?；切苋パ跄懰釡p輕2型糖尿病小鼠肝細(xì)胞凋亡

張 換，王志鵬，竇 娜，吳 靜，李 蘭，門(mén)秀麗

(華北理工大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北 唐山 063210)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的代謝性疾病。近年來(lái)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，而各種慢性并發(fā)癥是造成T2DM患者死亡的主要原因。以往的研究多集中在糖尿病對(duì)心血管、視網(wǎng)膜、腎臟以及神經(jīng)損傷的影響，而對(duì)于糖尿病肝損傷的研究較少。研究表明：高糖、高脂可引起肝細(xì)胞損傷，并且這種肝損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。細(xì)胞持續(xù)性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激，通過(guò)激活JNK路徑及誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，最后可導(dǎo)致細(xì)胞受損和凋亡[1]。

?；切苋パ跄懰?tauroursodeoxycholic acid, TUDCA)是一種結(jié)合型天然膽汁酸，廣泛存在于人和動(dòng)物的膽汁中，作為參與蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶，可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[2]。但其對(duì)2型糖尿病肝損傷的影響及相關(guān)機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)自發(fā)2型糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)，觀察TUDCA對(duì)T2DM小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

SPF級(jí)13周齡雌性db/db小鼠和db/m小鼠各10只，即db/db糖尿病小鼠和表型正常的C57BL db/m小鼠(lepr-/m)，質(zhì)量18～24 g(北京美森生物醫(yī)藥科技有限公司：SCXK京2011-0012)。Trizol試劑(Invitrogen公司)；溴酚藍(lán)(Solarbio公司)；Tris-HCl(Fluka公司);小鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(Linco公司);即用型免疫組織化學(xué)二步法試劑盒、山羊超敏二步法試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；C-JUN兔源多克隆抗體和XBP- 1羊源多克隆抗體(Santa Cruz公司)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)；Trans2K Plus DNA Marker和2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；SOD、MDA和ROS試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥方式：將每種小鼠隨機(jī)分成溶劑對(duì)照組和TUDCA處理組(每天給予TUDCA 500 mg/kg,早晚8點(diǎn)各1次，連續(xù)灌胃2周)，溶劑對(duì)照組采用同樣方法給予相同體積的PBS溶液。觀察動(dòng)物變化。

1.2.2 樣本采集和指標(biāo)檢測(cè)：小鼠飼養(yǎng)2周后，禁食6 h，腹主動(dòng)脈取血，處死動(dòng)物，留取血漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)定血糖和胰島素、ALT、AST；通過(guò)ELISA檢測(cè)MDA、ROS和SOD水平。

1.2.3 肝組織形態(tài)觀察：每組取5只小鼠的部分肝臟組織，于10%甲醛中的肝臟組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋和切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)的變化及其膠原產(chǎn)生。同樣每組取5只小鼠的部分肝臟組織，經(jīng)常規(guī)冰凍切片，進(jìn)行油紅O染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病變的情況及其脂質(zhì)含量變化。

1.2.4 TUNEL檢測(cè)：每組取5只小鼠的部分肝臟組織標(biāo)本用OCT包埋劑包埋后，進(jìn)行冰凍切片，制成4 μm切片，以備進(jìn)行TUNEL熒光染色，用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)行TUNEL熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察肝組織細(xì)胞凋亡。另取部分肝臟組織于10%甲醛中的肝臟組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋和切片，按照免疫組化試劑盒說(shuō)明操作檢測(cè)肝組織C-JUN、XBP- 1和SOD的表達(dá)，以酶作為標(biāo)志物與外加底物作用后產(chǎn)生不溶性色素，沉積于抗原和抗體反應(yīng)的部位，酶降解底物量與色澤濃度成正比，可反映被測(cè)定抗原和抗體的量，用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)分析。

1.2.5 Real-time PCR方法檢測(cè)肝組織C-JUN和XBP- 1的表達(dá)：Real-time PCR方法檢測(cè)肝組織C-JUN和XBP- 1的基因表達(dá)水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠肝組織RNA，并測(cè)濃度，用A260/A280表示RNA濃度待測(cè)樣品RNA濃度=(4×A260)g/L。取RNA樣品5 μL，按RNA反轉(zhuǎn)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)條件為65 ℃溫浴5 min，冰浴1 min退火后加入反轉(zhuǎn)液，混合后42 ℃溫浴60 min，再離心，70 ℃溫浴5 min終止。再取4 μL，以20 μL體系制備PCR體系，PCR引物序列分別為C-JUN：上游引物5′-TC CCCTATCGACATGGAGTC-3′，下游引物5′-TTTTG CGCTTTCAAGGTTTT-3′；β-actin：上游引物5′-GCT CTTTTCCAGCCTTCCTT-3′，下游引物5′-CTTCTGC ATCCTGTCAGCAA-3′；XBP- 1：上游引物5′-CGCAGC ACTCAGACTATGTG-3′，下游引物5′-AAACATGA CAGGGTCCAACTT-3′；GAPDH：上游引物5′-CCTCT GGAAAGCTGTGGCGTG-3′，下游引物5′-GCCAGTG AGCTTCCCGTTCAG-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、1 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，循環(huán)40次，Ct值法分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 糖代謝變化

與lean對(duì)照組相比，db/db對(duì)照組小鼠空腹血糖明顯增加；而與db/db對(duì)照組相比，db/dbTUDCA組小鼠空腹血糖降低(P<0.05)；給藥前后lean小鼠血糖變化不明顯(表1)。

2.2 胰島素水平檢測(cè)

與lean對(duì)照組相比，db/db對(duì)照組小鼠空腹血糖升高，空腹胰島素水平升高(P<0.05)(圖1)。

表1 空腹血糖變化Table 1 Changes of fasting n=5)

*P<0.05 compared with lean control；#P<0.05 compared with db/db control.

*P<0.05 compared with lean control；#P<0.05 compared with db/db control圖1 胰島素變化Fig 1 Changes of insulin

2.3 肝組織中氧化應(yīng)激相關(guān)因子的水平

與lean對(duì)照組相比，db/db對(duì)照組小鼠肝組織中MDA、ROS含量顯著增加，SOD活性明顯降低；與db/db對(duì)照組相比，db/db TUDCA組小鼠肝組織MDA和ROS含量減少，SOD活性增加(P<0.05)。給藥前后lean小鼠肝組織上述指標(biāo)變化無(wú)顯著性差異(表2)。

2.4 血漿ALT和AST測(cè)定

與lean對(duì)照組相比，db/db對(duì)照組小鼠血漿ALT升高(P<0.05)，AST變化不明顯；與db/db對(duì)照組相比，db/db TUDCA組小鼠血漿ALT、AST明顯降低(P<0.05)(圖2，3)。

表2 肝組織SOD、MDA、XOD和ROS因子的表達(dá)

*P<0.05 compared with lean control；#P<0.05 compared with db/db control.

*P<0.05 compared with lean control；#P<0.05 compared with db/db control圖2 血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶的變化Fig 2 Changes of alanine transaminase in plasma

#P<0.05 compared with db/db control圖3 血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化Fig 3 Changes of aspartate transaminase in plasma

2.5 肝臟組織病理形態(tài)HE染色和油紅O染色結(jié)果

db/db對(duì)照組肝臟HE染色可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫、胞質(zhì)疏松淡染和氣球樣變，細(xì)胞排列紊亂擁擠，肝竇受壓變窄，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)膽汁淤積并可見(jiàn)融合的脂滴；db/db TUDCA組與db/db對(duì)照組相比，肝細(xì)胞水腫減輕、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少、肝細(xì)胞再生減少和偶見(jiàn)脂肪變性，lean小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯變化(圖4A)；與lean對(duì)照組相比，db/db對(duì)照組小鼠肝組織細(xì)胞可見(jiàn)較多紅色油紅O著色脂滴，而與db/db對(duì)照組小鼠相比，db/db TUDCA組小鼠肝組織細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴數(shù)量減少(圖4B)。

A.HE staining results of liver tissue in mice(×100); B.results of Oil red O staining in live tissues of mice圖4 小鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變Fig 4 Morphologic changes in hepatic tissue of mice(×100)

2.6 光鏡和激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察肝細(xì)胞凋亡

db/db對(duì)照組可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，而db/db TUDCA組則相對(duì)減輕，lean小鼠偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞(圖5，6)。

圖5 小鼠肝凋亡細(xì)胞染色結(jié)果Fig 5 Staining results of hepatic apoptosis(×200)

圖6 各組小鼠肝組織細(xì)胞凋亡熒光染色結(jié)果Fig 6 Fluorescent staining results of cell apoptosis in liver tissues of mice in each group(×200)

2.7 Real-time PCR檢測(cè)C-JUN和XBP- 1基因的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定C-JUN和XBP- 1基因表達(dá)水平，熔解曲線顯示擴(kuò)增發(fā)出熒光的片段為所需產(chǎn)物；數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，db/db對(duì)照組與lean對(duì)照組相比，C-JUN和XBP- 1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；db/dbTUDCA組C-JUN和XBP- 1基因較db/db對(duì)照組表達(dá)下調(diào)(P<0.05)(表3)。

表3 肝組織XBP- 1和C-JUN mRNA的相對(duì)水平

*P<0.05 compared with lean control；#P<0.05 compared with db/db control.

2.8 免疫組化檢測(cè)肝組織C-JUN、XBP- 1和SOD蛋白的表達(dá)

db/db對(duì)照組C-JUN蛋白信號(hào)定位于肝細(xì)胞核，呈棕黃色，部分在胞質(zhì)；XBP- 1蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于肝細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色。C-JUN和XBP- 1蛋白在db/db對(duì)照組肝細(xì)胞表達(dá)區(qū)可見(jiàn)彌漫性深棕色，db/dbTUDCA組相比db/db對(duì)照組表達(dá)區(qū)顯色明顯減輕，lean小鼠在肝細(xì)胞表達(dá)區(qū)偶見(jiàn)淺棕色(圖7A，B)，SOD表達(dá)與其相反(圖7C)。

與lean對(duì)照組比較，db/db對(duì)照組小鼠肝組織C-JUN蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，其吸光度(A)值分別為0.308和0.380；與db/db對(duì)照組比較，db/db TUDCA組小鼠肝組織C-JUN蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，其A值分別為0.380和0.342(P<0.05)(表4)。與lean對(duì)照組比較，db/db對(duì)照組小鼠肝組織XBP- 1蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，其A值分別為0.246和0.301；與db/db對(duì)照組比較，db/db TUDCA組小鼠肝組織XBP- 1蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，其A值分別為0.301和0.274(P<0.05)(表4)。與lean對(duì)照組比較，db/db對(duì)照組小鼠肝組織SOD蛋白表達(dá)量明顯下降，其A值分別為0.315和0.228；與db/db對(duì)照組比較，db/db TUDCA組小鼠肝組織SOD蛋白表達(dá)量升高，其A值分別為0.228和0.265(P<0.05)(表4)。

表4 肝組織C-JUN、XBP- 1和SOD的蛋白表達(dá)

*P<0.05 compared with lean control；#P<0.05 compared with db/db control.

3 討論

臨床發(fā)現(xiàn)糖尿病患者中肝臟病變可高達(dá)21%～78%，其中最主要的病變?yōu)橹靖?。肥?型糖尿病的前期或早期就已出現(xiàn)脂肪肝[3]，但其發(fā)生機(jī)制并不十分清楚。TUDCA是一種結(jié)合型天然膽汁酸， 具有保護(hù)肝細(xì)胞和拮抗疏水性膽汁酸的細(xì)胞毒作用[4]。作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，TUDCA能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改善胰島素抵抗和減少肥胖引起的肝脂肪蓄積[5]。TUDCA可通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)改善2型糖尿病小鼠的胰島素抵抗水平[6]。本實(shí)驗(yàn)中TUDCA處理之后肝細(xì)胞水腫減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，HE和油紅O鏡下見(jiàn)炎性反應(yīng)病變明顯減輕，肝細(xì)胞再生減少，偶見(jiàn)脂肪變性肝細(xì)胞脂滴?？赡芘cTUDCA抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

A.expression of C-JUN protein in liver tissues of mice in each group; B.expression of XBP-1 protein in liver tissues of mice in each group; C.expression of SOD protein in liver tissues of mice in each group

有研究表明ROS是誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和引起肝組織損傷的一個(gè)重要因素[7]。SOD是機(jī)體主要的抗氧化物質(zhì)，SOD可反映體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平[8]。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化物的最終產(chǎn)物，它能使生物膜變性、衰老或死亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)db/db鼠用TUDCA處理后，ROS和MDA降低，SOD活性和胰島素水平升高，說(shuō)明TUDCA可減輕2型糖尿病肝氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)有研究報(bào)道C-JUN和XBP- 1的表達(dá)和氧化應(yīng)激抑制與激活有關(guān)鍵作用，正常情況下活性很低，在炎性反應(yīng)刺激下被激活，作為JNK的下游因子，C-JUN基因通過(guò)調(diào)節(jié)JNK基因的表達(dá)，并對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激引起的損傷起關(guān)鍵的保護(hù)作用[10]。在應(yīng)激條件下，XBP- 1 mRNA由ATF6誘導(dǎo)并經(jīng)IRE- 1剪接，表達(dá)高活性轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP- 1，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和UPR效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活UPR，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)。研究[11- 12]發(fā)現(xiàn)，高糖促進(jìn)XBP- 1的剪接，表達(dá)高活性轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP- 1，增加脂質(zhì)的蓄積，引起肝損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)，過(guò)度激活JNK/C-JUN信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，引起肝損傷[13]。本實(shí)驗(yàn)C-JUN和XBP- 1基因表達(dá)下調(diào)，免疫組化示其相關(guān)蛋白表達(dá)降低，SOD蛋白表達(dá)量升高，說(shuō)明TUDCA可通過(guò)減輕2型糖尿病肝氧化應(yīng)激反應(yīng)而減少肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)db/dbTUDCA組空腹血糖、胰島素水平和轉(zhuǎn)氨酶得到明顯改善，肝臟形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示該組小鼠肝臟損傷明顯減輕，均提示TUDCA能有效減輕肝細(xì)胞凋亡和損傷，從而減輕肝損傷。

綜上所述，TUDCA減輕2型糖尿病并發(fā)的肝損凋亡。能改善2型糖尿病的胰島素抵抗，降低血糖，從而減輕肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕細(xì)胞凋亡。