Dis-SPE-UPLC-MS/MS測定卷煙主流煙氣中4種TSNAs

熊 巍，陶曉秋，韶濟(jì)民，張海燕

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Dis-SPE-UPLC-MS/MS測定卷煙主流煙氣中4種TSNAs

熊 巍，陶曉秋*，韶濟(jì)民，張海燕

（四川省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，成都 610041）

煙草特有N-亞硝胺（TSNAs）是卷煙煙氣中重要的致癌成分，為準(zhǔn)確測定卷煙主流煙氣中的TSNAs釋放量，建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測定卷煙主流煙氣中4種TSNAs的檢測方法。采用劍橋?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣，經(jīng)醋酸銨水溶液提取，N-丙基乙二胺（PSA）凈化后UPLC-MS/MS測定。結(jié)果顯示，TSNAs的工作曲線在1~110 ng/mL之間線性關(guān)系良好（2>0.99），檢出限（LOD，以/=3計(jì)）0.008~0.016 ng/mL；回收率82.5%~94.8%，精密度4.9%~9.8%。該方法與標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對效果良好，相關(guān)系數(shù)的范圍為0.9991~0.9995。該方法準(zhǔn)確可靠、選擇性好，適合于烤煙型卷煙主流煙氣中TSNAs釋放量的檢測。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；主流煙氣；煙草特有亞硝胺；烤煙

煙草特有亞硝胺（Tobacco-Specific Nitrosamines，TSNAs）是一類僅存在于煙草及煙氣中的致癌或潛在致癌物質(zhì)[1]。最為常見的TSNAs有4種[2-3]，分別為：4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮[4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, NNK]、亞硝基新煙草堿（N-nitrosoanatabine, NAT）、亞硝基降煙堿（N-nitrosonornicotine, NNN）和（N-nitrosoanabasine, NAB）。由于TSNAs具有致癌性，吸入TSNAs可能會(huì)對吸煙者產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)。而準(zhǔn)確測定煙氣中TSNAs的釋放量有助于更好地評定煙氣中TSNAs對吸煙者的健康風(fēng)險(xiǎn)。

煙草及卷煙煙氣中的TSNAs測定一直是煙草化學(xué)分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，前期有較多報(bào)道采用GC-TEA和色譜質(zhì)譜法測定煙草和卷煙煙氣中的TSNAs[4]。目前，報(bào)道較多的TSNAs檢測方法主要基于HPLC-MS/MS法[5-8]。

TSNAs的提取過程因方法不同而不同，主要包括水相檸檬酸緩沖液萃取法[9-10]、堿性水相萃取法[11]、超臨界萃取法[12]、固相微萃取法[13]和水相乙酸銨緩沖液萃取法[14]。萃取液中TSNAs的凈化方法主要有液液萃取、固相萃取和分子印跡固相萃取[2,8]。而醋酸水溶液萃取濾片中的TSNAs后直接進(jìn)LC-MS/MS檢測是目前主流的檢測方式[7]，本研究也建立了相應(yīng)的RRLC-MS/MS測定中式卷煙主流煙氣中TSNAs的檢測方法[15]，并應(yīng)用此方法評價(jià)了不同抽吸模式下主流煙氣中TSNAs的釋放量。建立的方法雖然能夠準(zhǔn)確測定大部分卷煙中TSNAs，但是對于中式烤煙型卷煙中含量較低的NAB的測定存在較大的困難，主要源于煙氣的基質(zhì)非常復(fù)雜，不通過凈化過程會(huì)使得NAB的基質(zhì)干擾大，且會(huì)掩蓋目標(biāo)峰。

基于此，本文選取了分離度更好的UPLC，針對中式烤煙型卷煙，建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測定卷煙主流煙氣中4種TSNAs，與傳統(tǒng)的LC-MS/MS方法相比，選取了分散固相萃?。―is-SPE）方法快速處理樣品，節(jié)省溶劑和時(shí)間的同時(shí)，顯著降低了中式烤煙型卷煙煙氣的基質(zhì)干擾，提高方法檢測的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

甲酸、乙酸銨（HPLC級，濃度49%~51%，德國Sigma公司)；乙腈、甲醇（色譜純，美國ThermoFisher公司）；（NNN、NNK、NAT、NAB、NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4和NAB-d4（純度98.5%）購自加拿大Toronto Research Chemicals公司；N–丙基乙二胺（PSA）吸附劑（美國Agilent公司）；水為超純水；2種烤煙型卷煙和2種混合型卷煙由國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供。

伯瓦特轉(zhuǎn)盤型吸煙機(jī)（200A，德國伯瓦特公司）；超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀（Xevo TQ，美國Waters公司）；TSNAs渦旋振蕩器（VtexMixer 230VeU，美國Labnet公司）；高速離心機(jī)（Sigma 3K15，德國Sigma公司）；電子分析天平（AE200，感量：0.0001 g，瑞士Mettler Toledo公司）；超純水儀（Cascada ANMK2，美國Pall公司）；有機(jī)相針式濾器（0.22 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；單孔道移液槍（20~200 μL，德國Eppendorf公司）、電動(dòng)分液器（配1 mL、5 mL槍頭，德國Eppendorf公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

儲(chǔ)備液及工作液的配制：用甲醇準(zhǔn)確配制單一TSNAs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制的濃度分別為NNN：1 mg/mL，NNK：2.35 mg/mL，NAT：1 mg/mL和NAB：0.5 mg/mL，單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液儲(chǔ)存于棕色儲(chǔ)液瓶中，?20 ℃保存。準(zhǔn)確移取各單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于同一25 mL棕色容量瓶，用甲醇定容混合后得混合TSNAs標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（TSNAs濃度：1 μg/mL）。

氘代內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液配制：用甲醇配制單一TSNAs-d4內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，配制濃度分別為NNN-d4：1 mg/mL，NAT-d4：1 mg/mL，NAB-d4：1 mg/mL和NNK-d4：2.5 mg/mL，儲(chǔ)存于棕色儲(chǔ)液瓶中，?20 ℃保存。準(zhǔn)確移取一定量的各內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于同一25 mL棕色容量瓶，用甲醇定容配成混合氘代內(nèi)標(biāo)工作溶液（TSNAs-d4：1 μg/mL）。

1.3 LC-MS/MS條件

質(zhì)譜條件：離子源，電噴霧電離源（ESI）；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；電噴霧電壓（IS），3.0 kV；霧化氣流量，800 L/Hr；錐孔氣（cone）流量，50 L/Hr；離子源溫度，500 ℃；碰撞氣，氬氣，0.15 mL/min；駐留時(shí)間，30 ms。監(jiān)測離子對及其相應(yīng)的碰撞能量（CE）見表1。

色譜條件：色譜柱，Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×200 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A，0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液；流動(dòng)相B，甲醇；流速0.6 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。洗脫梯度：0~0.5 min，80% A；0.5~1.0 min，80% A~10% A；1.0~2.9 min，10% A；2.9~3.5 min，10% A~80% A；3.51~5.0 min，80% A。

表 1 多反應(yīng)監(jiān)測模式監(jiān)測4種煙草特有亞硝胺及其氘代內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)

注：*表示定量離子對。Note: *, quantification ion pairs．

1.4 樣品處理與分析

按照GB/T 16447—2004平衡煙支[16]，ISO標(biāo)準(zhǔn)抽吸模式（ISO 3308：2000/GB/T 19609—2004）捕集主流煙氣粒相物[17]，每個(gè)濾片抽吸5支煙。取捕集過卷煙主流煙氣的濾片，放入50 mL具塞離心管，加入15 mL 100 mmol/L醋酸銨萃取液，并加入150 μL 1 μg/mL混合氘代內(nèi)標(biāo)，在2000 r/min的條件下渦旋振蕩5 min，取1 mL上清液于2 mL旋蓋離心管中，加入25 mg PSA，在2000 r/min的條件下渦旋振蕩2 min，在6000 r/min的條件下離心4 min。上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜，取5 μL濾液引入LC-MS/MS分離分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS條件

前期我們已建立過LC-MS/MS法測定卷煙主流煙氣中的4種TSNAs，根據(jù)前期的研究顯示TSNAs中帶有電負(fù)性較強(qiáng)的氮原子，宜選用正離子模式[8]。氘代內(nèi)標(biāo)的使用可以部分抵消基質(zhì)效應(yīng)對TSNAs的干擾，主要源于同位素內(nèi)標(biāo)與分析物是同一成分，在同一保留時(shí)間出峰，從而能夠與分析物保持較好的基質(zhì)抑制或促進(jìn)作用，從而部分抵消基質(zhì)效應(yīng)對分析帶來的干擾。從這個(gè)原理也可以看出，同位素內(nèi)標(biāo)的使用沒有從本質(zhì)上降低樣品基質(zhì)對分析物的干擾，如要從根本上減少復(fù)雜基質(zhì)帶來的干擾還需要進(jìn)行樣品凈化（表1）。

前期的研究中我們選取了不同的流動(dòng)相體系對TSNAs的分離過程進(jìn)行了相關(guān)優(yōu)化，加入乙酸確實(shí)可以顯著提高電噴霧過程中TSNAs的離子化效率，但是在后期的研究中發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中乙酸的加入容易與煙氣基質(zhì)中的部分堿性成分生成鹽，從而干擾檢測過程。在本實(shí)驗(yàn)中我們選取了甲酸，主要基于甲酸能夠?yàn)門SNAs離子化提供質(zhì)子，提高其離子化效率的同時(shí)不太容易生成難溶的鹽類（圖1）。

圖 1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中4種亞硝胺（20 ng/mL）及其內(nèi)標(biāo)混合溶液（10 ng/mL）的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 不同前處理方法的比較 選取一種烤煙型卷煙樣品，捕集卷煙主流煙氣后，分別采用回旋振蕩法、渦旋振蕩法和超聲萃取法來提取卷煙主流煙氣中的TSNAs。結(jié)果顯示：回旋振蕩法的振蕩頻率較低，提取溶液的使用量相對較大，對未沒入萃取液中的樣品提取困難。超聲萃取法的萃取效率較高，但萃取過程會(huì)導(dǎo)致水溫上升，在100%的超聲效率下，水溫會(huì)從22 ℃上升至39 ℃，這可能會(huì)導(dǎo)致分析物在水溶液中降解，尤其會(huì)降低氘代內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜響應(yīng)。渦旋振蕩法的萃取效率高，萃取過程充分，萃取所需的時(shí)間短。

2.2.2 Dis-SPE凈化條件優(yōu)化 若不選取凈化過程，直接進(jìn)樣分析，對于TSNAs含量低的烤煙型卷煙，尤其是NAB的檢測準(zhǔn)確度差。這是因?yàn)榭緹熤蠳AB含量在5 ng/cig以下，且烤煙煙氣中基質(zhì)非常復(fù)雜，從而使得NAB在出峰位置基質(zhì)干擾嚴(yán)重。如果選取普通的固相萃取或液液萃取方式，萃取過程較為繁瑣，溶劑的消耗量大，萃取時(shí)間較長。如果選取基質(zhì)分散固相萃取，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到凈化樣品的結(jié)果，無需消耗有機(jī)溶劑。

亞硝胺為極性化合物，更易溶于水或者極性溶劑，應(yīng)該選取反相吸附劑來吸附雜質(zhì)。市售預(yù)填試劑包中含有硫酸鎂，在質(zhì)譜檢測過程中可能會(huì)造成離子抑制作用。進(jìn)一步比較了PSA、C18、GCB和PSA+C18的萃取效果，結(jié)果顯示單獨(dú)使用PSA作為萃取劑凈化效果更好，回收率更高（圖2）。

2.3 線性關(guān)系和檢出限

準(zhǔn)確移取10、20、50、100、200，500和1000 μL二級標(biāo)準(zhǔn)溶液（NNN、NAB、NAT為1.0 μg/mL，NNK為1.1 μg/mL）于7個(gè)10 mL容量瓶中，再在每個(gè)容量瓶中加入100 μL內(nèi)標(biāo)混合液（1.0 μg/mL），最后用0.1 mol/L的乙酸銨水溶液定容、搖勻，得一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。表2示出，TSNAs的線性范圍是1.0~100 ng/mL，此方法中各TSNA的相關(guān)系數(shù)（值）在0.9991到0.9995，NNN、NNK、NAT和NAB的檢測限分別是0.008、0.016、0.011和0.010 ng/mL。

圖2 不同萃取劑處理得到的4種亞硝胺的回收率

2.4 回收率和精密度

在主流煙氣樣品萃取過程中添加一定量的TSNAs標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后提取、測定，計(jì)算回收率。本實(shí)驗(yàn)選用高、中、低3種不同濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來考察方法的準(zhǔn)確度，表3表明，除了較低含量的NAB在加入量為2.0 ng時(shí)的回收率為82.5%之外，其他點(diǎn)的回收率都在90%~95%，對同一樣品平行測定5次，4種化合物回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍為4.9%~9.8%。

2.5 本方法與傳統(tǒng)振蕩萃取方法的比較

傳統(tǒng)的LC-MS/MS測定主流煙氣的TSNAs主要是選取回旋振蕩或者超聲萃取30 min，我們選取了4個(gè)樣品，2個(gè)烤煙型樣品，2個(gè)混合型樣品，盒標(biāo)焦油量范圍為3~11 mg，分別用傳統(tǒng)的振蕩萃取方法和渦旋振蕩基質(zhì)分散固相萃取方法進(jìn)行比對，每個(gè)樣品測定4個(gè)平行，回歸分析顯示（表4），兩種方法的NNN，NNK，NAB和NAT相關(guān)系數(shù)分別為0.983，0.930，0.835和0.996，4個(gè)指標(biāo)都顯著相關(guān)（<0.001）。兩種方法的相關(guān)性分析的結(jié)果見表5。振蕩萃取-測定LC-MS/MS測定1號烤煙型卷煙主流煙氣中TSNAs的選擇離子流色譜圖如圖1所示，同一樣品中采用本方法處理測定主流煙氣的TSNAs的選擇離子流色譜圖如圖3所示，從圖中可以看出，本實(shí)驗(yàn)由于加入簡單的凈化步驟后，目標(biāo)分析物的響應(yīng)增強(qiáng)，干擾物明顯降低。

表 2 TSNAs的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

注：：分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值;：濃度, ng/mL。Note:, the ratio of peak areas between those of analytes and surrogate;, mass concentration, ng/mL.

表3 TSNAs在劍橋?yàn)V片上的回收率

表4 本方法與傳統(tǒng)LC-MS/MS方法檢測結(jié)果比較 ng/支

注：A、B為烤煙型卷煙，C、D為混合型卷煙。Note: Sample A and B are Virginia type cigarettes and sample C and D are blend cigarettes.

表5 本實(shí)驗(yàn)方法和振蕩萃取-LC-MS/MS方法測定數(shù)據(jù)的回歸分析

3 結(jié) 論

在煙氣等復(fù)雜體系TSNAs的LC/MS/MS測定中，基質(zhì)效應(yīng)對電噴霧離子源的噴霧效率和均勻性影響嚴(yán)重，已經(jīng)成為瓶頸問題之一。為解決這一問題，本文選取了Dis-SPE的方法凈化煙氣樣品，減少基質(zhì)干擾，并選取一一對應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)來進(jìn)一步抵消基質(zhì)效應(yīng)。建立的檢測方法能夠快速、準(zhǔn)確地測定卷煙主流煙氣中4種TSNAs。該方法選取Dis-SPE的方法凈化煙氣萃取液，在不過多增加前處理步驟的前提下有效的凈化復(fù)雜的煙氣基質(zhì)，能夠?qū)崿F(xiàn)煙氣中4種TSNAs的準(zhǔn)確測定，適合于烤煙型卷煙中低含量的TSNAs的分析。

圖 3 同一烤煙樣品振蕩萃取和分散固相萃取后TSNAs及其氘代內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

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Determination of Four Tobacco-specific N-nitrosamines in Tobacco Mainstream Smoke by Dispersive Solid Phase Extraction-UPLC-MS/MS

XIONG Wei, TAO Xiaoqiu*, SHAO Jimin, ZHANG Haiyan

（Sichuan Tobacco Quality Supervision and Testing Station, Chengdu 640041, China）

Tobacco-specific nitrosamines (TSNAs) are very important carcinogens in tobacco and cigarette smoke. In order to develop a robust analytical method to determine low levels of TSNAs in cigarette smoke, a dispersive solid phase extraction-UPLC-MS/MS method was used to simultaneously determine four TSNAs in mainstream cigarette smoke. Mainstream smoke was collected on a cambridge filter pad, further extracted with ammonium acetate aqueous solution, then cleaned up by primary secondary amine (PSA), and subsequently analyzed with UPLC-MS/MS. The proposed method displayed limit of detections between 0.008 and 0.016 ng/mL and good linearity over the range from 1 to 110 ng/mL, with a2>0.99. Recovery varied from 82.5% to 94.8% for Chinese Virginia cigarettes. Mean precisions ranged from 4.9%-9.8%. The proposed method, which provides higher sensitivity and specificity, is suitable for quantitatively analyzing TSNAs yield in Chinese Virginia cigarettes.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry; tobacco-specific N-nitrosamines; mainstream cigarette smoke; virginia cigarettes

TS41+1

1007-5119（2018）04-0087-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2018.04.012

四川省煙草專賣局（公司）科技計(jì)劃項(xiàng)目“基于QuEChERS技術(shù)的卷煙煙氣成分高通量檢測方法研究”（SCYC201709）

熊 ?。?985-），男，工程師，博士，主要從事煙草、土壤化學(xué)分析工作。E-mail：xiongwei199@aliyun.com

2018-03-20

2018-06-13

，E-mail：txq@sctobacco.com.cn