抗病毒病K326新品系Y48抗TMV的細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究

文柳瓔，劉 旦，龔 敏，馬 冰，申莉莉，羅成剛，任 民，程立銳，蔣彩虹，楊愛國

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抗病毒病K326新品系Y48抗TMV的細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究

文柳瓔，劉 旦，龔 敏，馬 冰，申莉莉，羅成剛，任 民，程立銳，蔣彩虹，楊愛國*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101）

Y48是對(duì)主栽烤煙品種K326的病毒病抗性進(jìn)行定向改良培育出的新品系，在保持原K326其他性狀不變的前提下，對(duì)TMV和CMV抗性顯著提高。為揭示其在細(xì)胞學(xué)方面的抗病機(jī)制，本研究利用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)TMV接種0~72 h后的K326和Y48葉片進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。結(jié)果顯示，K326接種24 h時(shí)，葉綠體類囊體片層減少，線粒體膨大，胞內(nèi)出現(xiàn)自噬結(jié)構(gòu)，接種72 h時(shí)，葉綠體、線粒體被病毒完全破壞，葉肉細(xì)胞病理性壞死；而Y48，在接種48 h時(shí)才發(fā)生葉綠體內(nèi)部沉積少量顆粒，線粒體嵴消失，胞內(nèi)出現(xiàn)降解的囊泡，接種72 h葉綠體，線粒體全部降解，細(xì)胞質(zhì)凝集，葉肉細(xì)胞程序化死亡。結(jié)果表明，相對(duì)于K326，Y48可以延遲TMV病毒的侵染，并啟動(dòng)超敏反應(yīng)，發(fā)生HR-PCD，并且Y48接種8 h后出現(xiàn)過氧化物酶體，可能影響細(xì)胞內(nèi)ROS代謝水平，二者或許是Y48對(duì)TMV表現(xiàn)抗病的細(xì)胞學(xué)證據(jù)，研究結(jié)果為進(jìn)一步解析Y48的抗病分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

煙草普通花葉??；透射電子顯微鏡；超微結(jié)構(gòu)；超敏反應(yīng)；細(xì)胞程序化死亡

煙草普通花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）是煙草上危害最嚴(yán)重的3種病毒病害。對(duì)優(yōu)良主栽品種進(jìn)行病毒病抗性定向改良，是保障煙葉生產(chǎn)最為快速有效的途徑[1]?？緹熎贩NK326煙葉品質(zhì)優(yōu)良，是我國烤煙生產(chǎn)的主栽品種，也是卷煙配方的主選原料，但是在煙葉生產(chǎn)過程中，K326易感病毒病。本研究以K326為背景材料，通過分子標(biāo)記輔助選擇定向改良K326的病毒病抗性，培育出兼抗TMV和CMV的改良K326新品系（暫命名為Y48）。全基因組SNP分析表明，新品系Y48的K326遺傳背景回復(fù)率為99.71%，在主要植物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀與K326保持不變的前提下，其TMV和CMV抗性得到明顯改良。新品系Y48于2016年7月29日在四川省西昌市通過了國家煙草專賣局科技司和中國煙葉公司組織的田間鑒評(píng)，該品系的成功培育得到了煙草行業(yè)內(nèi)外專家的高度評(píng)價(jià)。

TMV侵染煙草主要引起深綠與淺綠相間的花葉癥狀[2]。TMV侵染K326的細(xì)胞病理學(xué)研究表明，隨著病程從輕到重，葉片表型從退綠、斑駁到黃化、再到最后葉片皺縮、大量壞死。葉肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也隨病程變化。早期葉綠體結(jié)構(gòu)較完整，有少量消解，中期葉綠體類囊體部分發(fā)生消解，后期葉綠體大部分發(fā)生崩解[3]。另一方面，煙草在與TMV互作的進(jìn)化過程中也產(chǎn)生了多種主動(dòng)防御手段，例如超敏反應(yīng)和活性氧迸發(fā)等方式[2]。目前研究比較詳細(xì)的是基因介導(dǎo)的超敏反應(yīng)（Hypersensitive response，HR）。基因表達(dá)的蛋白可以識(shí)別TMV病毒解旋酶p50（TMV-p50），通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)煙草在病毒侵染部位發(fā)生過敏性壞死，限制TMV病毒在煙草中的擴(kuò)散[4-5]。這種壞死被認(rèn)為是超敏反應(yīng)引起的細(xì)胞程序化死亡（HR Programmed cell death，HR-PCD），與被動(dòng)死亡的病理性壞死（Pathological necrosis）細(xì)胞表現(xiàn)不同[6-9]。病理性壞死的細(xì)胞，一般表現(xiàn)為細(xì)胞核膜破裂、碎核釋出，細(xì)胞器腫脹、崩解等[6]。HR-PCD的細(xì)胞表現(xiàn)與動(dòng)物細(xì)胞凋亡類似。目前對(duì)植物HR-PCD的表型定義有爭(zhēng)議，盡管發(fā)生HR-PCD的細(xì)胞有DNA等量斷裂，染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞質(zhì)濃縮等細(xì)胞凋亡的特征，但是細(xì)胞并沒有發(fā)生水解酶大量釋放溶解細(xì)胞質(zhì)的現(xiàn)象[10-13]。最近研究報(bào)道，自噬和凋亡相關(guān)基因也參與HR-PCD的形成過程，推測(cè)自噬和凋亡對(duì)HR-PCD有疊加效應(yīng)[10-11]。

Y48相對(duì)K326具有相同遺傳背景，但是對(duì)TMV的抗性明顯提高。目前對(duì)Y48抵御TMV侵染的細(xì)胞學(xué)機(jī)制還不清楚，本研究利用透射電子顯微鏡（Transmission Electronic Microscopy，TEM），對(duì)TMV侵染過程的Y48和K326的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為解析Y48的抗病機(jī)制提供細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及病毒株系

抗病材料為烤煙新品系Y48（針對(duì)K326進(jìn)行病毒病抗性定向改良獲得的新品系），感病材料為烤煙品種K326，TMV病毒為TMV-C株系（普通株系）。煙草種子和病毒均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草遺傳育種研究中心保存。

1.2 材料種植及病毒接種

煙草種子在0.1% AgNO3溶液中浸泡消毒2 min，然后用清水浸洗5~6次，播種于50孔育苗盤中，置于人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為（23±1）℃，光照16 h/d。TMV病毒事先在NC89煙株上活化。當(dāng)煙苗長(zhǎng)至4~5葉期，通過摩擦接種法對(duì)煙苗的最上部葉接種TMV病毒，病毒接種液的配置及接種方法參考文獻(xiàn)[14]。

1.3 病情調(diào)查

于煙草幼苗接種TMV病毒后20 d進(jìn)行病情調(diào)查，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)依照全國煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法GB/T 23222—2008[15]。病情指數(shù)計(jì)算公式參照DI=∑（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值）×100。

1.4 超薄切片制備及TEM觀察

接種TMV病毒后0、8、24、48、72 h，取兩個(gè)品種（系）的接種葉，切成1 mm×5 mm葉段。2.5%戊二醛前固定24 h，1%鋨酸后固定1 h。丙酮系列脫水，Spurr樹脂包埋，65 ℃聚合24 h。樣品在Lecia EMUC6超薄切片機(jī)上制備超薄切片，切片收集于200目有膜載網(wǎng)上，經(jīng)醋酸雙氧鈾染色后，在Hitachi公司H-7650型透射電鏡下觀察拍照，加速電壓為60~80 kV。

2 結(jié) 果

2.1 K326和Y48對(duì)TMV的抗性差異

圖1表明，在接種0~48 h時(shí)間段內(nèi)，K326和Y48的接種葉片無明顯差異（圖1A-C，圖1E-G）。接種TMV 72 h，K326接種葉片可見部分組織發(fā)黃萎蔫（圖1D），而Y48接種葉的葉面顏色較接種48 h的葉片變淺，葉面有多個(gè)直徑大約1 mm的淺綠色或者淺黃色的斑點(diǎn)，并出現(xiàn)小面積褐色枯斑，但是總體看壞死斑不明顯（圖1H）。在接種4 d后，K326有輕微花葉癥狀，Y48接種葉發(fā)生超敏反應(yīng)，產(chǎn)生壞死斑，K326和Y48的表型可明顯區(qū)分。接種20 d后，K326新葉出現(xiàn)花葉，為典型的TMV病害癥狀，植株發(fā)生了病毒系統(tǒng)侵染；而Y48的新葉無發(fā)病癥狀，對(duì)病毒表現(xiàn)為免疫。病情調(diào)查結(jié)果顯示，K326的發(fā)病率為100.00%，病情指數(shù)為91.14；Y48的發(fā)病率和病情指數(shù)均為0，說明K326和Y48在TMV抗性方面存在明顯差異。

2.2 接種TMV后K326和Y48的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化

對(duì)接種葉片的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行TEM觀察，結(jié)果表明，接種0 h，K326葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、液泡邊界清晰，葉綠體細(xì)胞器和細(xì)胞核分布于細(xì)胞邊緣（圖2A）；接種24 h，液泡內(nèi)出現(xiàn)膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)（圖2B）；接種48 h，液泡內(nèi)有游離細(xì)胞器（圖2C）；接種72 h，細(xì)胞核破裂，染色質(zhì)凝聚，并向細(xì)胞核外側(cè)邊緣化分布，細(xì)胞核膜破裂（圖2D）。由此推斷，TMV侵染K326的葉肉細(xì)胞時(shí)，隨著病害逐漸加深，細(xì)胞發(fā)生病理性壞死。而Y48在接種0~24 h，葉肉細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)較完整，無明顯變化，液泡邊界清晰（圖2E，F(xiàn)）；接種48 h，液泡內(nèi)部出現(xiàn)膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)（圖2G）；接種72 h后，細(xì)胞質(zhì)凝集，細(xì)胞空泡化、液泡內(nèi)散落降解的細(xì)胞器（圖2H）；Y48在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生與過敏反應(yīng)相似的細(xì)胞表型變化，推測(cè)TMV病毒的侵染引起Y48細(xì)胞產(chǎn)生HR-PCD。

圖1 K326和Y48在接種TMV后0~72 h的葉片表型

注：N，細(xì)胞核；V，液泡；CW，細(xì)胞壁；Ch，葉綠體；箭頭，膜結(jié)構(gòu)；三角形，降解細(xì)胞器；bar=5 μm。

2.3 接種TMV后K326和Y48的葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，病毒侵染會(huì)影響寄主葉綠體的光合作用[16]。圖3顯示葉綠體隨著TMV侵染發(fā)生變化。在接種TMV 0 h時(shí)，感病品種K326葉綠體結(jié)構(gòu)完整，外膜光滑、內(nèi)部有少量淀粉粒，基粒類囊體的片層與葉綠體長(zhǎng)軸平行，排列緊湊（圖3A，B）。接種24 h，K326葉綠體整體結(jié)構(gòu)較完整，但是基粒類囊體片層減少，垛疊變?。▓D3E，F(xiàn)）。接種48 h，K326葉綠體外膜形狀不規(guī)則，內(nèi)部出現(xiàn)大量泡狀結(jié)構(gòu)。病毒的侵染影響了葉綠體光合作用，干擾淀粉合成代謝。類囊體片層進(jìn)一步變薄，松散、扭曲，淀粉粒消失（圖3I，J），并且葉綠體內(nèi)部沉積不明顆粒狀物質(zhì)（圖3I箭頭所示），推測(cè)這些顆粒物為病毒復(fù)制過程產(chǎn)生的復(fù)合體。接種72 h，葉綠體崩解，細(xì)胞內(nèi)散落類似類囊體的殘余體（圖3M，N）。以上現(xiàn)象說明K326的葉綠體隨著病毒侵害加深，發(fā)生了病理性死亡。

對(duì)于抗病品系Y48，在接種0~24 h，葉綠體未發(fā)生變化，整體結(jié)構(gòu)較完整，片層清晰，基粒類囊體排列緊湊（圖3C，D，G，H）。接種48 h，葉綠體表現(xiàn)輕微異常，內(nèi)部沉積少量不明顆粒狀物質(zhì)（圖3K，L箭頭所示），同時(shí)類囊體膜部分降解，片層模糊，淀粉?？梢姟＝臃N72 h，葉綠體形狀可分辨，多數(shù)葉綠體類囊體消失。淀粉粒仍存在，說明淀粉沒有被分解（圖3O，P）。Y48在接種TMV的0~72 h，葉綠體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)雖然變化，但整體形狀相對(duì)保持完整，由此推測(cè)Y48可能是由于類囊體膜蛋白，或者組成光合系統(tǒng)II的蛋白發(fā)生大量錯(cuò)誤折疊而被降解，最終導(dǎo)致了葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變。

2.4 接種TMV后K326和Y48的線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化

如圖4所示，在TMV接種0 h時(shí)，K326的線粒體結(jié)構(gòu)，包括膜結(jié)構(gòu)和線粒體嵴均保持完整（圖4A）。接種24 h，線粒體膨大，線粒體嵴消失，視野內(nèi)多見直徑1.3 μm以上的線粒體（圖4 B）。接種48 h線粒體膜出現(xiàn)破損，內(nèi)含物流失（圖4 C）。接種72 h，線粒體完全破裂，內(nèi)含物泄露（圖4 D）。以上結(jié)果表明隨著病毒侵害加深，K326線粒體發(fā)生了病理性壞死。對(duì)于抗病品系Y48，在接種0~24 h，線粒體結(jié)構(gòu)正常（圖4E，F(xiàn)）。接種48 h，線粒體外部膜完整，線粒體嵴消失，內(nèi)含物逐漸彌散降解（圖4G）。接種72 h，線粒體外膜仍保持完整，內(nèi)部空泡化，線粒體嵴消失（圖4H）。由此推測(cè)Y48葉肉細(xì)胞線粒體組成成分發(fā)生改變，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化，失去了能量代謝的功能。

注： CW，細(xì)胞壁；S，淀粉粒；黑色方框，表示放大區(qū)域；箭頭，不明顆粒狀物質(zhì)；bar=0.5 μm。

注Note: bar=0.2 μm。

2.5 接種TMV后K326和Y48自噬結(jié)構(gòu)的變化

細(xì)胞自噬是由液泡或溶酶體介導(dǎo)來降解細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的基本生理代謝過程。在植物中細(xì)胞自噬分為兩類：一類是微自噬，是溶酶體或液泡膜直接內(nèi)陷包裹并降解底物；另一類是巨自噬，是雙層膜結(jié)構(gòu)包裹底物，隨后與溶酶體融合形成自噬溶酶體（autolysosome），或者與液泡融合形成自噬小體（autophagic body）[9]。本研究中，煙草葉肉細(xì)胞對(duì)TMV病毒侵染發(fā)生響應(yīng)，除了葉綠體和線粒體發(fā)生變化外，葉肉細(xì)胞也發(fā)生了細(xì)胞自噬的現(xiàn)象，而且在不同抗感材料中變化特征不同。

在感病材料K326中，出現(xiàn)了微自噬和巨自噬兩種自噬現(xiàn)象。首先，接種TMV 8 h，細(xì)胞出現(xiàn)巨自噬現(xiàn)象，圖5A箭頭所指的AV表現(xiàn)為典型的巨自噬結(jié)構(gòu)特征，如多層膜包被，位于液泡內(nèi)，直徑超過1 μm，內(nèi)含多種細(xì)胞器；圖5D中出現(xiàn)自噬溶酶體，表現(xiàn)為多泡體結(jié)構(gòu)（MVB），內(nèi)含多個(gè)電子密度低的20~80 nm小泡；TMV接種48 h，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡，液泡中還有降解的細(xì)胞器殘余體，推測(cè)是由巨自噬降解底物產(chǎn)生的（圖3I，圖5B，C，E）。其次，接種TMV 8 h，可觀察到微自噬現(xiàn)象，圖5D箭頭所指為臨近液泡產(chǎn)生的微自噬小泡，內(nèi)含一些顆粒成分；TMV接種48 h后，細(xì)胞壁渾濁，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成自噬小泡（圖5E，白色圓圈），并且細(xì)胞核也發(fā)生變化，出現(xiàn)核膜破裂，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)斷裂分離，染色質(zhì)彌散等現(xiàn)象（圖2D，圖5F）。

在抗病材料Y48中也發(fā)現(xiàn)了自噬現(xiàn)象，但與K326表現(xiàn)不相同。TMV接種8 h，無自噬現(xiàn)象。僅在TMV接種48 h，葉肉細(xì)胞出現(xiàn)向液泡融合的囊泡，內(nèi)含小泡直徑多在50~100 nm，較K326大（圖6B）。葉綠體內(nèi)部形成空泡，直徑約500 nm（圖6E）。TMV接種72 h，細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)大量直徑1~6 μm空泡，推測(cè)是自噬體或者液泡降解底物后形成的（圖6C）。Y48接種TMV 72 h與0 h相比，細(xì)胞壁亮度較低，細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)膜貼合較緊密，無微自噬小泡形成（圖6F）。另外Y48在接種TMV 8 h，葉肉細(xì)胞的線粒體發(fā)生聚集，線粒體嵴褶皺明顯，由此推測(cè)細(xì)胞呼吸作用增強(qiáng)（圖6A）。而且過氧化物酶體出現(xiàn)在葉綠體和線粒體的周圍，表明Y48細(xì)胞的活性氧代謝在接種8 h出現(xiàn)了變化（圖6D）。

注：CW，細(xì)胞壁；Ch，葉綠體；N，細(xì)胞核；MVB，多泡體；AV，自噬泡；箭頭，自噬結(jié)構(gòu)；bar=0.5 μm。

注：CW，細(xì)胞壁；Ch，葉綠體；M，線粒體；P，過氧化物酶體；箭頭，自噬結(jié)構(gòu)；bar=0.5 μm。

3 討 論

3.1 TMV侵染煙草的細(xì)胞學(xué)研究

對(duì)于病毒侵染煙草的病理學(xué)研究前人已有報(bào)道，多數(shù)研究結(jié)果是直接拍攝葉片變化，或者利用熒光顯微鏡觀察葉片的細(xì)胞變化。而在病毒潛育期，利用TEM觀察煙草葉肉細(xì)胞及其細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)變化鮮見報(bào)道。本研究利用TEM，在TMV侵染煙草葉片早期，從亞細(xì)胞水平對(duì)葉肉細(xì)胞和細(xì)胞器進(jìn)行了一系列觀察，研究結(jié)果對(duì)于病毒侵染煙草的細(xì)胞病理學(xué)研究是重要補(bǔ)充。

本研究所用的抗病材料Y48是K326的抗病毒病定向改良新品系，經(jīng)全基因組SNP分析，其與K326的遺傳背景相似率為99.71%。本研究選用這兩個(gè)抗、感材料，基本上消除了遺傳背景差異帶來的材料本身的細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異，研究結(jié)果可以真實(shí)反映受病毒侵染后，不同抗、感品種的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，為進(jìn)一步解析抗病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

3.2 煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞器變化與Y48抗性

葉綠體和線粒體是維持植物葉片功能的重要細(xì)胞器。TMV外殼蛋白（TMV-CP）可以迅速進(jìn)入寄主葉綠體中，結(jié)合在類囊體膜上，導(dǎo)致煙草發(fā)生花葉癥狀，并且TMV-CP濃度與花葉癥狀的嚴(yán)重程度正相關(guān)[17-20]。本研究觀察TMV侵染K326的病變細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)葉綠體畸形、破裂，類囊體片層變薄，不明顆粒物沉積，以及線粒體腫脹破裂等細(xì)胞器變化與已有報(bào)道的TMV侵染后煙草細(xì)胞病理變化相似。在植物體中，葉綠體蛋白也參與HR-PCD，與產(chǎn)生抗性有關(guān)。例如葉綠體的D9S蛋白具有維持膜蛋白正確折疊的功能[21]。SEO等[22]報(bào)道，在TMV侵染的葉片中，定位在類囊體上的DS9的表達(dá)下降導(dǎo)致葉綠體功能受損，并加速細(xì)胞產(chǎn)生HR-PCD。還有葉綠體NPIP1蛋白與TMV病毒解旋酶p50一起參與抗原識(shí)別[23]。在本研究中，Y48在接種TMV 4 d后產(chǎn)生大面積的枯斑，細(xì)胞器的變化與N基因介導(dǎo)的超敏反應(yīng)表現(xiàn)相似，這也許是葉綠體NPIP1基因參與Y48的抗原識(shí)別的結(jié)果。Y48在接種TMV 48~72 h之間葉肉細(xì)胞產(chǎn)生HR-PCD，葉綠體內(nèi)部類囊體片層消失，可能與葉綠體DS9表達(dá)下降有關(guān)，導(dǎo)致蛋白錯(cuò)誤折疊被降解，相關(guān)結(jié)論還在進(jìn)一步驗(yàn)證中。

3.3 細(xì)胞自噬與Y48抗性

自噬在植物與病毒互作中有雙重作用。自噬既可以促進(jìn)感染細(xì)胞清除病毒，也可以被病毒利用，促進(jìn)其在胞內(nèi)增殖[24]。劉偉等[25]研究表明，TMV-U1株系侵染亮黃煙，感病細(xì)胞在接種72 h出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。LI等[26]研究發(fā)現(xiàn)TMV侵染Hela腫瘤細(xì)胞，病毒增殖可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，隨之細(xì)胞產(chǎn)生自噬。申莉莉[27]，李方方等[28]研究表明，CMV侵染本氏煙和三生煙可誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞器降解。在本研究中，感病材料K326在TMV接種8 h時(shí)，出現(xiàn)自噬體，到接種48 h，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡，液泡中含有很多降解的細(xì)胞器。觀察結(jié)果與以往報(bào)道類似，說明TMV侵染誘發(fā)感病細(xì)胞產(chǎn)生自噬。推測(cè)K326細(xì)胞自噬的誘發(fā)原因是TMV-C株系的增殖，引起細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

植物HR-PCD在形成過程中是由凋亡和自噬兩類基因參與疊加的結(jié)果。自噬在HR-PCD形成過程中有兩種作用，一是自噬可以限制過敏性壞死發(fā)生的范圍，例如基因介導(dǎo)的HR-PCD，LIU等[5]報(bào)道在煙草中沉默自噬相關(guān)基因，不能將超敏反應(yīng)有效的抑制在病原侵染部位；二是自噬同時(shí)也是HR-PCD的執(zhí)行者，HOFIUS等[29]報(bào)道擬南芥自噬基因突變體影響TIR類型和CC類型免疫反應(yīng)引起的HR-PCD的產(chǎn)生。本研究中，Y48在接種TMV 48 h葉肉細(xì)胞有自噬現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體內(nèi)部也發(fā)生空泡化。由此推斷自噬相關(guān)基因也參與抗病材料Y48的HR-PCD過程。

3.4 活性氧代謝與Y48抗性

病原侵染可以引起細(xì)胞活性氧（ROS）代謝的增強(qiáng)[2]。過氧化物酶體能夠產(chǎn)生和清除ROS，并且該細(xì)胞器的增殖受ROS調(diào)控[30]。本研究中，接種TMV 48 h，Y48的葉綠體中積累不明顆粒物質(zhì)相對(duì)K326少，同時(shí)葉綠體畸形程度輕，推測(cè)病毒在Y48細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制受到抑制。對(duì)比接種TMV 8 h，過氧化物酶體在Y48的細(xì)胞中頻繁出現(xiàn)，且緊鄰線粒體和葉綠體，推測(cè)可能是細(xì)胞對(duì)ROS的調(diào)控出現(xiàn)變化所致。ROS水平的變化或許是Y48細(xì)胞內(nèi)TMV增殖受抑制，病程延緩的原因。

綜上所述，本研究利用TEM技術(shù)，對(duì)比感病品種K326與抗病品系Y48在TMV侵染后，葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的一系列變化。從細(xì)胞水平揭示新品系Y48對(duì)TMV表現(xiàn)抗性的細(xì)胞學(xué)證據(jù)，為進(jìn)一步從分子水平解析Y48的抗病機(jī)制提供理論支撐，同時(shí)為新品系Y48的推廣利用和作為突破性基礎(chǔ)材料的育種利用提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

感病品種K326和抗病品系Y48的葉肉細(xì)胞，在TMV侵染早期，超微結(jié)構(gòu)變化有差異。K326葉肉細(xì)胞在接種24 h后已經(jīng)發(fā)生明顯變化；72 h后細(xì)胞病理性壞死。而Y48在接種48 h后細(xì)胞結(jié)構(gòu)才發(fā)生輕微變化，72 h后細(xì)胞原生質(zhì)體凝集、細(xì)胞器降解。表明Y48可延緩發(fā)病，并通過啟動(dòng)細(xì)胞HR-PCD，產(chǎn)生抗性，抗病過程可能與細(xì)胞自噬有關(guān)。

[1] 許石劍，肖炳光，李永平. 煙草抗TMV育種研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（16）：91-94.

XU S J, XIAO B G, LI Y P. Progress on TMV resistant breeding of tobacco[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2009, 25(16): 91-94.

[2] 董金皋，康振生，周雪平. 植物病理學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2016.

DONG J G, KANG Z S, ZHOU X P. Plant pathology[M]. Beijing: Science Press, 2016.

[3] 張仲凱，方琦，丁銘，等. 煙草主要病毒病的細(xì)胞病理研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999（S1）：12-15.

ZHANG Z K, FANG Q, DING M, et al. The cytopathalogy of manin tobacco virus diseases[J]. Journal of Yunnan University, 1999(S1): 12-15.

[4] ERICKSON F L, HOLZBERG S, CALDERONURREA A, et al. The helicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defence response in tobacco[J]. Plant Journal, 1999, 18(1): 67-75.

[5] LIU Y, SCHIFF M, CZYMMEK K, et al. Autophagy regulates programmed cell death during the plant innate immune response[J]. Cell, 2005, 121(4): 567-577.

[6] 潘耀謙，高豐，成軍. 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死比較的研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2000（4）：5-8.

PAN Y Q, GAO F, CHENG J. Research progress between apoptosis and cellular nectosis[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2000(4): 5-8.

[7] 夏啟中，吳家和，張獻(xiàn)龍. 與植物超敏反應(yīng)（HR）相關(guān)的細(xì)胞編程性死亡[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（1）：97-103.

XIA Q Z, WU J H, ZHANG X L. Review on hypersensitive response-related PCD in plant[J]. Journal of Huazhong Agricultural, 2005, 24(1): 97-103.

[8] 蔣麗，孔瑩瑩，韓凝，等. 植物細(xì)胞程序性死亡的分類和膜通透性調(diào)控蛋白研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2012，48（5）：419-424.

JIANG L, KONG Y Y, HAN N, et al. Progress in the classification of plant programmed cell death and the regulatory protein for membrane permeabilization[J]. Plant Physiology Journal, 2012, 48(5): 419-424.

[9] 黃曉，李發(fā)強(qiáng). 細(xì)胞自噬在植物細(xì)胞程序性死亡中的作用[J]. 植物學(xué)報(bào)，2016，51（6）：859-862.

HUANG X, LI F Q. Roles of autophagy in plant programmed cell death[J]. Chinese Bulletin of Botany, 2016, 51(6): 859-862.

[10] 孔瓊，楊紅玉，王云月，等. 植物與病原物互作中的細(xì)胞程序化死亡[J]. 植物保護(hù)，2012，38（6）：1-6.

KONG Q, YANG H Y, WANG Y Y, et al. Programmed cell death in plant-pathogen interactions[J]. Plant Protection, 2012, 38(6): 1-6.

[11] 黃立鈺，傅彬英. 植物細(xì)胞程序化死亡響應(yīng)非生物逆境脅迫反應(yīng)機(jī)理[J]. 分子植物育種，2010，8（4）：764-770.

HUANG L Y, FU B Y. Mechanism of programmed cell death(PCD) responding to abiotic stresses in plant[J]. Molecular Plant Breeding, 2010, 8(4): 764-770.

[12] MITTLER R, SIMON L, LAM E. Pathogen-induced programmed cell death in tobacco[J]. Journal of Cell Science, 1997, 110(11): 1333-1344.

[13] REAPE T J, MCCABE P F. Apoptotic-like programmed cell death in plants[J]. New Phytologist, 2008, 180(1): 13-26.

[14] 陳小翠，代帥帥，張興偉，等. 烤煙CMV抗性的主基因+多基因混合遺傳模型分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2014，15（6）：1278-1286.

CHEN X C, DAI S S, ZHANG X W, et al. Mixed major-gene plus polygenes inheritance analysis for cmv disease resistance in flue-cured tobacco[J]. Journal of Plant Genetic Resources, 2014, 15(6): 1278-1286.

[15] 任廣偉，孔凡玉，王鳳龍，等. 全國煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法 GB/T 23222—2008[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008：2-3.

REN G W, KONG F Y, WANG F L, et al. Grade and investigation method of tobacco diseases and insect pests. GB/T 23222—2008[S]. Beijing: Standards Press of China, 2008: 2-3.

[16] 王春梅，施定基，朱水芳，等. 黃瓜花葉病毒對(duì)煙草葉片和葉綠體光合活性的影響[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，42（4）：388-392.

WANG C M, SHI D J, ZHU S F, et al. Effects of cucumber mosaic virus infection of photosynthetic activities of tobacco leaves and chloroplasts[J]. Acta Botanica Sinica, 2000, 42(4): 388-392.

[17] 於春. 植物病毒衣殼蛋白進(jìn)入葉綠體的離體跨膜運(yùn)輸研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

YU C. Study on import of plant virus coat protein into intact chloroplasts through membrane in vitro[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2008.

[18] BANERJEE N. Import of tobacco mosaic virus coat protein into intact chloroplasts in vitro[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 1992, 5(6): 466.

[19] REINERO A, BEACHY R N. Association of TMV coat protein with chloroplast membranes in virus-infected leaves[J]. Plant Molecular Biology, 1986, 6(5): 291-301.

[20] BEACHY R N. Reduced photosystem II activity and accumulation of viral coat protein in chloroplasts of leaves infected with tobacco mosaic virus[J]. Plant Physiology, 1989, 89(1): 111.

[21] 趙瑞杰，李引乾，王會(huì)，等. Caspase家族與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J]. 中國畜牧雜志，2010，46（17）：73-78.

ZHAO R J, LI Y Q, WANG H, et al. Relationship of caspase family and apoptosis[J]. Chinese Journal of Animal Science, 2010. 46(17): 73-78.

[22] SEO S, OKAMOTO M, IWAI T, et al. Reduced levels of chloroplast FtsH protein in tobacco mosaic virus-infected tobacco leaves accelerate the hypersensitive reaction[J]. Plant Cell, 2000, 12(6): 917-932.

[23] CAPLAN J L, MAMILLAPALLI P, BURCH-SMITH T M, et al. Chloroplastic protein NRIP1 mediates innate immune receptor recognition of a viral effector[J]. Cell, 2008, 132(3): 449.

[24] JACKSON W T. Viruses and the autophagy pathway[J]. Virology, 2015, 480: 450-456.

[25] 劉偉，李方方，孫航軍，等. TMV侵染煙草誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生細(xì)胞自噬[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2016，46（6）：759-766.

LIU W, LI F F, SUN H J, et al. Tobacco mosaic virus infection on tobacco plants induces autophagy[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2016, 46(6): 759-766.

[26] LI L, WANG L, XIAO R, et al. The invasion of tobacco mosaic virus RNA induces endoplasmic reticulum stress-related autophagy in HeLa cells[J]. Bioscience Reports, 2012, 32(Pt 2): 171.

[27] 申莉莉. CMV誘導(dǎo)煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及調(diào)控因子NbbZIP28的研究[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

SHEN L L. Endoplasmic reticulum stress induced by CMV and research on the regulator NbbZIP28 in Nicotiana[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2017.

[28] 李方方，申莉莉. 植物病毒侵染誘導(dǎo)寄主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[J]. 中國煙草科學(xué)，2016，37（6）：95-100.

LI F F, SHEN L L. Endoplasmic reticulum stress induced by plant viral infection[J]. Chinese Tobacco Science, 2016, 37(6): 95-100.

[29] HOFIUS D, SCHULTZLARSEN T, JOENSEN J, et al. Autophagic components contribute to hypersensitive cell death in Arabidopsis[J]. Cell, 2009, 137(4): 773-783.

[30] 崔慧萍，周薇，郭長(zhǎng)虹. 植物過氧化物酶體在活性氧信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的作用[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2017，33（3）：220-226.

CUI H P, ZHOU W, GUO C H. The role of plant peroxisomes in ROS signalling network[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2017, 33(3): 220-226.

Analysis of Cytological Mechanism of TMV Resistance in the Novel Anti-Viral Disease Variety Y48 Developed from K326

WEN Liuying, LIU Dan, GONG Min, MA Bing, SHEN Lili, LUO Chenggang, REN Min, CHENG Lirui, JIANG Caihong, YANG Aiguo*

(Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Gene Resources, Qingdao 266101, China)

A new variety with genetic improvement of K326 (Y48) has great market potential. Y48 was developed by marker-assisted selection for its high anti-TMV & CMV ability with the same agronomic traits. In order to reveal the cytological mechanism of the Y48 resistance, transmission electronic microscopy (TEM) was use to observe the ultrastructure of K326 and Y48 leaves in 0-72 h after TMV inoculation. The results showed that, in K326, chloroplast thylakoid lamellae decreased, mitochondria crista expanded, and autophagy appeared in mesophyll cells at 24 h after TMV inoculation. The chloroplasts and mitochondria were completely destroyed by TMV, then mesophyll cells went through pathological necrosis at 72 h after inoculation. While in Y48, a small amount of particles were deposited inside the chloroplast, the mitochondria cristae degraded, and the degraded-like vesicles appeared in mesophyll cells at 48 h after TMV inoculation. Chloroplasts and mitochondria were degraded totally, cytoplasm was concentrated, mesophyll cells went through programmed cell death (PCD) at 72 h after inoculation. The results indicated that, compared to K326, Y48 could delay TMV infection and activate hypersensitivity response to lead mesophyll cell to go through HR-PCD. Add，the present of peroxisome in Y48 at 72 h agter inoculation, might effect ROS level of cell. The two differences might provide cytological evidence to reveal the Y48 resistance and give the clue to analyze the molecular resistance mechanism of Y48.

tobacco mosaic virus (TMV); transmission electronic microscopy (TEM); ultrastructure; hypersensitivity response(HR); programmed cell death (PCD)

S572.03

1007-5119（2018）04-0018-08

10.13496/j.issn.1007-5119.2018.04.003

中國煙草總公司重大專項(xiàng)項(xiàng)目“以K326為主要底盤品種的煙草全基因組模塊構(gòu)建”(110201601028JY-02）；中國煙草總公司重大專項(xiàng)項(xiàng)目“煙草抗CMV和赤星病連鎖分子標(biāo)記開發(fā)及NC82、K326品種抗性改良”（110201301009，JY-09）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)“CMV病毒侵染煙草葉片過程的電鏡樣品制備技術(shù)研究”（1610232016015）

文柳瓔（1983-），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)闊煵葸z傳育種。E-mail：wenliuying@caas.cn。

，E-mail：yangaiguo@caas.cn

2018-02-26

2018-05-21