鐵死亡的機(jī)制及其在相關(guān)疾病中的意義

蘭 斌，龔盛強(qiáng)，成紹武，賀 超，廖 君，葛金文，王國(guó)佐*

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1.中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 2.醫(yī)學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410208)

2012年，在攜帶RAS突變基因的HT-1080纖維肉瘤細(xì)胞模型中，發(fā)現(xiàn)erastin(愛拉斯汀)不僅能通過調(diào)節(jié)線粒體電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)抑制Na+非依賴性胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Xc-)系統(tǒng)重要組成亞單元(SLC7A11)功能，減少胞內(nèi)谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成的基本原材料，導(dǎo)致鐵依賴性脂質(zhì)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的累積增加，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[1]。而這種由選擇性致死小分子物質(zhì)erastin觸發(fā)的新型調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡是被我們先前忽視的類型，即“鐵死亡(ferroptosis)”。

1 鐵死亡潛在性生物指標(biāo)

酯酰基輔酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4(Acyl-CoA synthetase long-chain familymember4,ACSL4)是長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A(CoA)合成酶(ACSL)家族成員，催化花生四烯酸和腎上腺酸合成為花生四烯酰CoA和腎上腺酰CoA，參與磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等帶負(fù)電膜磷脂的合成，是脂質(zhì)代謝途徑的重要基因，通過敲除小鼠和人類細(xì)胞中ACSL4基因，能有效減少erastin和RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率。與HepG2和HL60等鐵死亡敏感細(xì)胞相比，ACSL4在抗鐵死亡(例如LNCaP和K562)細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)。應(yīng)用CRISPR/Cas9實(shí)施全基因組篩選和基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)ACSL4是執(zhí)行鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵因素[2]，發(fā)揮出細(xì)胞保護(hù)的巨大潛力。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作為GSH還原酶的輔酶，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)GSH水平發(fā)揮重要作用。通過人纖維肉瘤細(xì)胞系、人骨肉瘤細(xì)胞系和人橫紋癌細(xì)胞系等[3]12種不同的細(xì)胞系研究鐵死亡經(jīng)典誘導(dǎo)劑(erastin、RSL3和FIN56)作用，胞內(nèi)NAD(H)和NADP(H)水平均明顯降低，并鑒定到脂質(zhì)代謝下游效應(yīng)物ROS的形成，而NAD(P)(H)的消耗是脂質(zhì)過氧化作用的結(jié)果，其含量水平可能是監(jiān)測(cè)鐵死亡誘導(dǎo)劑敏感性的生物指標(biāo)。

環(huán)加氧酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是催化體內(nèi)花生四烯酸合成前列腺素(PG)初始步驟中的關(guān)鍵性限速酶。通過建立膠原酶誘導(dǎo)腦出血(ICH)模型小鼠[4]，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)編碼的COX-2在ICH后神經(jīng)元中高度表達(dá)，抑制COX-2功能可減少ICH后的繼發(fā)性腦損傷，使用liproxstatin-1(鐵死亡抑制劑)處理小鼠后，表現(xiàn)出明顯的腦保護(hù)作用并改善神經(jīng)功能，為ICH患者提供了潛在臨床治療。

目前，針對(duì)鐵死亡的研究仍處于初級(jí)階段，深入闡明其在不同臨床疾病模型中的生化機(jī)制，對(duì)相關(guān)疾病治療靶點(diǎn)的確證及藥物研發(fā)具有重要意義。

2 鐵死亡的發(fā)生機(jī)制及其病理生理意義

鐵死亡最顯著特征為鐵依賴性脂質(zhì)活性氧(ROS)的是否過載，它將鐵死亡發(fā)生過程分成上游(ROS產(chǎn)生)和下游(執(zhí)行鐵死亡)兩個(gè)部分, 主要位于鐵代謝途徑、Xc-/GPX4途徑和脂質(zhì)代謝途徑的交叉處，也受其他通路的共同調(diào)控。

2.1 鐵代謝途徑調(diào)控及其意義

鐵作為生命必需的微量元素之一，主要以二價(jià)和三價(jià)鐵離子的形式存在于機(jī)體內(nèi),當(dāng)小腸吸收或紅細(xì)胞降解釋放出的亞鐵離子(Fe2+)經(jīng)銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin,CP)氧化為三價(jià)鐵離子(Fe3+)，同膜上轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TF)結(jié)合成TF-Fe3+形式，通過膜蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor protein 1,TFR1)形成復(fù)合物內(nèi)吞入胞體，胞內(nèi)Fe3+被前列腺6次跨膜上皮抗原3(STEAP3)還原成亞鐵離子(Fe2+)，二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(divalent metal transporter1,DMT1)或鋅鐵調(diào)控蛋白家族8/14(ZRT/IRT-like proteins 8/14,ZIP8/14) 介導(dǎo)Fe2+儲(chǔ)存到細(xì)胞質(zhì)中不穩(wěn)定的鐵池(labile iron pool,LIP)內(nèi)和鐵蛋白輕鏈多肽(ferritin light chain,FTL)與鐵蛋白重鏈多肽1(ferritin heavy chain 1,FTH1)組成的鐵儲(chǔ)存蛋白復(fù)合物中，多余部分亞鐵離子則由膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輸出蛋白(ferroportin,Fpn)將Fe2+氧化成Fe3+出胞，參與體內(nèi)鐵再循環(huán)，嚴(yán)格把控細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)。

病理狀態(tài)下，通過研究鐵死亡經(jīng)典誘導(dǎo)劑erastin作用于人類癌細(xì)胞，熱休克預(yù)處理和過表達(dá)熱休克蛋白B1(heat shock protein B1,HSPB1)可抑制膜蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TFR1)表達(dá)，蛋白激酶C介導(dǎo)的HSPB1磷酸化及鐵代謝主要轉(zhuǎn)錄因子鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2(iron response element binding protein 2,IREB2)被抑制，顯著增加鐵儲(chǔ)蛋白亞基鐵蛋白輕鏈多肽(FTL)與鐵蛋白重鏈多肽1(FTH1)表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子濃度和脂質(zhì)活性氧的產(chǎn)生。而血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)則通過補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)鐵離子及產(chǎn)生活性氧，加速erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[5]。這表明,鐵蛋白調(diào)控和鐵代謝穩(wěn)態(tài)可能成為鐵死亡機(jī)制的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)。

2.2 Xc-/GPX4途徑調(diào)控及其意義

胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Xc-)是由機(jī)體細(xì)胞膜上SLC7A11和SLC3A2兩個(gè)亞基組成的重要抗氧化體系，可按1:1比例將細(xì)胞外胱氨酸攝取入胞內(nèi)，并被迅速還原成半胱氨酸，參與胞內(nèi)重要自由基清除劑谷胱甘肽(GSH)的合成。

谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)作為哺乳動(dòng)物中修復(fù)脂質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的硒蛋白，將胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，同時(shí)將細(xì)胞內(nèi)毒性脂質(zhì)過氧化氫(L-OOH)轉(zhuǎn)化為無毒脂醇(L-OH)，促進(jìn)H2O2分解，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。 研究發(fā)現(xiàn)， 通過敲除小鼠膜脂修復(fù)酶-GPX4或直接使用GPX4抑制劑(RSL3)可促進(jìn)脂質(zhì)過氧化和胞內(nèi)活性氧的堆積[6]，而GPX4可能是鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控者。

2.3 脂質(zhì)代謝途徑調(diào)控及其意義

鐵死亡的靈敏度與脂質(zhì)代謝失衡密切相關(guān)，包含多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的磷脂生物合成，并將磷脂作為酯酰基輔酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4(ACSL4，脂肪酸代謝介質(zhì))和磷脂膽堿?；D(zhuǎn)移酶3(LPCAT3，脂質(zhì)重塑)促脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的底物，是脂肪氧合酶對(duì)多不飽和脂肪酸(PUFA)-磷脂酰乙醇胺(PE)的選擇性氧化作用。應(yīng)用脂質(zhì)組學(xué)研究，含有花生四烯酸(C20∶4)或其延長(zhǎng)產(chǎn)物腎上腺酸(C22∶4)的磷脂酰乙醇胺(PE)是脂質(zhì)氧化作用并驅(qū)使細(xì)胞朝向鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵磷脂，而ACSL4和LPCAT3參與多不飽和脂肪酸的生物合成和重塑，通過補(bǔ)充花生四烯酸或其他多不飽和脂肪酸的細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)鐵死亡的高靈敏度[7]，執(zhí)行鐵死亡發(fā)生的重要步驟。

2.4 其他途徑調(diào)控及其意義

此外，通過p62-Keap1-NRF2途徑[8]、p53-SAT1-ALOX15途徑[9]、ATG5-ATG7-NCOA4途徑[10]或谷氨酰胺代謝途徑[11]均能有效調(diào)控胞內(nèi)鐵離子及ROS的形成，發(fā)揮出鐵死亡的致死效應(yīng)。

基于以上分析，鐵死亡作為一種鐵依賴性脂質(zhì)過氧化和ROS積累誘導(dǎo)的新型調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，受到多條生物學(xué)途徑的有效調(diào)控，呈現(xiàn)出“一個(gè)中心、兩大部分、網(wǎng)絡(luò)調(diào)控”的工作模式(圖1)。

3 鐵死亡相關(guān)疾病研究

鐵死亡的錯(cuò)誤調(diào)控參與多種臨床疾病的發(fā)生，深入研究鐵死亡有助于進(jìn)一步明確相關(guān)疾病機(jī)制。

3.1 涉及鐵代謝途徑的疾病研究

鐵死亡參與神經(jīng)元中鐵依賴性氧化細(xì)胞死亡形式。阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease, HD)均是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。通過建立APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型[12]，使用鐵螯合劑(desferrioxamine,DFO)處理，激活熱休克蛋白B1表達(dá)，進(jìn)而抑制TFR1對(duì)鐵離子的轉(zhuǎn)入。鐵應(yīng)答蛋白(IRP1和2)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)表達(dá)水平降低，鐵輸出蛋白鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Fpn)水平增加，降低細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度及ROS的產(chǎn)生，表現(xiàn)出明顯的腦保護(hù)作用并改善神經(jīng)功能。

①鐵代謝途徑； ②Xc-/GPX4途徑； ③脂質(zhì)代謝途徑； ④p62-Keap1-NRF2途徑； ⑤p53-SAT1-ALOX15途徑； ⑥ATG5-ATG57-NCOA4途徑； ⑦谷氨酰胺代謝途徑

圖1細(xì)胞鐵死亡通路：上游(活性氧產(chǎn)生)和下游(執(zhí)行鐵死亡)
Fig1Cellularferroptosispathway:upstream(reactiveoxygengeneration)anddownstream(executionofferroptosis)

應(yīng)用青蒿琥酯(artesunate,ART)治療胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鐵離子沉積和ROS的產(chǎn)生能被特異性誘導(dǎo)，使用鐵死亡抑制劑可有效阻止ART誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化。通過調(diào)節(jié)膜上轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)，降低胞內(nèi)亞鐵離子濃度，可增加人類異種移植小鼠腫瘤模型中的erastin抗癌活性[13]。而線粒體鐵蛋白(FtMt)作為線粒體中調(diào)節(jié)鐵代謝的鐵儲(chǔ)存蛋白，其過度表達(dá)可顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中erastin誘導(dǎo)的鐵死亡發(fā)生[14]。

3.2 涉及Xc-/GPX4途徑的疾病研究

通過建立GPX4缺失模型小鼠研究鐵死亡對(duì)海馬神經(jīng)變性、生理性T細(xì)胞應(yīng)答及腎小管上皮細(xì)胞的重要性，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽/Gpx4軸在預(yù)防脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的鐵死亡中起重要作用，并驗(yàn)證其參與小鼠行為功能障礙[15]、免疫感染[16]、急性缺血性腎病的組織損傷[17]。

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)胱氨酸缺乏高度敏感的疾病，使用DFO和ferrostatin-1能有效預(yù)防胱氨酸缺乏誘導(dǎo)的谷胱甘肽(GSH)減少水平和細(xì)胞死亡，限制乳腺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[18]。通過恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)GSH水平，激活GPX4表達(dá)，抑制脂質(zhì)過氧化和ROS積累，限制了胃癌細(xì)胞鐵死亡發(fā)生[19]。

3.3 涉及脂質(zhì)代謝途徑的疾病研究

5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)作為脂質(zhì)代謝途徑中的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)，通過5-LOX抑制劑抑制小鼠海馬神經(jīng)元(HT22)細(xì)胞系中的鐵死亡，發(fā)揮出神經(jīng)保護(hù)作用。Ferrostatin-1通過抑制膜脂中多不飽和脂肪酸(PUFA)氧化，減少了少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡發(fā)生率[20]。

3.4 其他

通過鐵死亡自噬途徑(ATG5-ATG7-NCOA4途徑)控制鐵依賴ROS的產(chǎn)生，限制人纖維肉瘤細(xì)胞中erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。細(xì)胞代謝中谷氨酰胺分解作為鐵死亡發(fā)生的重要途徑，抑制體內(nèi)谷氨酰胺溶解可有效減少缺血/再灌注引起的心臟損傷[21]。

目前，針對(duì)鐵死亡的研究主要涉及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和缺血再灌注損傷等臨床疾病，通過鐵死亡抑制劑可有效延緩病情進(jìn)展和改善臨床癥狀。深入研究鐵死亡在疾病中的發(fā)生機(jī)制，及鐵死亡抑制劑的作用途徑，可能對(duì)防治相關(guān)疾病更具有針對(duì)性。

4 問題與展望

鐵死亡作為近年發(fā)現(xiàn)的新型細(xì)胞死亡方式，已被研究證明參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，但目前仍有諸多疑問有待解決：1)如何識(shí)別鐵死亡下游信號(hào)或鐵依賴性ROS的執(zhí)行途徑？2)鐵死亡期間鐵的具體作用是什么？3)是否還存在其他代謝途徑的調(diào)控？4)目前仍缺乏像細(xì)胞凋亡(如caspases家族激活)、自噬(如自噬溶酶體形成)等可直觀反映鐵死亡的特異性標(biāo)志物。因此，識(shí)別下游信號(hào)傳導(dǎo)或鐵依賴性ROS執(zhí)行途徑，從基因水平和特異性指標(biāo)角度深入闡明鐵死亡機(jī)制以區(qū)分其他類型的細(xì)胞死亡，成為后期研究的重點(diǎn)，而鐵死亡機(jī)制的明確可為其他涉及鐵代謝紊亂、氧化損傷等相關(guān)疾病提供新的研究思路和治療手段，具有重要的臨床意義。

傳統(tǒng)中藥治療臨床疾病發(fā)揮出顯著療效，但其作用機(jī)制仍不清楚。近期發(fā)現(xiàn)，黃芩素(baicalein)可作為一種新型鐵死亡抑制劑，且效果顯著優(yōu)于典型的鐵死亡抑制劑(Fer-1、甲磺酸去鐵胺等)，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥對(duì)鐵死亡機(jī)制的作用及開發(fā)相關(guān)藥物研究打開了新思路[22]。本課題組前期研究益氣活血中藥“腦泰方”可通過促進(jìn)腦缺血大鼠海馬區(qū)血紅素加氧酶-1(HO-1)生成,上調(diào)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Fpn)和下調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)、二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(DMT1)的表達(dá)，減少腦鐵沉積,調(diào)節(jié)神經(jīng)元鐵代謝，發(fā)揮腦缺血/再灌注后神經(jīng)元的保護(hù)作用[23-24]。從“腦泰”方調(diào)控鐵代謝途徑著手，深入研究鐵死亡機(jī)制，有望進(jìn)一步闡明其在相關(guān)疾病中的作用新途徑。

細(xì)胞的存亡作為機(jī)體正常代謝的重要環(huán)節(jié)，而鐵死亡作為一種新型的細(xì)胞死亡形式，深入研究并闡明其在相關(guān)疾病中的病理生理機(jī)制，可為尋找新的藥物靶點(diǎn)和臨床防治提供新的思路。