重慶地區(qū)兔腹瀉病原菌分離鑒定及檢測方法的建立

許國洋，沈克飛，徐登峰，付利芝，張素輝，王孝友，楊 柳

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

近年來，隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)兔業(yè)已成為重慶地區(qū)一項(xiàng)發(fā)展?jié)摿薮蟮漠a(chǎn)業(yè)。但由于重慶地區(qū)的獨(dú)特地理特征和濕熱氣候環(huán)境，為病原菌滋生創(chuàng)造了有利條件，成為疫病多發(fā)的主要誘因之一，嚴(yán)重影響?zhàn)B兔業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。兔腹瀉是一類臨床上表現(xiàn)腹瀉癥狀的疾病，表現(xiàn)為排糞頻繁，糞便稀軟，呈粥樣或水樣便，輕者食欲減退，精神不振，排糞稀軟，呈粥樣或水樣，病兔全身反應(yīng)較輕，虛弱、消瘦、不愛運(yùn)動(dòng)[1-3]；重者體溫升高，食欲廢絕，精神倦怠，嚴(yán)重腹瀉，呈水樣?；煊醒夯蚰z凍樣黏液，糞便惡臭[4]，腹部觸診有明顯痛疼反應(yīng)，呈脫水和衰竭狀態(tài)及自體中毒癥狀，結(jié)膜發(fā)紺，脈博細(xì)弱，呼吸促迫，常因虛脫而死亡[5-6]。目前，兔腹瀉病在重慶地區(qū)有流行趨勢，多發(fā)于幼兔，給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。兔腹瀉病種類多樣，病因復(fù)雜，其中，由病原菌導(dǎo)致的細(xì)菌性腹瀉最為重要[7]。兔細(xì)菌性腹瀉主要包括大腸桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病、泰澤氏菌病、沙門氏菌病、金黃色葡萄球菌病和銅綠假單胞菌病等，其中，以大腸桿菌病和產(chǎn)氣莢膜梭菌病發(fā)生率較高[8]。由于兔細(xì)菌性腹瀉各病原菌致病性與耐藥性差異，導(dǎo)致其在不同地區(qū)呈不同流行趨勢，危害也各有差異，給疫病防控帶來巨大困擾[9]。因此，明確病原、建立有效檢測方法對該病的防控有重要意義。目前，兔細(xì)菌性腹瀉的研究主要涉及病原特性和防治措施，有關(guān)診斷方法相對較少[10]。傳統(tǒng)病原菌分離鑒定方法費(fèi)時(shí)耗力，成本較高，且易出現(xiàn)漏檢，不能達(dá)到快速診斷的目的。本研究對重慶地區(qū)兔細(xì)菌性腹瀉病原菌進(jìn)行分離鑒定，并建立檢測方法，為該病的防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試 劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker、膠回收試劑盒和胎牛血清均購自天根生化科技(北京)有限公司；參照文獻(xiàn)[11]的細(xì)菌16S rDNA基因序列通用引物，同時(shí)，參照銅綠假單胞菌外毒素eta基因[12]、產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素基因[13]、金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因[14]和大腸桿菌外膜蛋白eae基因[15]設(shè)計(jì)特異性引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2 菌 株

鏈球菌(CVCC1887)、多殺性巴氏桿菌(HN13)和沙門氏菌(ATCC 25922)參考菌株均由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所提供。

1.3 病例來源

重慶市各區(qū)、縣兔場腹瀉病例的兔糞便或腸道內(nèi)容物。

1.4 方 法

1.4.1 病原菌分離培養(yǎng)及致病性分析 對疑似感染病例臨床診斷后，采集病料，利用劃線法接種于含有φ=10%胎牛血清的TSA固體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用生理鹽水將分離到的各疑似病原菌菌液稀釋為108cfu·mL-1，通過腹腔注射8只小鼠，每只0.2 mL，并設(shè)對照組，正常飼喂7 d后進(jìn)行致病性分析，并從死亡小鼠心血或肝臟中進(jìn)行病原菌的分離純化。同時(shí)，對分離到的疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。

1.4.2 16S rDNA基因序列擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取分離菌總DNA，利用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增各分離菌株16S rDNA基因序列，反應(yīng)體系為：DNA模板3 μL，上下游引物各0.2 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，ddH2O 21.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI 中BLAST比對分析，并借助MEGA 5.0軟件，利用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4.3 多重PCR檢測條件優(yōu)化 參照“1.4.2”對各菌株特異性引物進(jìn)行鑒定，PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序分析。挑取各病原菌單菌落接種于含φ=10%胎牛血清的TSB培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h，用生理鹽水將各菌株稀釋為108cfu·mL-1，提取基因組后，各取2 μL混勻作為模板進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，參照文獻(xiàn)[11]的方法分別針對引物濃度和退火溫度進(jìn)行多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，上下游引物均以0.1 μmol·L-1為濃度梯度，范圍均為0.1～0.5 μmol·L-1，退火溫度以2 ℃為梯度，范圍為50 ℃～60 ℃。

1.4.4 多重PCR引物特異性分析 分別提取參考菌株和病原菌株基因組DNA，利用多重PCR最適反應(yīng)條件擴(kuò)增目的基因，進(jìn)行引物特異性分析。

1.4.5 多重PCR反應(yīng)靈敏度分析 制備108cfu·mL-1各病原菌菌液，10倍梯度稀釋后，選取濃度為 101～105cfu·mL-1，提取不同濃度病原菌基因組DNA，同一濃度各取2 μL為模板，利用多重PCR最適反應(yīng)條件進(jìn)行靈敏度分析。

1.4.6 臨床樣品檢測 利用建立的多重PCR反應(yīng)條件對臨床采集的樣本進(jìn)行兔腹瀉病原菌鑒定，并對病原菌多樣性及流行情況進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

通過對患病兔的臨床診斷，發(fā)現(xiàn)腹瀉病例多為幼兔，腹瀉程度不盡相同(圖1)，且多數(shù)病例腸道出血較為嚴(yán)重，腸黏膜出現(xiàn)脫落現(xiàn)象(圖2)。

2.2 細(xì)菌分離及致病性試驗(yàn)

通過細(xì)菌分離培養(yǎng)共分離到4種疑似病原菌。小鼠攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種12 h后，各試驗(yàn)組部分小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、采食和飲水減少、蜷縮不動(dòng)病癥，24 h后開始出現(xiàn)死亡，7 d 后，發(fā)現(xiàn)4 種分離菌均可引起小鼠死亡，死亡率分別為60%、80%、100%和50%，且從各死亡小鼠的心血和肝臟中均分離到目的菌株。經(jīng)革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)3株為桿狀或短桿菌，1 株為球菌，2 株為G+菌(圖3-B、3-C)，2株為G-菌(圖3-A、3-D)。

2.3 基于16S rDNA的分離菌系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用通用引物擴(kuò)增各分離菌株16S rDNA基因序列，Blast比對發(fā)現(xiàn)4種菌株分別與銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌同源性較高，均高于99%，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中也分別與其聚為一簇(圖4)。

圖1 腹瀉幼兔Fig.1 Diarrhea of young rabbit

圖2 腸道病變Fig.2 Intestinal lesion

A～D：細(xì)菌分離株1～4(1 000×) Bacterial strain 1-4(1 000×)

圖4 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

2.4 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對各菌株特異性引物鑒定，發(fā)現(xiàn)均能有效擴(kuò)增出目的條帶。多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果顯示：引物濃度≥0.2 μmol·L-1時(shí)，鑒定效果較好(圖5)，退火溫度≥58 ℃時(shí)效果較好(圖6)，確定0.2 μmol·L-1為最適引物濃度，58 ℃為最適退火溫度。

M.DL2000 marker；1～5. 0.1-0.5 μmol·L-1

M.DL2000 marker；1～6. 50 ℃～60 ℃

2.5 多重PCR檢測的特異性分析

通過對多重PCR引物特異性鑒定，發(fā)現(xiàn)各引物僅在有病原菌基因組的情況下可擴(kuò)增出單一特異性條帶，產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致。鏈球菌、多殺性巴氏桿菌和沙門氏菌均無擴(kuò)增條帶(圖7)。

2.6 多重PCR檢測方法靈敏度分析

通過多重PCR反應(yīng)體系靈敏度檢測，發(fā)現(xiàn)各菌株濃度≥103cfu·mL-1時(shí)，擴(kuò)增效果較好，故該方法的最低檢出濃度為103cfu·mL-1(圖8)。

M.DL2000 marker；1.鏈球菌 Streptococcus;2.多殺性巴氏桿菌 P.multocida；3.沙門氏菌 S.enterica；4.金黃色葡萄球菌 S.aureus；5.銅綠假單胞菌 P.aeruginosa；6.產(chǎn)氣莢膜梭菌 C.perfringens；7.大腸桿菌 E.coli

2.7 臨床樣品檢測

利用建立的檢測方法，對臨床采集的200份兔腹瀉樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)混合感染樣品檢出率為37%，單一病原菌感染樣品檢出率為63%。其中，金黃色葡萄球菌單獨(dú)感染檢出率高達(dá)37.6%，銅綠假單胞菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌單獨(dú)感染檢出率較低，分別為6.5%和5.0%；混合感染樣品中，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合感染檢出率最高(28.0%)，未發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌以及4種病原菌同時(shí)感染的樣品，其他病原菌混合感染檢出率均較低(圖9)。

M.DL2000 marker；1～5.101～105 cfu·mL-1

3 討 論

隨著養(yǎng)兔業(yè)的不斷發(fā)展，兔疫病防控問題已成為主要制約因素。在飼養(yǎng)管理不當(dāng)、養(yǎng)殖技術(shù)水平低的情況下，兔感染病原菌幾率會(huì)顯著提高[16]。兔細(xì)菌性腹瀉無明顯的季節(jié)性，以冬春季節(jié)最易流行，發(fā)病率和死亡率均較高，多個(gè)品種均易發(fā)生。此外，兔腹瀉病因復(fù)雜，種類多樣，而針對兔細(xì)菌性腹瀉的疫苗又相對較少，故快速有效的檢測方法顯得尤為重要[17]。傳統(tǒng)的病原菌分離培養(yǎng)方法雖然能達(dá)到疫病診斷目的，但對試驗(yàn)設(shè)備、人員操作和病料采集等方面要求較高[18]。不同病原菌對培養(yǎng)條件的需求往往不一致，當(dāng)病料中存在多個(gè)病原菌時(shí)，若在同一條件下進(jìn)行培養(yǎng)，會(huì)出現(xiàn)病原菌間競爭效應(yīng)，導(dǎo)致培養(yǎng)條件需求較高的病原菌難以分離，給疫病診斷帶來困擾[19]。隨著PCR技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，憑借高特異性、高靈敏性、操作簡單等優(yōu)勢，在疫病診斷方面發(fā)揮重要作用。多重PCR技術(shù)，不僅具有普通PCR優(yōu)勢，并能同時(shí)對多個(gè)目的基因進(jìn)行檢測，在檢測混合感染方面具有顯著優(yōu)勢[11]。

圖9 臨床樣本的多重PCR檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.9 Multiple PCR test results of clinical samples

目前，關(guān)于兔細(xì)菌、病毒和寄生蟲等感染引起的疫病檢測研究較多，而混合感染檢測方法相對較少。感染兔的病原菌種類較多，且易與其他病原菌、病毒和寄生蟲發(fā)生混合感染，給兔健康養(yǎng)殖帶來嚴(yán)重威脅。本研究通過對重慶地區(qū)兔腹瀉臨床樣品檢測發(fā)現(xiàn)，建立的多重PCR檢測方法能有效針對銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對兔的感染情況進(jìn)行診斷，可以通過1次操作實(shí)現(xiàn)對病原菌單一或混合感染情況的快速診斷。檢測結(jié)果表明，單一病原菌引起的兔腹瀉病例較多，金黃色葡萄球菌檢出率最高，與陳艷會(huì)等[20]對葡萄球菌的臨床分離鑒定結(jié)果相一致；混合感染多為2種病原菌引起，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合感染最為嚴(yán)重，未檢出銅綠假單胞菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌的混合感染，且未出現(xiàn)4種病原菌同時(shí)感染的情況。各病原菌臨床檢出率差別較大，其中，金黃色葡萄球菌單獨(dú)感染檢出率為37.6%，混合感染樣品中金黃色葡萄球菌檢出率為81.1%；大腸桿菌單獨(dú)檢出率僅為14%，而混合感染樣品中大腸桿菌檢出率高達(dá)100%，表明其最易與其他病原菌混合感染，這可能與部分大腸桿菌具有條件致病性有關(guān)。

兔細(xì)菌性腹瀉病原檢測常采用細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)與分子診斷技術(shù)相結(jié)合的方法，雖能達(dá)到對病原菌鑒定的目的，但耗時(shí)較長，對于培養(yǎng)條件要求較高的菌常出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，造成檢測結(jié)果誤判，且對多個(gè)病原菌混合感染的情況不能達(dá)到快速診斷的目的，給疫病防控帶來一定的困擾[19]。本研究建立的多重PCR檢測方法操作簡便，成本低且靈敏度高，給重慶地區(qū)兔細(xì)菌性腹瀉的檢測提供理論依據(jù)，也為該病的防控奠定基礎(chǔ)。