名為 BnOA04和 BnOC04；擬南芥OLE(AT5G56100)在根、莖、葉和種子中都有較高表達(dá)，它在甘藍(lán)型油菜中存在2個(gè)同源基因，分別命名為 BnOA02、BnOC02；擬南芥OLE(AT3G01570)是一個(gè)種子特異表達(dá)的油體蛋白，它在甘藍(lán)型油菜中存在2個(gè)同源基因，分別命名為 BnOA03、 BnOC03。根據(jù)它們的編碼區(qū)序列，分析這些同源基因在油菜組織中的表達(dá)量，結(jié)果見圖1。圖1-A中的數(shù)據(jù)來源于對甘藍(lán)型油菜種子不同發(fā)育時(shí)期研究的4個(gè)數(shù)據(jù)庫。從圖1-A可以看出，基因 BnOA03的表達(dá)量在授粉后2周開始成倍增加，在第6周達(dá)到最高，6周之后雖然表達(dá)量下降，但是其表達(dá)水平較其他基因依然較高；其同源基因 BnOC03的表達(dá)趨勢與其一致，但是表達(dá)量稍低于 BnOA03。其余基因在種子整個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)量都較低。圖1-B中子葉和葉片的數(shù)據(jù)來源于3個(gè)數(shù)據(jù)庫，根的數(shù)據(jù)來源于一個(gè)數(shù)據(jù)庫。從圖1-B中可以看出，油菜油體蛋白基因在根、子葉和葉片中的表達(dá)量都較低，甚至不表達(dá)。根據(jù)表達(dá)量分析結(jié)果，最終本研究選擇 BnOA03油體蛋白基因?yàn)槟繕?biāo)基因。

2.2 啟動(dòng)子克隆及序列分析

以所提取的油菜DNA為模板，利用引物BnOA03-F/R進(jìn)行擴(kuò)增。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2-A，PCR產(chǎn)物為715 bp，其結(jié)果與油菜數(shù)據(jù)庫獲得的片段大小一致。該啟動(dòng)子命名為PBnOA03。

A.油體蛋白基因在油菜種子授粉后不同時(shí)間的表達(dá)量 The expression of oleosin gene at different time after pollination of Brassica napus;B.油體蛋白基因在油菜不同組織中的表達(dá)量 The expression of oleosin gene at different tissues of Brassica napus

對啟動(dòng)子序列進(jìn)行在線分析，結(jié)果見圖3和表2。PBnOA03啟動(dòng)子中含有水稻胚乳特異性表達(dá)順式調(diào)控元件Skn-1基序[21]、ABRE應(yīng)答元件[22]、對轉(zhuǎn)錄起始有重要作用的TATA-BOX[23]、與儲藏蛋白基因有關(guān)的E-BOX[15]和與激素調(diào)節(jié)有關(guān)的W-BOX[22]等順式元件。CAAT-BOX對基因的轉(zhuǎn)錄起到很強(qiáng)的激活作用[24]，也可以通過與其他順勢作用元件的協(xié)同來達(dá)到調(diào)控基因高效表達(dá)的作用。除此之外，PBnOA03啟動(dòng)子中還存在與種子特異性相關(guān)的順式元件RY-motif[14]、與光效應(yīng)有關(guān)的G-BOX和T-BOX順式元件[16]。啟動(dòng)子中存在的這些順式元件，將為今后研究該啟動(dòng)子的調(diào)控提供重要的信息。

A:PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子PBnOA03片段 Fragment of PBnOA03 promoter amplified by PCR；M.DNA marker 5000; 1.PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子PBnOA03片段 Fragment of PBnOA03 promoter amplified by PCR) B:PCR擴(kuò)增篩選陽性克隆電泳圖 PCR screen of positive clones;M.DNA marker 2000; 1-2.挑選的陽性克隆菌落PCR產(chǎn)物 PCR products of positive clones; P.質(zhì)粒對照 Plasmid

2.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化

對連接啟動(dòng)子序列的中間載體PMD19-T和pBI121進(jìn)行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物，利用T4DNA連接酶連接，然后用熱激法進(jìn)行大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行單克隆菌落PCR鑒定。經(jīng)電泳檢測顯示PBnOA03啟動(dòng)子成功連入pBI121(圖2-B)。經(jīng)測序確認(rèn)后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，重組載體圖如圖4-A。驗(yàn)證后進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化。經(jīng)過抗性培養(yǎng)基篩選得到37株T1代轉(zhuǎn)基因植株，提取篩選到的這些植株葉片DNA，利用BnOA03-Fy/Ry引物進(jìn)行PCR檢測。以質(zhì)粒為陽性對照，野生型擬南芥DNA為陰性對照。檢測結(jié)果見圖4-B。

根據(jù)上圖PCR的結(jié)果顯示，篩選轉(zhuǎn)基因陽性苗。

2.4 啟動(dòng)子功能分析

對8個(gè)T1代株系的葉片、莖、花器和發(fā)育種子進(jìn)行初步GUS染色。結(jié)果表明，在營養(yǎng)器官和花器中均無GUS染色，而在種子發(fā)育中后期有GUS染色，表明該啟動(dòng)子具有活性。進(jìn)一步對試驗(yàn)中得到的T2轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行系統(tǒng)的GUS染色。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基上生長了5 d的幼苗(圖5-B)中的各個(gè)部位都沒有發(fā)現(xiàn)GUS基因的明顯表達(dá)(以5 d幼苗為陽性對照如圖5-A)；在莖(圖5-C)、莖生葉(圖5-D)、蓮座葉(圖5-E)、花(圖5-F)中沒有發(fā)現(xiàn)GUS染色，其中花器的雌蕊柱頭部分、花瓣和雄蕊的花藥、花絲也沒有發(fā)現(xiàn)GUS染色信號。

紅色代表Skn-1基序 Red represents Skn-1motif; 棕色代表ABRE Brown represents ABRE; 藍(lán)色代表G-BOX Blue represents G-BOX; 綠色代表GTGA-motif Green represents GTGA-motif; 橙色代表T-box Orange represents T-box ; 紫色代表CAAT-BOX Purple represents CAAT-BOX; 粉色代表RY-motif Pink represents RY-motif; 黃色代表W-BOX Yellow represents W-BOX; 灰色代表TATA-BOX Gray represents TATA-BOX

表2 PBnOA03啟動(dòng)子的表達(dá)元件分析Table 2 Analysis of regulatory elements in PBnOA03 promoter

A:PBnOA03∶∶GUS 載體結(jié)構(gòu) Construction of PBnOA03∶∶GUS B:PBnOA03啟動(dòng)子T1轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測 Identification of PBnOA03 promoter T1 transgenic plants by PCR；1.轉(zhuǎn)化苗 Transgenic plants; W.野生型對照 Wild type;P.質(zhì)粒對照 Plasmid; M.DNA marker 2000

A.5 d幼苗(對照) 5 days old plant(CK); B.5 d幼苗 5 days old plant; C.莖 Stem; D.莖生葉 Leaf of stem; E.花 Flower; F.蓮座葉 Rosette leaf; G.開花后4 d角果 4 days after flower of silique; H.開花后7 d種子 7 days after flower of seed; I.開花后11 d種子 11 days after flower of seed; J.開花后15 d種子 15 days after flower of seed; K.開花后18 d種子 18 days after flower of seed; L.開花后21 d種子 21 days after flower of seed

不同時(shí)期角果的GUS染色結(jié)果中表明，野生型在各個(gè)時(shí)期都未檢測到背景GUS染色；在轉(zhuǎn)化啟動(dòng)子的材料中，開花后4 d的種莢和株柄(圖5-G)沒有GUS染色，在開花后7 d的種莢中剝離的種子(圖5-H)也沒有發(fā)現(xiàn)有GUS染色；在開花后11 d的角果中，種莢和株柄沒有染色，而在剝離的種子(圖5-I)中發(fā)現(xiàn)有GUS的淺著色；開花后15 d的角果中，種莢和株柄都沒有染色，在種子中(圖5-J)可以檢測到有明顯GUS染色；開花后18 d的角果中，種莢和株柄均沒有染色，而在種子中(圖5-K)發(fā)現(xiàn)較深的GUS染色；開花后21 d的角果中，種莢、株柄和種子中(圖5-L)都沒有檢測到GUS染色信號。這些染色結(jié)果與T1代陽性植株的染色結(jié)果一致。這些結(jié)果表明PBnOA03啟動(dòng)子是一個(gè)在種子發(fā)育中后期進(jìn)行啟動(dòng)基因表達(dá)的種子特異性啟動(dòng)子。

3 討 論

本試驗(yàn)中共得到8個(gè)轉(zhuǎn)基因系，對得到的轉(zhuǎn)基因系的T1代植株幼葉和不同發(fā)育時(shí)期的種子進(jìn)行GUS染色，在葉片等組織中沒有發(fā)現(xiàn)GUS染色，而在種子發(fā)育的中后期檢測到GUS染色。在得到的8個(gè)轉(zhuǎn)基因系中有7個(gè)系在種子開花后的11、15、18 d中能檢測到逐漸增強(qiáng)的GUS基因活性，其中，2個(gè)系在開花后21 d還可以檢測到有部分的GUS染色信號。在T2代時(shí)各組織和種子的GUS活性檢測與T1代一致。這與之前分析的基因在油菜授粉后不同周期的種子中的表達(dá)趨勢一致。

但在本研究中，GUS基因活性在種子開花后11 d時(shí)開始有信號，但信號不強(qiáng)，到18 d有信號增強(qiáng)的過程。然而，擬南芥種子在發(fā)育的過程中，開花后11～15 d時(shí)，是其合成油脂和儲藏物質(zhì)的主要階段。也就是說，該啟動(dòng)子在擬南芥上表達(dá)的高峰相對油菜來講，出現(xiàn)延遲表達(dá)的情況。本研究中，分析出現(xiàn)這種的情況的原因可能有：(1)擬南芥和油菜雖均屬十字花科、有一定的親緣關(guān)系，但是隨著植物發(fā)生進(jìn)化，擬南芥屬于阿拉伯屬，而油菜屬于蕓薹屬。此外，油菜在進(jìn)化時(shí)基因組遠(yuǎn)較擬南芥復(fù)雜[25]。(2)油菜種子在授粉后50 d 左右獲得成熟種子，而擬南芥在開花后23 d左右就可以獲得成熟種子，擬南芥的發(fā)育周期為油菜的一半，而本試驗(yàn)參照油菜的發(fā)育周期構(gòu)建的啟動(dòng)子，在容易轉(zhuǎn)化的擬南芥上進(jìn)行驗(yàn)證，這可能是表達(dá)時(shí)期出現(xiàn)延后的原因之一[25]。(3)本試驗(yàn)所構(gòu)建的啟動(dòng)子約700 bp。在克隆啟動(dòng)子時(shí)，完整的克隆了基因上游直到另一個(gè)基因的全部序列。但考慮到基因的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，不能排除啟動(dòng)子序列之外還存在其他的輔助調(diào)控序列，這些序列有可能對該基因的表達(dá)有修飾作用。在進(jìn)行該啟動(dòng)子的后續(xù)研究中，可嘗試在其他植物上進(jìn)行驗(yàn)證分析，例如，克隆油菜基因的啟動(dòng)子選擇煙草[14]來驗(yàn)證,它的種子成熟的周期與油菜大體相近，為授粉后的40 d 左右，或者用油菜[26]本身來驗(yàn)證，這些后續(xù)研究將有助于分析出現(xiàn)這一情況的原因。