梨S基因與S基因型鑒定的研究進(jìn)展

張校立，艾沙江·買買提，徐葉挺，鄧 莉，王繼勛

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站,烏魯木齊 830091)

植物自交不親和性(Self-incompatibility,SI)是指能產(chǎn)生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同體植物，在自花授粉或相同基因型異花授粉時(shí)不能完成受精的現(xiàn)象。自交不親和現(xiàn)象普遍存在于綠色開花植物中。對(duì)植物自交不親和現(xiàn)象的研究始于20世紀(jì)30年代，到目前為止己對(duì)薔薇科、茄科、十字花科、菊科等70多個(gè)科250個(gè)屬的綠色開花植物開展了自交不親和性研究[1]。

梨在植物分類上屬于薔薇科蘋果亞科梨屬，是由單一位點(diǎn)的S等位基因控制的典型配子體自交不親和性植物，其雌蕊花柱內(nèi)的S基因產(chǎn)物為具有核酸酶(RNase)活性的糖蛋白S核酸酶(S-RNase)，特異地控制花粉和雌蕊識(shí)別過程[2]，生產(chǎn)中須合理配置授粉樹或采用人工授粉等輔助措施才能保證坐果。中國(guó)梨品種資源豐富，有3 000多個(gè)品種資源，蘊(yùn)含有豐富的S基因資源[3]；因此，鑒定梨品種S基因型、挖掘梨S基因資源對(duì)梨豐產(chǎn)栽培與遺傳改良育種具有重要意義。

1 梨S基因型鑒定研究進(jìn)展

早期對(duì)梨S等位基因命名方式有兩種，即阿拉伯?dāng)?shù)字與英文字母命名法，其中，亞洲梨種群使用阿拉伯?dāng)?shù)字命名，西洋梨種群使用英文字母命名。隨著對(duì)S基因的深入研究，一些S基因被發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在于中國(guó)古老的品種或野生類型個(gè)體和西洋梨品種中[4]。于是，國(guó)外的學(xué)者對(duì)西洋梨種群的S基因以阿拉伯?dāng)?shù)字命名的方式重新作了梳理和命名[5]。

梨自交不親和性基因的研究始于20世紀(jì)50年代。國(guó)外，最早是Kikuchi(1929年)、Machida等(1982年)和Terami等(1946年)日本學(xué)者，采用廣泛的田間授粉雜交試驗(yàn)，從日本梨中鑒定7個(gè)S等位基因，命名 S1、S2、S3、S4、S5、S6和 S7。Sassa等[6]于1999年首先對(duì) S1～ S7 RNase的cDNA進(jìn)行克隆，建立日本梨 S1～ S7等位基因PCR-RFLP系統(tǒng)。2000至2001年，Castillo等[7]使用該系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn) S8和 S9 2個(gè)新的S等位基。2006年，Kim等[8]利用PCR-RFLP又在梨品種‘Chengsilri’中鑒定出 S10-RNase新基因。在西洋梨中,Zisovich 等[9]、Takasaki 等[10]與Mota等[11]利用特異引物和基因克隆的方法鑒定出Sa～St(Sa,Sb,Sc,Sd,Se/Sj,Sh,Si,Sk,Sl,Sm,Sn,So,Sp,Sq,Sr,Ss和St)等17個(gè)S-RNaseS基因。2009年，Javier[12]在西洋梨品種‘Abugo’ 和 ‘Ceremeno’中，鑒定出1個(gè)新的自交親和的S-allele： S21。這個(gè)基因是 S21的突變體。2014年，Azamnikzad等[13]在57個(gè)伊朗梨品種中鑒定出3個(gè)新的S-RNase，分別是 S126、S127 和 S128 。國(guó)內(nèi)，最早是烏云塔娜[14]在2003年，從中國(guó)白梨中分離鑒定7個(gè)新的S基因，分別記為 S17、S19、 S20、S21、S22、S26和 S27等位基因；Tan等[15]分別從白梨、沙梨及秋子梨等亞洲梨種群分離鑒定34個(gè)S等位基因；據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，張紹鈴等也從亞洲梨種群分離鑒定11個(gè)S等位基因，至今為止，東方梨中己獲得59個(gè)S-RNase等位基因登錄GenBank(表1)，其中47個(gè)等位基因序列完善，并確定部分梨品種基因型，從西洋梨中己鑒定53個(gè)等位基因均己登陸GenBank。另外，武軍凱[17]研究發(fā)現(xiàn)，‘金墜梨’自交親和性突變不是由花粉S因子突變導(dǎo)致的，而是非S位點(diǎn)的因子突變導(dǎo)致的，這是首次在薔薇科蘋果亞科中發(fā)現(xiàn)了由非S因子突變導(dǎo)致的自交親和性突變體，為薔薇科自交不親和機(jī)制的研究提供重要依據(jù)； 為更好地掌握梨S等位基因和S基因型鑒定方法及研究過程，將已確定的500多個(gè)梨品種S基因型進(jìn)行整理和匯總(表2)，并對(duì)各科研單位的研究成果列表(表3)展示，以期為梨S等位基因深入研究和梨樹豐產(chǎn)栽培提供指導(dǎo)。

表1 梨栽培品種 S 等位基因命名Table 1 Numbering of S-alleles in pear cultivars

表2 梨S等位基因及 S基因型鑒定研究現(xiàn)狀Table 2 Summary of the research of S-allele and S-genotyping in pear

2 梨自交不親和S基因型的鑒定方法

早期日本學(xué)者采用田間授粉試驗(yàn)等傳統(tǒng)方法對(duì)梨自交不親和S基因型進(jìn)行鑒定，利用梨相同S基因型品種間雜交不親和性的原理，進(jìn)行大量雜交試驗(yàn)，鑒定7個(gè)S基因，確定40多種日本梨品種的S基因型[21]，此方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易操作，缺點(diǎn)是工作量大、鑒定周期長(zhǎng)、效率低,受生理和環(huán)境條件的影響大,結(jié)果可靠性差,當(dāng)雙親或一個(gè)親本的S基因型未知或沒有適當(dāng)?shù)氖诜蹨y(cè)試品種時(shí),難以用該方法確定品種的S基因型。授粉花柱離體培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)是省工、高效，缺點(diǎn)是試驗(yàn)操作技能要求高。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，S基因型的鑒定方法也有了很大發(fā)展，PCR-RFLP技術(shù)[6]、蛋白質(zhì)電泳分析[22]、DNA序列分析方法[23]和基因芯片雜交[24]等技術(shù)均被用于梨品種自交不親和S基因的研究中，蛋白質(zhì)電泳分析法具有快捷 、可靠等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是操作過程較復(fù)雜,操作技術(shù)要求較高；DNA序列分析方法具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、效率高等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是成本高，不能獨(dú)自鑒定S基因，需要與PCR擴(kuò)增技術(shù)等方法聯(lián)合使用。PCR-RFLP技術(shù)具有快捷、準(zhǔn)確、效率高，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，并且試驗(yàn)材料取樣簡(jiǎn)便，缺點(diǎn)是難以對(duì)含有新S基因的品種的基因型確定，需結(jié)合S基因特異序列DNA測(cè)序方法等其他鑒定方法；基因芯片雜交技術(shù)具有簡(jiǎn)單，快速，準(zhǔn)確，高效，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)梨品種的S基因型同時(shí)檢測(cè)，并具有大量樣品平行檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。缺點(diǎn)是具有一定的局限性，只能檢測(cè)出已發(fā)現(xiàn)的梨S基因，不能鑒定出新的S基因，需結(jié)合S基因特異序列DNA測(cè)序方法等其他鑒定方法。目前，這些S基因型的鑒定方法以PCR-RFLP技術(shù)和S基因DNA序列分析法應(yīng)用較為廣泛，梨S基因芯片雜交技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新的鑒定方法，擁有廣闊的應(yīng)用前景。

2.1 S基因特異PCR技術(shù)

在研究早期，日本學(xué)者通過對(duì)已知的7個(gè)S基因的DNA及cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)，梨的S基因具有5個(gè)保守區(qū)、1個(gè)高變區(qū)(hypervariable region,HV)及1個(gè)內(nèi)含子區(qū)，其HV區(qū)是在自交不親和反應(yīng)中特異識(shí)別花粉的專一功能區(qū)，且不同S基因間HV區(qū)的多態(tài)性很高[25-26]。在此基礎(chǔ)上1999年Sassa等[6]建立梨 S1～S7等位基因PCR-RFLP系統(tǒng)，即根據(jù)S基因中保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用S基因特異的限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增片段，由于高變區(qū)和內(nèi)含子序列具有S特異性，故酶切片段具有長(zhǎng)度多態(tài)性，通過電泳與己知S基因酶切片段大小比較，即可確定梨品種的S基因型[27]。2000-2001年，Castillo[28]使用 S1～S7等位基因PCR-RFLP系統(tǒng)時(shí)，發(fā)現(xiàn) S8-和 S9-兩個(gè)新的S等位基因，并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行研究，建立 S1-9等位基因PCR-RFLP系統(tǒng)。

表3 梨品種S基因型總結(jié)Table 3 Summary of S-genotypes of pear cultivars

(續(xù)表3 Continued table 3)

(續(xù)表3 Continued table 3)

(續(xù)表3 Continued table 3)

PCR-RFLP技術(shù)相較于田間授粉試驗(yàn)、蛋白質(zhì)電泳分析等方法，具有速度快、準(zhǔn)確高、取樣簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但其是在已獲得S基因且基因序列已被分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行鑒定，難以確定含有新S基因品種的基因型，需結(jié)合S基因特異序列DNA測(cè)序等其他鑒定方法。 DNA測(cè)序方法是對(duì)基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收測(cè)序，然后在GenBank進(jìn)行BLAST以確定梨品種的S基因型[29]，分析新的自交不親和S基因。此方法不僅快捷、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，且試驗(yàn)材料不受季節(jié)限制，大大加快試驗(yàn)進(jìn)程。譚曉風(fēng)等(2005年)對(duì)中國(guó)沙梨S基因進(jìn)行PCR-RFLP分析，對(duì)采用PCR-RFLP方法無法確定的S等位基因和S基因型進(jìn)行目的片段的DNA測(cè)序，首次從中國(guó)沙梨中分離鑒定了7個(gè)新的S基因,并確定近20個(gè)中國(guó)沙梨的S基因型。目前為止，運(yùn)用此方法Tan等[15]與江南等[24]在中國(guó)梨中發(fā)現(xiàn)35個(gè)新自交不親和S基因，并且鑒定90多個(gè)沙梨品種、15個(gè)西洋梨品種和近30個(gè)白梨品種的S基因型。

2.2 基因芯片雜交

基因芯片(Genechips)又稱DNA芯片(DNAchips)或DNA微陣列(DNA microarray)[30]，是傳統(tǒng)的核酸雜交技術(shù)與微加工技術(shù)以及化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的一個(gè)復(fù)合體，基因芯片雜交技術(shù)具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、高效、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)梨品種S基因型同時(shí)檢測(cè)及具有大量樣品平行檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)[31]。江南[32]于2006年首次使用梨S基因寡核苷酸芯片對(duì)梨品種S基因型進(jìn)行鑒定，其檢測(cè)結(jié)果獲得成功，證明基因芯片雜交技術(shù)應(yīng)用于梨品種自交不親和性S-RNase基因和S基因型的檢測(cè)是一種切實(shí)可行的方法。2008年江南等[33]又指出，基因芯片技術(shù)只能檢測(cè)出已發(fā)現(xiàn)的梨S基因，不能鑒定出新的S基因，具有一定局限性。對(duì)于梨品種中存在的新S基因，還需結(jié)合PCR-RFLP、DNA測(cè)序及序列分析等技術(shù)進(jìn)行鑒定。并且S基因寡核苷酸芯片技術(shù)是采用梨DNA序列進(jìn)行雜交的，存在內(nèi)含子序列不同其雜交信號(hào)也會(huì)有差異的問題，針對(duì)此問題，江南等[34]以cDNA序列制作梨S基因芯片進(jìn)行進(jìn)一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種基因芯片各有利弊，利用兩種芯片并行檢測(cè)梨品種S基因，能保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。近兩年，江南等[35-36]及譚慧等[21，37]利用梨S基因芯片技術(shù)確定86個(gè)梨品種的未知S基因型，結(jié)合其他S基因型鑒定技術(shù)發(fā)現(xiàn)7個(gè)新的S-RNase基因，命名為 Pp S53(PyruspyrifoliaS53)、 Pp S54、Pp S55、Pp S56、Pp S57、Pp S58和 Pp S59。

3 展 望

隨著越來越多的研究者開展梨自交不親和性的研究，在更多的梨品種S基因型被確定的同時(shí)，也出現(xiàn)以下問題：

已鑒定的梨品種的S基因型的準(zhǔn)確性有待驗(yàn)證。由于研究單位及研究方法的不同或者是由于同名異物，導(dǎo)致梨品種自交不親和S基因型存在鑒定結(jié)果不同的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象極易引起授粉樹搭配不合理，從而引起生產(chǎn)上不必要的損失。如：對(duì)于‘蘋果梨’的S基因型，鞏艷明[38]鑒定為S1S17，張妤艷等[16]鑒定為S17S19，許高歌[39]鑒定為S1Sdm；對(duì)于‘早酥梨’的S基因型，許高歌[39]鑒定為S1Sd，與鞏艷明[38]的研究結(jié)果一致，而楊谷良[40]則鑒定為S22S35；特別是對(duì)‘庫(kù)爾勒香梨’研究，目前已有多位研究者對(duì)其S基因型進(jìn)行鑒定，但結(jié)果均不完全相同，張妤艷等[41]鑒定為S21S28，譚曉風(fēng)等[42]認(rèn)為是S8S28；楊谷良[40]和唐忠建[43]鑒定結(jié)果一致都認(rèn)為是S22S34，Qi等[44]、Heng[45]等和呂文娟等[46]鑒定的‘庫(kù)爾勒香梨’的S基因型結(jié)果一致，均認(rèn)為是S22S28，并通過RT-PCR鑒定得到證實(shí)。

梨S等位基因信息不斷豐富，其命名存在相同基因不同編碼序列或相同編碼序列但命名不同等問題。出現(xiàn)此問題的原因可能是：①早期對(duì)S等位基因的鑒定主要針對(duì) HV 區(qū)及周邊序列部分片段的測(cè)序鑒定，這些片段只占S基因全長(zhǎng)序列的一小部分，因此需要得到完整的全長(zhǎng)序列來進(jìn)一步區(qū)分或重新命名更正這些相似基因。②基因登錄過程中忽略內(nèi)含子而造成同物異名的現(xiàn)象。如：2007年衡偉等[47]對(duì)S基因的DNA序列分析確認(rèn) S16(AY249431.2)和 S31(DQ072113.1)為相同S基因；2013年徐非凡[29]認(rèn)為 S12(EU117115)與 S36(DQ417607)為同一基因、 S17(EU249432)與 S34(DQ269500)為同一基因，與呂文娟的研究結(jié)果相同；呂文娟等[46]對(duì) S7(AB002143)與 S27(EF643640.1)的編碼序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其完全相同應(yīng)為同一基因，江南等[34]也發(fā)現(xiàn)砂梨 S15和 S38基因編碼序列完全相同；楊谷良等[42]推導(dǎo)氨基酸，從而推測(cè) S8-RNase、 S28-RNase和 S34-RNase很可能是同一基因。

尚有大量梨品種的S基因型等待鑒定。中國(guó)擁有3 000多個(gè)梨品種，目前只有500多個(gè)品種的S基因型被鑒定，還有大量的S基因型未被鑒定。這給應(yīng)用梨S-基因型合理選配授粉樹和指導(dǎo)梨園生產(chǎn)帶來很大的局限性。

新的鑒定技術(shù)急待開發(fā)。梨S基因的鑒定技術(shù)雖然有了巨大的突破，鑒定方法也更加方便、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確；但是都還具有一定的局限性，有時(shí)需要多種方法聯(lián)合使用才能準(zhǔn)確鑒定，多種方法聯(lián)合使用極大降低鑒定速度，增加鑒定成本。因此，開發(fā)新的S基因型鑒定技術(shù)，以較低的成本，簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地確定更多梨品種的S基因型，進(jìn)一步完善梨品種S基因檢測(cè)系統(tǒng)，仍然是梨自交不親和性研究及梨生產(chǎn)實(shí)踐急待解決的重要問題。