傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的原核表達及其免疫效果評價

李甜甜，蔣大偉，姬鵬超，王銀鈴，張改平,3

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002； 3.江蘇高校動物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的雛雞的一種急性、高度傳染性的免疫抑制性疾病[1]。自該病被發(fā)現(xiàn)以來，在世界各地廣泛流行，隨后變異毒株、強毒株及超強毒株的不斷出現(xiàn)，使得傳統(tǒng)疫苗不能為宿主提供有效的免疫保護，從而對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的危害[2]。

IBDV屬于雙RNA病毒科、禽雙RNA病毒屬，其基因組由A和B 2個片段組成，共編碼5種蛋白質(zhì)，分別為VP1、VP2、VP3、VP4和VP5[3]。其中VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和主要宿主保護性抗原，包含了誘導(dǎo)病毒中和抗體的抗原區(qū)域，其誘導(dǎo)的中和抗體能保護宿主不受IBDV感染[4-5]。此外，VP2與抗原變異和病毒毒力密切相關(guān)[6]。因此，VP2一直是研究IBD亞單位疫苗的目標(biāo)蛋白。

目前，VP2蛋白已在多種表達系統(tǒng)中成功表達，如大腸桿菌[7]、昆蟲細胞[8]、酵母[9]和植物[10]等。其中，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的VP2蛋白具有良好的免疫原性，但生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低、純化方法復(fù)雜，不易于工業(yè)生產(chǎn)[11-12]。相比之下，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有生長速度快、操作簡便、成本低、可用于發(fā)酵等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[13]。研究者常選擇親和層析[14]、凝膠過濾、蔗糖梯度離心[15]和氯化銫梯度離心[16]等方法純化目的蛋白，其中親和層析純化的蛋白質(zhì)需要經(jīng)透析去除咪唑，此過程蛋白質(zhì)容易發(fā)生聚集析出，不適用疫苗的制備，其他方法由于操作復(fù)雜、耗時長或需要特殊設(shè)備等問題不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。而鹽沉淀法[17]、離子交換層析[18]、疏水相互作用層析等具有低成本、易操作、可用于大量蛋白質(zhì)純化的特點，對于工業(yè)純化蛋白質(zhì)是很好的選擇。為了獲得可用于工業(yè)生產(chǎn)的高通量及大規(guī)模純化VP2蛋白的方法，利用大腸桿菌表達VP2蛋白，并經(jīng)飽和硫酸銨沉淀和離子交換層析等方法進行純化以獲得純度較高的目的蛋白，并檢測其免疫原性，以期為進一步研究IBD亞單位疫苗和建立IBDV檢測方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

pET28a-VP2重組質(zhì)粒由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點室驗室構(gòu)建并保存，JM109感受態(tài)細胞和BL21( DE3 )感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、DL2000 DNA Marker、λHind Ⅲ DNA Marker等均購自大連寶生物公司；IPTG、彩虹180廣譜蛋白質(zhì)Marker和BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒等均購自北京索萊寶科技有限公司；His-Tag單克隆抗體購自Proteintech公司；羊抗鼠IgG-HRP二抗購自Abbkine公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自新賽美生物技術(shù)有限公司；Q SepharoseTMFast Flow和DEAE SepharoseTMFast Flow均購自GE Healthcare公司； IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原、IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性抗體和IBDV標(biāo)準(zhǔn)強毒株BC6/85等均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；IBDV ELISA試劑盒購自北京天之泰生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 供試動物

30只3周齡SPF雞購自山東斯派福瑞公司。

1.4 重組表達質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒(pET28a-VP2)轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞，重組質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定并送公司測序。

1.5 VP2蛋白的誘導(dǎo)表達與鑒定

1.5.1 誘導(dǎo)表達 將鑒定正確的重組質(zhì)粒 pET28a-VP2轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布于含卡那抗性的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，然后挑取單菌落接種到含100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.5，加入誘導(dǎo)劑 IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，于37 ℃培養(yǎng)16 h。收集培養(yǎng)后的菌液于10 000 r/min 離心10 min，棄去上清收集菌體，用PBS緩沖液重懸菌體，并進行超聲破碎(振動頻率50 Hz，工作4 s，間歇6 s，持續(xù)10 min)，破碎后，于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，分離上清與沉淀，進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色并脫色，觀察結(jié)果。

1.5.2 Western blot鑒定 誘導(dǎo)表達的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，經(jīng)半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶室溫封閉2 h后，一抗為1∶3 000稀釋的His-Tag單克隆抗體，37 ℃ 孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，二抗為1∶1 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，37 ℃ 孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，ECL顯色液顯色。

1.5.3 AGP檢測 制備瓊脂平板，用梅花打孔器在瓊脂平板上打孔，在瓊脂平板中間孔加IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性抗體，外周孔加IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原和PBS稀釋的VP2蛋白，且依次按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32進行稀釋，將瓊脂平板平放在濕盒內(nèi)，于37 ℃溫箱中孵育2～3 d，以測定VP2蛋白表達量。

1.6 VP2蛋白純化條件的優(yōu)化

1.6.1 飽和硫酸銨沉淀法純化VP2蛋白 利用飽和硫酸銨沉淀蛋白的方法，純化1.5.1中收獲的上清。上清液中加入飽和硫酸銨溶液，至飽和硫酸銨體積百分比為10%，充分混懸，4 ℃放置10 min；10 000 r/min離心10 min，分離沉淀與上清，再向上清中繼續(xù)加入飽和硫酸銨溶液，使其百分比從10%升高到20%，同上操作，依次增至30%、40%、50%、60%、70%，每次離心保留的沉淀用離子交換層析所使用的Binding Buffer進行重懸，并處理樣品，進行SDS-PAGE與Western blot分析。

1.6.2 離子交換層析填料及洗脫液濃度的優(yōu)化 上清液中加入飽和硫酸銨溶液至終含量為30%，4 ℃放置10 min；10 000 r/min離心10 min，沉淀用Binding Buffer(30 mmol/L PB，pH值為7.0)充分混懸，透析，除鹽并使用0.45 μm的濾膜進行過濾。得到的樣品分別利用DEAE SepharoseTMFast Flow(DEAE)和Q SepharoseTM Fast Flow(Q)進行純化，流速2 mL/min，Binding Buffer平衡5個柱體積后上樣，之后依次使用含200、300、500 mmol/L NaCl的緩沖液(pH值為7.0)洗脫蛋白質(zhì)，收集洗脫液，進行SDS-PAGE分析。

1.6.3 離子交換層析緩沖液pH值的優(yōu)化 分別使用不同pH值(6.5、7.0、7.5、8.0)的緩沖液對目的蛋白進行純化，流速2 mL/min，Binding Buffer平衡5個柱體積后上樣，之后使用含200 mmol/L NaCl的緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫液，進行SDS-PAGE分析。

1.7 動物試驗

將30只雞隨機分為3組，每組10只，A組：VP2蛋白；B組：VP2蛋白加MontanideTMISA 71 VG佐劑；C組：PBS陰性對照組。均采用肌肉注射的方式進行免疫，免疫劑量為200 μL(10 μg/羽)，分別在免疫后的第7、14、21、28 天，翅下靜脈采血并分離血清，采用IBDV ELISA試劑盒檢測抗體效價。

1.8 病毒攻毒試驗

在免疫28 d后，用IBDV標(biāo)準(zhǔn)強毒株BC6/85進行攻毒保護試驗，攻毒劑量為10-5BID50。攻毒后觀察雞的臨床癥狀，4 d后剖檢供試雞，觀察腿肌、法氏囊等組織的病理變化，稱量體質(zhì)量和法氏囊質(zhì)量，并計算囊重比和囊指數(shù)。囊重比=法氏囊質(zhì)量/體質(zhì)量×1 000；囊指數(shù)=試驗組囊重比/空白對照組囊重比。

1.9 法氏囊組織學(xué)病理檢測

取出雞法氏囊組織置于10%甲醛溶液中固定，之后用石蠟包埋，切片，HE染色，觀察組織病理學(xué)變化，判定法氏囊組織學(xué)損傷分?jǐn)?shù)(1—4)。1分：正常的淋巴濾泡或淋巴細胞減少，無任何局灶性壞死或明顯水腫的跡象；2分：中度淋巴損傷，伴有局灶性壞死；3分：嚴(yán)重的淋巴細胞損傷，幾乎沒有淋巴細胞，有網(wǎng)狀細胞和增生的纖維組織；4分：卵泡萎縮，有明顯的纖維化。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-VP2的酶切鑒定

從活化的重組菌JM109(pET28a-VP2)菌液中提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，獲得的目的片段及載體的大小分別與預(yù)期片段大小一致(圖1)，表明連接的重組載體pET28a-VP2構(gòu)建成功。測序結(jié)果也表明，重組載體中的VP2片段序列正確。

2.2 VP2蛋白的誘導(dǎo)表達與鑒定

重組菌(pET28a-VP2)在37 ℃、0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)16 h后，離心收集菌體，超聲破碎后分別收集上清與沉淀進行SDS-PAGE與Western blot檢測。SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖2A)，在分子質(zhì)量50 ku處有表達條帶，與VP2蛋白預(yù)期大小一致。此外，破碎沉淀中條帶更明顯，說明表達的目的蛋白主要以包涵體形式出現(xiàn)。Western blot結(jié)果(圖2B)與SDS-PAGE中的目標(biāo)條帶一致，表明VP2蛋白在大腸桿菌中成功表達。瓊脂擴散試驗結(jié)果顯示(圖3)，表達的VP2蛋白可以與標(biāo)準(zhǔn)陽性抗體反應(yīng)形成沉淀線，效價為1∶16，表明其具有良好的反應(yīng)原性。

A:SDS-PAGE鑒定;B:Western blot鑒定。

0:IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性抗體;1:IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原;

2.3 VP2蛋白純化條件的優(yōu)化

2.3.1 飽和硫酸銨純化蛋白質(zhì) 硫酸銨沉淀常用于蛋白質(zhì)的粗純,它根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的不同而使其先后沉淀。不同含量的飽和硫酸銨溶液沉淀蛋白質(zhì)結(jié)果顯示(圖4)，表達的目的蛋白經(jīng)30%的飽和硫酸銨溶液沉淀可除去部分雜蛋白，達到粗純的目的。

A:SDS-PAGE鑒定;B:Western blot鑒定。M:蛋白質(zhì)Marker;1:細菌裂解液上清;2—8:梯度飽和硫酸銨(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)

2.3.2 填料及洗脫濃度的確定 飽和硫酸銨純化得到的目的蛋白再分別利用DEAE SepharoseTMFast Flow和Q SepharoseTMFast Flow進行純化。其中DEAE SepharoseTMFast Flow純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖5A)，含200 mmol/L NaCl的緩沖液可洗脫目的蛋白，但不能有效去除雜蛋白，得到的目的蛋白純度低；Q SepharoseTMFast Flow純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖5B)，含200 mmol/L NaCl的緩沖液可洗脫目的蛋白，并且目的蛋白純度較高，純化效果良好。可見，Q SepharoseTMFast Flow適合用于純化VP2蛋白。

2.3.3 緩沖液pH值的確定 使用不同pH值(6.5、7.0、7.5、8.0)的緩沖液純化蛋白質(zhì)，SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖6A)，隨著緩沖液pH值的增加，洗脫的目的蛋白純度越高，最適合純化目的蛋白的緩沖液pH值為8.0，得到的VP2蛋白純度最高可達到80%。Western blot結(jié)果顯示(圖6B)，經(jīng)純化的VP2蛋白能被His-Tag單克隆抗體特異性識別，

A:DEAE SepharoseTM Fast Flow;B:Q SepharoseTM Fast Flow。M:蛋白質(zhì)Marker;1:30%飽和硫酸銨;2:流穿液;3,7:200 mmol/L NaCl;4—5:300 mmol/L NaCl;6:500 mmol/L NaCl A:DEAE SepharoseTM Fast Flow;B:Q SepharoseTM Fast Flow.M:Protein Marker;1:30% saturated ammonium sulfate;2:Flow-through fluid;3,7:200 mmol/L NaCl;4—5:300 mmol/L NaCl;6:500 mmol/L NaCl

A:SDS-PAGE鑒定;B:Western blot鑒定。a—d:緩沖液pH值分別為6.5、7.0、7.5、8.0;M:蛋白質(zhì)Maker;1,5:30%飽和硫酸銨;2—4,6—8:200 mmol/L NaCl;9:緩沖液pH值為8.0純化的VP2蛋白

表明純化的VP2蛋白具有良好的反應(yīng)原性。純化的VP2蛋白經(jīng)BCA蛋白質(zhì)濃度試劑盒測定，其質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL。

2.4 VP2蛋白免疫原性分析

純化的VP2蛋白作為抗原免疫SPF雞，并將每周采集的血清進行ELISA檢測。從圖7可以看出，免疫7 d后，抗原組均可檢測到抗體，并且抗體滴度逐步提升，其中，VP2組到第21天時達到最高，VP2加佐劑組到第28天時達到最高。此外，在免疫14 d后，VP2加佐劑組產(chǎn)生的抗體滴度明顯高于VP2組。這表明純化的VP2蛋白免疫原性良好，可有效地刺激機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。

2.5 攻毒保護試驗結(jié)果

免疫28 d后進行攻毒試驗，BC6/85毒株僅引起機體免疫抑制，幾乎不導(dǎo)致死亡。在本試驗中，未觀察到雞的死亡。攻毒4 d后解剖所有雞，可見患病雞的腿肌有出血點，法氏囊出現(xiàn)不同程度的腫大，表面有黃色膠凍樣滲出物。攻毒保護結(jié)果顯示(表1)，抗原組均可以在一定程度上保護機體不受IBDV的攻擊，且VP2加佐劑組比不加佐劑組產(chǎn)生更高的保護率，可達到80%。

圖7 免疫雞的血清抗體檢測結(jié)果Fig.7 Serum antibody test results of immunized chicken

表1 攻毒保護試驗結(jié)果Tab.1 Results of the Challenge protection test

2.6 法氏囊病理組織學(xué)觀察

通過組織病理學(xué)評價制備的疫苗對法氏囊的保護效果(表1、圖8)，VP2加佐劑組有8只雞的法氏囊組織無損傷，有長而厚的黏膜褶，黏膜由大量多面形濾泡構(gòu)成(圖8A)，而VP2組僅有4只法氏囊組織無損傷，兩組發(fā)病雞的法氏囊主要表現(xiàn)為部分濾泡壞死程度較輕及周圍炎性細胞浸潤(圖8B)。攻毒組的雞法氏囊嚴(yán)重壞死，濾泡細胞基本壞死，且濾泡結(jié)構(gòu)消失，周圍可見較多的炎性細胞浸潤(圖8C)。未攻毒組中未出現(xiàn)法氏囊組織損傷(圖8D)。

A:VP2加佐劑組;B:VP2組;C:攻毒組;D:未攻毒組

3 結(jié)論與討論

IBDV是嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的一種病毒。VP2蛋白是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和宿主保護性抗原，一直是研究IBDV亞單位疫苗的靶蛋白。目前，VP2蛋白已經(jīng)在多種表達系統(tǒng)中得到表達。其中，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的IBDV VP2的亞單位疫苗已經(jīng)應(yīng)用于臨床[19]。因此，大腸桿菌表達系統(tǒng)在IBDV亞單位疫苗的研制中具有重要優(yōu)勢。本研究將構(gòu)建好的pET28a-VP2的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，成功表達了VP2蛋白，經(jīng)AGP檢測，表達的目的蛋白可以與標(biāo)準(zhǔn)陽性抗體反應(yīng)形成沉淀線，表明其具有良好的反應(yīng)原性。此外，VP2蛋白表達量較低，推測與表達菌株有關(guān)。

相比較于親和層析、凝膠過濾、梯度離心等純化方法，飽和硫酸銨與離子交換層析具有成本低、操作簡單、可純化大批量蛋白質(zhì)等優(yōu)點，所以本試驗首先選用飽和硫酸銨溶液對VP2蛋白進行純化。表達的目的蛋白經(jīng)飽和硫酸銨溶液沉淀，可以除去部分雜蛋白質(zhì)，沉淀經(jīng)緩沖液充分溶解后，可使蛋白質(zhì)恢復(fù)原來的特性，這是由于鹽析的過程是可逆的，基本不會影響蛋白質(zhì)的活性。之后再經(jīng)離子交換層析進行純化，并對純化條件進行優(yōu)化，DEAE為弱陰離子層析，Q為強陰離子層析。其中強陰離子層析的純化效果比弱陰離子層析好，可有效地去除大部分雜蛋白質(zhì)，這可能是由于強陰離子交換填料可以更有效的結(jié)合雜蛋白，從而使目的蛋白先被洗脫。此外，在一定范圍內(nèi)，緩沖液偏堿性比偏酸性的純化效果好，其純度可高達80%。經(jīng)純化的目的蛋白產(chǎn)量可達3.4 mg/L，高于之前利用親和層析純化得到的VP2[20]。此純化方法可用于工業(yè)制備VP2蛋白。

在本試驗中， VP2蛋白免疫組均產(chǎn)生了特異性抗體。MontanideTMISA 71 VG是一種以礦物油為基礎(chǔ)的佐劑，安全有效，可有效增強體液與細胞免疫應(yīng)答[21]。本試驗將純化的VP2蛋白與MontanideTMISA 71 VG佐劑混合制備成亞單位疫苗進行動物試驗，加佐劑的VP2組較不加佐劑的VP2組產(chǎn)生抗體時間早，且產(chǎn)生的抗體滴度高，可有效地保護法氏囊組織。本試驗結(jié)果顯示，VP2蛋白可以刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，并在一定程度上保護雞不受強毒株的攻擊，表明VP2蛋白具有良好的免疫效果。

綜上，應(yīng)用大腸桿菌表達系統(tǒng)中成功表達VP2蛋白，采用簡便、低成本的純化方法獲得純度較高且免疫原性良好的目的蛋白，為進一步研究IBD亞單位疫苗和建立IBDV檢測方法提供參考。