環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用

杜偉勤 薛婷 王桂琴

[摘要]目的 建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）檢測(cè)肺結(jié)核患者痰液中的結(jié)核分枝桿菌（MTB）基因。方法 以結(jié)核分枝桿菌高度保守的16S rDNA為靶基因設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，收集2017年1～12月臨床確診的肺結(jié)核患者痰液89份，非肺結(jié)核患者痰液20份以及MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株（H37RV），建立LAMP方法，并檢測(cè)其特異性、靈敏性，以MTB培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，用SPSS13.0數(shù)據(jù)處理并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 成功建立LAMP檢測(cè)痰液中MTB的方法，其特異性為100%，靈敏性為50 copies。在臨床患者痰液檢測(cè)中，特異性和靈敏性分別為85.00%、96.63%，與MTB培養(yǎng)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 LAMP檢測(cè)MTB特異性和靈敏度高，適用于基層醫(yī)療單位MTB的快速檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；結(jié)核分枝桿菌；檢驗(yàn)

[中圖分類號(hào)] R939.121 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）5（c）-0123-04

Application of loop-mediated isothermal amplification for the detection of mycobacterium tuberculosis

DU Wei-qin1 XUE Ting2 WANG Gui-qin1▲

1.Education and Research Office of Microbiology and Immunology，Shanxi Medical University of Taiyuan City，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China；2.Department of Clinical Laboratory，People′s Hospital of Lvliang City，Shanxi Province，Lvliang 033000，China

[Abstract]Objective To establish the loop-mediated isothermal amplification technique （LAMP） for the detection of Mycobacterium tuberculosis （MTB） gene in the sputum of patients with pulmonary tuberculosis.Methods Three pairs of specific primers were designed based on highly conserved 16S rDNA of MTB as the target gene.From January 2017 to December 2017，89 sputum samples from the patients were with clinically diagnosed pulmonary tuberculosis，20 sputum samples from non-tuberculosis patients and the MTB standard strain （H37RV） were collected.LAMP method was established，and its specificity and sensitivity were tested.The MTB culture results were taken as the gold standard.SPSS13.0 was used for data processing and statistical analysis.Results LAMP was successfully established for the detection of MTB in the sputum.Its specificity was 100% and its sensitivity was 50 copies.In the clinical sputum testing，the specificity and sensitivity were 85% and 96.63% respectively.The results were almost identical with those of the MTB culture，the difference was statistically significant （P>0.05）.Conclusion LAMP has high specificity and high sensitivity in the detection of MTB，which is suitable for the rapid detection of MTB in primary medical institutions.

[Key words]Loop-mediated isothermal amplification；Mycobacterium tuberculosis；Test

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是一種生長(zhǎng)緩慢、通過飛沫經(jīng)呼吸道傳播引起人類結(jié)核病的病原菌。世界衛(wèi)生組織（WHO）2017年的報(bào)告[1]指出，結(jié)核病仍然是全球頭號(hào)傳染病，雖然近年來抗結(jié)核進(jìn)展顯著，但形勢(shì)依然嚴(yán)峻。2016年我國新增結(jié)核病人89.5萬，報(bào)告病例78.3萬例。根據(jù)《中華醫(yī)學(xué)會(huì).結(jié)核病分冊(cè)》對(duì)結(jié)核病診斷的規(guī)定，其診斷方法包括病原學(xué)、免疫學(xué)、放射學(xué)、組織學(xué)、分子生物學(xué)診斷等，其中病原學(xué)診斷是結(jié)核病的診斷金標(biāo)準(zhǔn)。但MTB痰涂片檢出率低，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，不利于早期診斷和預(yù)防治療。WHO推薦的PCR法或快速液體培養(yǎng)法需要昂貴設(shè)備和嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件，廣大基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室條件尚不能滿足此類方法的開展。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）為一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法。這種方法是通過BstDNA鏈置換聚合酶對(duì)目的基因的6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)的3對(duì)引物（內(nèi)引物、外引物、環(huán)引物）在60～65℃恒溫條件下1 h內(nèi)進(jìn)行109～1010倍擴(kuò)增[2-3]。由于其特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效率高，不需要昂貴設(shè)備等多方面的優(yōu)勢(shì)備受人們的關(guān)注。本研究應(yīng)用LAMP檢測(cè)方法對(duì)臨床樣本中的MTB 16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，為其在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)中應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 本實(shí)驗(yàn)使用的標(biāo)本均來源于呂梁市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科2017年1～12月收集的標(biāo)本共89例。提供標(biāo)本的患者均經(jīng)痰涂片和胸片檢查診斷為結(jié)核病。另外收集醫(yī)院非結(jié)核患者標(biāo)本的痰液20份，作為陰性對(duì)照。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽訂《知情同意書》。MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV由呂梁市疾控中心惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑與儀器 羅琴培養(yǎng)基（珠海貝索生物科技有限公司），甜菜堿（Sigma公司），Bst大片段DNA聚合酶（NEB公司），DNA Marker， dNTP （大連寶生物工程有限公司），SYBR GreenⅠ（Thermo fisher公司），結(jié)核分枝桿菌核酸試劑盒（中山大學(xué)迪安基因有限公司），恒溫水浴箱（上海精密儀器儀表有限公司），UVP凝膠成像系統(tǒng)（美國BioSpectrum公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)及DNA模板的制備 將痰液分為兩份。一份接種于羅琴培養(yǎng)基上；另一份用4%的NaOH污染。按照MTB核酸檢測(cè)試劑盒說明書提取DNA。

1.2.2 LAMP試驗(yàn)引物 本研究中所用引物是針對(duì)MTB 16S rDNA設(shè)計(jì)3對(duì)引物，引物序列參考Pandey等[4]報(bào)道。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 25 μlLAMP 體系包括：外引物（F3和B3）各 0.2 μmol/L，內(nèi)引物（FIP和BIP）各 1.6 μmol/L，甜菜堿1.6 mol/L，6 mmol/L Mg2SO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U Bst DNA 聚合酶 1 μl、2.5×的buffer，2 μl 模板 DNA。將反應(yīng)管置于62℃恒溫水浴箱內(nèi)反應(yīng) 1 h后，于80℃ 10 min終止反應(yīng)。

1.2.4 LAMP檢測(cè)的特異度 以MTB H37RV為陽性對(duì)照，以滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照，以從臨床非結(jié)核病患者中分離的肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。分別取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，于2%瓊脂糖凝膠中電泳后，UVP拍照，出現(xiàn)LAMP 特征性梯狀條帶為陽性結(jié)果，無梯狀條帶為陰性結(jié)果。

1.2.5 LAMP反應(yīng)的靈敏度 NanoDrop超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)H37RV的DNA定量測(cè)定，雙蒸水調(diào)整濃度至1×108/ul，倍比稀釋，以稀釋后梯度DNA為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.2.6 LAMP的臨床評(píng)價(jià) 對(duì)臨床收集的89 例MTB患者的痰液DNA和20例非結(jié)核病患者的痰液DNA進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增，將LAMP擴(kuò)增結(jié)果與羅琴培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行一致性比較。一致性評(píng)價(jià)：Kappa值0.00～0.40為一致性較差，0.41～0.60為一致性一般，0.61～0.80為一致性較高，0.81～1.00為幾乎完全一致。

2結(jié)果

2.1 LAMP的特異性

用LAMP檢測(cè)MTB H37RV與其他非結(jié)核病肺炎患者的痰液結(jié)果如圖1所示，可以看出，只有H37RV有梯度條帶出現(xiàn)，其他菌株未出現(xiàn)梯度條帶。綜上此方法在MTB 檢測(cè)中具有高度特異性。

2.2 LAMP的靈敏度

將提取的MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA進(jìn)行倍比稀釋，用LAMP進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。 從圖可知，電泳后的產(chǎn)物呈階梯狀條帶，在第8泳道仍可顯現(xiàn)，說明LAMP的檢測(cè)限為50 copies。

2.3 LAMP檢測(cè)臨床標(biāo)本的部分結(jié)果

LAMP檢測(cè)臨床結(jié)核陽性標(biāo)本的部分結(jié)果（圖3），其中7號(hào)和10號(hào)未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶?？梢曅詸z測(cè)結(jié)果（圖4）所示：反應(yīng)管內(nèi)液體綠色為陽性，橙色為陰性。

2.4 LAMP的臨床評(píng)價(jià)

對(duì)臨床收集的89 例 MTB患者的痰液DNA和20例非結(jié)核病患者的痰液 DNA進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增，將LAMP擴(kuò)增結(jié)果與羅琴培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行一致性比較，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，特異性和靈敏性分別為85.00%、96.63%，對(duì)這兩種方法經(jīng)一致性檢驗(yàn)后比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），由 Kappa值=0.82可知，兩種方法的一致性良好。

3討論

LAMP技術(shù)自2000年日本人發(fā)明以來，己經(jīng)在許多領(lǐng)域得到了很好的發(fā)展，如大腸桿菌[5]、沙門菌[6]、金黃色葡萄球菌[7]、螺旋體[8]、支原體[9]、病毒[10-11]等病原生物體的檢測(cè)文獻(xiàn)相繼被報(bào)道。據(jù)國內(nèi)學(xué)者胡宗悅報(bào)道[12]，在PubMed上發(fā)表的關(guān)于LAMP的文獻(xiàn)約有1622篇，在CNKI上約為4220篇，可以看出LAMP檢測(cè)技術(shù)已成為一種工具，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、動(dòng)植物、基礎(chǔ)、食品水產(chǎn)和環(huán)境等方面。與其他技術(shù)相比，LAMP檢測(cè)技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：①LAMP檢測(cè)技術(shù)不像PCR需要變性、退火和延伸等步驟對(duì)溫度的精確控制，只用一臺(tái)恒溫水浴箱即可完成實(shí)驗(yàn)，所用設(shè)備廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單；②LAMP檢測(cè)技術(shù)針對(duì)靶基因設(shè)計(jì) 4 條引物，再增加2條外引物，可使得其擴(kuò)增時(shí)間縮短到1 h內(nèi)，極大地提高了擴(kuò)增效率；③在LAMP 擴(kuò)增過程中產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，可與SYBR GreenⅠ發(fā)生顯色反應(yīng)[13]，可通過觀察反應(yīng)體系顏色變化來快速判斷產(chǎn)物的生成。