紫莖澤蘭殺螨噴劑的制備及其臨床效果評(píng)價(jià)

翁嘉華，石 真，胡延春，胡力文，符 杰，左之才，彭廣能，鄧俊良

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130）

紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）作為被我國(guó)環(huán)?？偩执_定為最重要的16種外來(lái)入侵生物之一的植物[1]，自20世紀(jì)40年代入侵中國(guó)以來(lái)，其每年能造成巨大的生態(tài)災(zāi)難以及經(jīng)濟(jì)損失[2]，現(xiàn)在仍以每年60 km的速度向北和向東蔓延。然而研究表明紫莖澤蘭具有很好的殺螨作用[3-5]，對(duì)牛螨[6]、兔螨[7-8]以及動(dòng)物疥螨都具有很明顯的控制作用。

螨蟲(chóng)病作為一種表皮寄生蟲(chóng)病，具有接觸傳染性，其一般先在嘴、鼻孔、眼周以及腳爪部發(fā)生病變，然后向四肢、頭腹部等其他部位擴(kuò)展[9]，使動(dòng)物產(chǎn)生表皮瘙癢、抓撓、長(zhǎng)痂皮等特征，感染嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良，機(jī)體功能下降，更有甚者會(huì)出現(xiàn)死亡。目前常用的治療螨蟲(chóng)的藥物有伊維菌素、雙甲脒、天然除蟲(chóng)菊酯等。董艷芳等[10]利用伊維菌素治療兔螨蟲(chóng)病，取得顯著的效果。近年研究表明長(zhǎng)期使用此類(lèi)藥物會(huì)造成動(dòng)物中毒，產(chǎn)生耐藥性，并可能造成藥物殘留以及環(huán)境污染[11-12]。所以低毒高效無(wú)殘留的殺螨劑對(duì)于螨蟲(chóng)的防治以及環(huán)境保護(hù)具有深刻的意義。本試驗(yàn)將具有殺螨活性的紫莖澤蘭提取物制備成殺螨噴劑，并對(duì)其臨床殺螨效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為紫莖澤蘭的功能開(kāi)發(fā)以及市場(chǎng)應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用紫莖澤蘭均于2016年7月采自四川省涼山州。采集生長(zhǎng)健康茂盛的植株，放置于室內(nèi)或者沒(méi)有太陽(yáng)的地方陰干，并在干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：HC-280T2型中藥粉碎機(jī)（永康市綠可食品機(jī)械有限公司）、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（上海宜宣儀器紗篩廠）、1260型高效液相色譜儀（Agilent Technologies）、JJ-1型增力電動(dòng)攪拌器（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、R201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英裕高科技儀器廠），CP2245型電子分析天平（Sariorius）。

主要試劑：乙醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠）、聚山梨酯-80（分析純，四川西隴化工有限公司）、月桂氮酮（分析純，鄭州津北化工有限公司）、甲醇（分析純，天津市光復(fù)科技有限公司）、乙酸乙酯（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

1.3 紫莖澤蘭浸膏的制備

將風(fēng)干的紫莖澤蘭用中藥粉碎機(jī)粉碎為粉末，然后過(guò)40目篩去除大顆粒殘?jiān)?。加入甲醇浸泡過(guò)夜，重復(fù)浸泡3次，合并濾液，過(guò)濾，減壓蒸干。將得到的浸膏用萃取液（甲醇∶乙酸乙酯∶水=1∶5∶4）萃取，收集上層有機(jī)相，減壓蒸干。稱(chēng)取一定量的浸膏，乙醇溶解，在40℃條件下加入粉末狀活性炭吸附脫色，過(guò)濾，再次減壓蒸干，-20℃條件下保存浸膏。

1.4 正交設(shè)計(jì)

紫莖澤蘭噴劑的制備過(guò)程主要是將紫莖澤蘭浸膏用一定比例的乳化劑、助溶劑以及透皮劑等溶解，并稀釋即可。經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)篩選，本試驗(yàn)主要選擇的乳化劑為聚山梨酯-80，助溶劑為乙醇，透皮劑為月桂氮酮。本試驗(yàn)主要考察以上3個(gè)因素，各取3個(gè)水平（見(jiàn)表1）進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，并以9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的透皮釋放率作為考察指標(biāo)，篩選出最佳配方比例。

表1 因素水平表Table1 Factor level table

1.5 透皮釋放試驗(yàn)

參考金偉等[13]的方法。將透析袋剪成小段，在2%碳酸氫鈉和1 mmol/L EDTA混合液（體積比1∶1，pH=8）中煮沸10 min，用蒸餾水徹底洗凈，并將其剪成單層，放入1 mmol/L的EDTA（pH=8）中煮沸10 min。冷卻后，存放于4℃冰箱中。將處理好的透析膜固定于改良的Franz擴(kuò)散池上，加入制備好的噴劑，接收池內(nèi)加入生理鹽水作為擴(kuò)散介質(zhì)。透皮試驗(yàn)裝置設(shè)置為恒溫37℃[14]、轉(zhuǎn)速200 r/min，分別于2、4、8、12、24 h 取樣 3 mL，同時(shí)補(bǔ)足同等溫度的生理鹽水。將取出的接收液保存，并用HPLC法測(cè)定其中9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的濃度。根據(jù)公式Q=（VCn+∑ViCi)/A，24 h 內(nèi)累積透過(guò)率=（Q24×A/樣品總量）×100%。其中Q為第n次取樣時(shí)的累積透皮釋放量，V為接受池的體積（mL），Cn為第n次取樣點(diǎn)的濃度（μg/mL），Vi為第 i次取樣的體積（mL），Ci為第i次取樣點(diǎn)的濃度（μg/mL），A為擴(kuò)散釋放面積（cm2）。

1.6 紫莖澤蘭殺螨噴劑的臨床殺螨效果評(píng)價(jià)

30只疥螨感染情況相近的新西蘭白兔，體重（2.35±0.13）kg，公母各半，隨機(jī)分為 5組，即空白對(duì)照組Ⅰ（蒸餾水）、陽(yáng)性對(duì)照組Ⅱ（伊維菌素）以及高中低劑量組（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ：8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL），每組6只，分籠飼養(yǎng)，自由采食，飲水。陽(yáng)性對(duì)照組每周肌肉注射1次，持續(xù)兩周；空白對(duì)照與試驗(yàn)組每?jī)商鞂?duì)患病部位噴灑藥液1次，用藥兩周。每周對(duì)其臨床癥狀進(jìn)行評(píng)分，癥狀評(píng)分表見(jiàn)表2。同時(shí)每周對(duì)每只兔子進(jìn)行體重、呼吸、心率以及體溫等進(jìn)行測(cè)定。并對(duì)精神狀態(tài)，糞便進(jìn)行觀察，為期4周。

表2 癥狀評(píng)分表Table2 Symptom score

1.7 數(shù)據(jù)分析

將所得的數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)間采用單因素（One-Way ANOVA）分析，以P＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)所測(cè)得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設(shè)計(jì)結(jié)果

由表3、表4 可知，RA＞RC＞RB，即聚山梨酯-80的用量對(duì)透皮結(jié)果影響效果最大，乙醇的用量次之，最后是月桂氮酮的用量。由表4可知聚山梨酯-80對(duì)透皮結(jié)果的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他因素則無(wú)顯著影響，說(shuō)明聚山梨酯-80是關(guān)鍵因素。綜合預(yù)試驗(yàn)以及從節(jié)約成本考慮，最終確定最佳處方為 A2B2C1，即 3%的聚山梨酯-80（V/V)、2%的月桂氮酮（V/V）、20%的乙醇（V/V）。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table3 The results of orthogonal test

表4 方差分析表Table4 ANOVA table

2.2 臨床效果評(píng)價(jià)

2.2.1 評(píng)分變化

由表5可知，試驗(yàn)期間，Ⅰ組的癥狀基本沒(méi)有好轉(zhuǎn)，隨著時(shí)間的遷移，評(píng)分愈加嚴(yán)重，第28天對(duì)照組新西蘭白兔癥狀達(dá)到最嚴(yán)重的狀態(tài)。Ⅱ組在第7天開(kāi)始，癥狀明顯減退，評(píng)分與Ⅰ組差異顯著（P＜0.05），自第14天起，癥狀幾乎消失，評(píng)分接近為0；Ⅲ～V 組在第 7天開(kāi)始，癥狀顯著降低（P＜0.05），第21天各紫莖澤蘭噴劑組癥狀評(píng)分已幾乎為0。

2.2.2 體重變化

由表6可知，Ⅱ組新西蘭白兔體重隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增長(zhǎng)，維持正常生長(zhǎng)發(fā)育，整個(gè)試驗(yàn)期間平均增重0.37 kg；Ⅰ組新西蘭白兔體重隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，并在第21天顯著低于Ⅱ組平均體重（P＜0.05），整個(gè)試驗(yàn)期間呈負(fù)增重（-0.34±0.13）kg；Ⅲ組新西蘭白兔體重整體變化趨勢(shì)為先降低后增加，自第21天起，Ⅲ組新西蘭白兔體重出現(xiàn)緩慢增加的現(xiàn)象，整個(gè)試驗(yàn)期間平均增重0.07 kg；Ⅳ組以及Ⅴ組新西蘭白兔體重整體變化趨勢(shì)為緩慢增加，與Ⅱ組相比無(wú)差異性（P＞0.05），最終平均增重分別為 0.38 kg和 0.32 kg。

表5 用藥后癥狀評(píng)分Table5 Symptom score after treatment

2.2.3 呼吸頻率變化

由表7可知，試驗(yàn)期間，Ⅱ組新西蘭白兔呼吸頻率基本維持在正常范圍。與Ⅱ組相比，Ⅰ組新西蘭白兔呼吸頻率在第21天出現(xiàn)降低的趨勢(shì)（P＜0.1），在第28天，呼吸頻率顯著降低（P＜0.05）；與Ⅱ組相比，除了Ⅴ組在第21天呼吸頻率有增加的趨勢(shì)（P＜0.1）外，Ⅲ組、Ⅳ組以及Ⅴ組新西蘭白兔呼吸頻率均不存在顯著性差異，維持在正常范圍內(nèi)。

2.2.4 心率變化

由表8可知，與其他各組相比，Ⅰ組新西蘭白兔心率在第28天出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。Ⅱ組與試驗(yàn)組新西蘭白兔心率基本維持在正常范圍，無(wú)變化。

2.2.5 體溫變化

由表9可知，試驗(yàn)期間，Ⅱ組與試驗(yàn)組新西蘭白兔體溫?zé)o顯著性變化，均在正常范圍內(nèi)；Ⅰ組新西蘭白兔體溫在第21天出現(xiàn)升高趨勢(shì)（P＜0.1），并于第28天出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

2.2.6 精神狀態(tài)以及糞便變化

試驗(yàn)期間，所有新西蘭白兔的糞便皆為成型顆粒狀，無(wú)任何坨狀與糊狀等不規(guī)則狀態(tài)。試驗(yàn)初期，所有患病新西蘭白兔除身上有瘙癢，不時(shí)抓撓自己外，精神狀態(tài)飽滿(mǎn)，無(wú)異常。第14天開(kāi)始，Ⅰ組出現(xiàn)精神不振，食欲減退現(xiàn)象，身上瘙癢加劇，而Ⅱ組與試驗(yàn)組瘙癢明顯減輕，且精神狀態(tài)依舊正常。從第21天開(kāi)始起，Ⅰ組出現(xiàn)伏地不愿走動(dòng)現(xiàn)象，而Ⅱ組與試驗(yàn)組癥狀精神飽滿(mǎn)，瘙癢癥狀消失。

表6 用藥前后體重變化Table6 Weight changes after treatment kg

表7 用藥后呼吸頻率變化Table7 Changes of respiratory amplitude after treatmenttimes·min-1

表8 用藥后心率變化Table8 Changes of heart rate after treatment times·min-1

表9 用藥后體溫變化Table9 Temperature changes after treatment℃

3 討論

噴霧劑直接作用于患病部位，藥物吸收快，吸收率高，藥效迅速。較內(nèi)服給藥或者注射用藥更加有效且安全，可避免藥物對(duì)胃腸道的不良刺激，同時(shí)也能避免肝、胃、腸道對(duì)于藥物的代謝降解作用，對(duì)機(jī)體的傷害更小。對(duì)于皮膚性疾患，噴霧劑是首要的給藥方式。

透皮釋放試驗(yàn)中選擇透析膜而非常見(jiàn)的離體鼠皮，主要是考慮到鼠皮制作中存在雜質(zhì)排除不干凈且制作不統(tǒng)一的因素，以及離體鼠皮長(zhǎng)時(shí)間與接收液接觸后，其皮膚中的蛋白質(zhì)會(huì)出現(xiàn)脫落溶解等現(xiàn)象，這會(huì)導(dǎo)致接受液渾濁并干擾含量測(cè)定，而噴劑中主要活性成分含量較低，因此本試驗(yàn)選擇規(guī)格統(tǒng)一的透析膜[15]。這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果中僅聚山梨酯-80的用量對(duì)透皮吸收結(jié)果影響顯著或許有關(guān)系。

在第14天之前，Ⅲ組的體重呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并自第14天開(kāi)始與Ⅱ組呈現(xiàn)顯著差異，可能是Ⅲ組濃度偏高，在殺滅螨蟲(chóng)的同時(shí)，過(guò)多的藥物殘留對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生了不利影響，阻止了新西蘭白兔體重的增加，這可能與第21天Ⅲ組依然表現(xiàn)出輕微癥狀有關(guān)。第21天開(kāi)始，Ⅲ組體重呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，說(shuō)明Ⅲ組患病新西蘭白兔正逐漸恢復(fù)健康。然而尚不明確Ⅲ組高濃度紫莖澤蘭噴劑是否引起新西蘭白兔中毒，下一步有必要進(jìn)行紫莖澤蘭殺螨噴劑的毒性試驗(yàn)研究。Ⅴ組的患病新西蘭白兔的呼吸頻率在第21天出現(xiàn)加快的趨勢(shì)，同時(shí)有體溫降低的趨勢(shì)，或許這與劑量偏低有關(guān)系。陳偉紅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，山羊食用不同劑量的紫莖澤蘭，在精神狀態(tài)，糞便以及體重與體溫等方面會(huì)出現(xiàn)顯著變化，而本試驗(yàn)中試驗(yàn)組新西蘭白兔未出現(xiàn)以上報(bào)道現(xiàn)象，可能與給藥途徑、濃度與試驗(yàn)時(shí)間不同有關(guān)。

研究表明疥螨病能夠造成家兔體重下降[17]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符。Nong X.等[18]研究表明，0.5 g/mL的紫莖澤蘭乙醇提取物對(duì)兔疥螨與兔癢螨具有明顯的控制作用，本試驗(yàn)中紫莖澤蘭殺螨噴劑的主要提取物濃度遠(yuǎn)低于此濃度，同樣達(dá)到了顯著的臨床殺螨效果，原因在于本試驗(yàn)用藥頻次更高，同時(shí)加入透皮劑能夠更大效率提高活性物質(zhì)的利用率。郭于瑜等[19]研究發(fā)現(xiàn)家兔食用紫莖澤蘭，會(huì)導(dǎo)致慢性中毒，考慮到紫莖澤蘭的毒副作用，試驗(yàn)建議臨床用藥濃度為4 mg/mL。He Y.J.等[20-21]研究表明紫莖澤蘭對(duì)山羊具有肝腎毒性，本試驗(yàn)未涉及此內(nèi)容，所以下一步有必要對(duì)于紫莖澤蘭殺螨噴劑的肝腎毒性，以及臨床應(yīng)用的安全性作出系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

紫莖澤蘭作為入侵植物，其在防治方面的研究進(jìn)展并不太順利，目前越來(lái)越多的轉(zhuǎn)向紫莖澤蘭的利用方向開(kāi)始研究[22-25]。我國(guó)自古就有開(kāi)發(fā)有毒植物藥用價(jià)值的傳統(tǒng)，如利用砒霜、蛇毒以及雷公藤等。紫莖澤蘭被視為有毒植物[26]，同樣研究證明其具有顯著的殺螨作用。本試驗(yàn)依照此事實(shí)依據(jù)，將紫莖澤蘭提取物制備成了殺螨噴劑，為紫莖澤蘭的利用提供了新的思路。此方法僅在新西蘭白兔身上做出初步嘗試，效果顯著，但要應(yīng)用于寵物行業(yè)市場(chǎng)，還需要多次的臨床試驗(yàn)。此方法為紫莖澤蘭殺螨噴劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)可為植物源噴劑的研究提供一定的可行性參考。

4 結(jié)論

紫莖澤蘭殺螨噴劑最佳配方為：紫莖澤蘭甲醇提取物4 mg/mL、3%聚山梨酯-80、2%月桂氮酮、20%乙醇。該配方臨床殺螨效果顯著，可以作為紫莖澤蘭開(kāi)發(fā)利用的重要途徑之一。