唐家河國家級自然保護區(qū)中華蜜蜂（Apis cerana cerana）的線粒體遺傳多樣性分析

李 彪，賴 康，鮮方海，向國棟，周 明，歐陽菠，鐘 赟，余姣姣，楊建東*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，成都 611130；2.四川省蜂業(yè)管理站，成都 610042；3.青川縣唐家河野生資源開發(fā)有限責任公司，四川廣元 628109；4.平武縣林業(yè)局，四川綿陽 622550）

中華蜜蜂，簡稱中蜂，又稱東方蜜蜂，主要分布在我國境內(nèi)的熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，除新疆之外我國各省、市、自治區(qū)中均有分布。楊冠煌等[1]曾考察了東方蜜蜂在我國境內(nèi)的分布范圍，并大致劃了4個分布范圍和5個亞種。與西方蜜蜂相比，中蜂能有效地利用零星蜜源植物，采集力強且利用率較高。此外，中蜂還具有采蜜期長、適應(yīng)性和抗螨抗病能力強、消耗飼料少等特點，非常適合中國山區(qū)定點飼養(yǎng)，在我國已有3 000多年的馴養(yǎng)歷史，是我國極為重要的蜜蜂資源[2-3]。然而近年來，個別飼養(yǎng)者為了獲得更好的經(jīng)濟效益，盲目引進外地中蜂或飼養(yǎng)西方蜜蜂，使一些本地中蜂品種嚴重混雜，失去了特有的地方中蜂性狀，給當?shù)氐牡胤街蟹溥z傳資源帶來了損失。盲目地引進外來蜂如同引入外來物種一樣，對本土近緣種類會產(chǎn)生干擾競爭，造成不良的生態(tài)效應(yīng)。比如分布區(qū)域迅速縮小、野生中蜂數(shù)量急減、分布區(qū)呈斑塊狀、傳染疾病等[4-6]。鑒于此，各地相關(guān)管理部門都對本地中蜂資源進行保護并取得了一系列成績[7-9]。

線粒體DNA（mtDNA）屬于核外遺傳物質(zhì)，具有基因組小、無重組、母性遺傳等特點，常被用于分類、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳學等研究。同一個蜂群中，蜂王與工蜂擁有同樣的mtDNA，一只工蜂的mtDNA就可代表整個蜂群，極大地提高了工作效率，因而mtDNA在蜜蜂的遺傳多樣性中有大量的研究[10]。近幾年，蜜蜂線粒體DNA的分析主要集中在tRNAleu～COⅡ基因的研究[11-13]，如姜玉鎖等對中國境內(nèi)11個不同地理型東方蜜蜂mtDNA tRNAleu～COⅡ基因多態(tài)性進行研究，結(jié)果顯示中國境內(nèi)不同地理型東方蜜蜂存在著較明顯的遺傳分化，其中海南東方蜜蜂由于長期的海島隔離形成了一個獨特的類群[13]。此外，蜜蜂mtDNA其余的基因片段（如COⅠ～COⅡ、tRNAIle～ND2、Cytb 等）也有相關(guān)研究[14-16]。

唐家河位于廣元市青川縣，是四川、甘肅和陜西三省的交匯處，是以大熊貓及其棲息地為主要保護對象的國家級自然保護區(qū)。全區(qū)森林覆蓋率達99.9%以上，保護區(qū)內(nèi)無村民居住、農(nóng)作物生產(chǎn)和工農(nóng)業(yè)污染，使得這里的蜜源植物豐富且種類繁多，非常適合中蜂產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，創(chuàng)造出唐家河“紅石河”蜂蜜等一系列的產(chǎn)品。然而，為了發(fā)展中蜂產(chǎn)業(yè)，保護區(qū)境內(nèi)的中華蜜蜂近年來面臨西蜂和外來中蜂的威脅，部分地區(qū)的本地中蜂數(shù)量已有下降的趨勢，因此有必要采取有效的措施加以保護和利用[17-18]。

本研究基于中華蜜蜂mtDNA tRNAleu～COⅡ段序列特有的非編碼區(qū)[19]分析唐家河中蜂的遺傳多樣性，旨在更好的保護唐家河中蜂資源，為其開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 采樣

共采集到唐家河不同海拔高度樣本37群，每群采取成年工蜂20只左右，每個采樣點隨機采1～4群。另外采集綿陽平武、廣元蒼溪和成都平原的中蜂做比較。樣品用100%酒精浸泡，置于-20℃保存。所有樣品的采樣信息表見表1。

表1 中華蜜蜂不同地理種群采樣信息表Table1 Sampling data of different geographical populations of Apis cerana cerana

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取

每群取1～2只工蜂，剪取蜜蜂的胸部肌肉，采用酚-氯仿法對蜜蜂總DNA進行提取[20]。

1.2.2 序列擴增與測序

對中華蜜蜂mtDNA的tRNAleu～COⅡ段進行序列的擴增與測序。PCR擴增引物為通用引物E2:5'-GGCAGAATAAGTGCATTG-3'和H2:5'-CAATATCA TTGATGACC-3'[21]。PCR 擴增體系（20 μL）：2×Easy Tap PCR Super-Mix 為 10 μL、ddH2O為6μL、引物F和R各1μL、DNA 模板為 2 μL。PCR擴增反應(yīng)程序參數(shù)：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)，72℃ 2min，12℃ 60 min。PCR產(chǎn)物進行正向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

DNAStar 7.0對原始序列進行序列的拼接；Mega 6.0進行多重序列比對、輸出堿基組成、變異位點、樣點間的遺傳分化系數(shù)等；DNASP 5.0計算平均核苷酸差異數(shù)、核苷酸多樣度和單倍型多樣性等；NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；Network5.0繪制網(wǎng)絡(luò)中介圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列擴增結(jié)果

所有中蜂樣本的擴增產(chǎn)物長度均為450 bp左右，包括tRNAleu部分基因序列、COⅡ部分基因序列以及非編碼區(qū)。

2.2 序列堿基組成及變異情況

測序共獲得了45群中華蜜蜂mtDNA tRNAleu～COⅡ段的部分序列，其中唐家河中蜂樣本37群，非編碼區(qū)長度為88～90 bp。對唐家河樣本的非編碼區(qū)堿基組成分析，結(jié)果顯示此段非編碼區(qū)為A+T富集區(qū)，A+T含量為86.4%。序列分析結(jié)果顯示，37個中蜂樣本的非編碼區(qū)共有22個變異位點。22個變異位點大部分為堿基轉(zhuǎn)換，少部分為堿基缺失。其中A/G有6個，T/C有5個，A/T有8個，T/G有1個，堿基缺失有2個。

分析所有中華蜜蜂mtDNA非編碼區(qū)序列，共發(fā)現(xiàn)了18個單倍型，分別命名為TJH1～18。其中唐家河中華蜜蜂分布的單倍型為TJH1～14。將獲得的單倍型序列TJH1～14在NCBI上進行Blast比對。結(jié)果顯示：除 TJH1、TJH3和 TJH6～7外，其余單倍型均有報道（表2）。

各單倍型的序列變異位點見表3。對非編碼區(qū)進行核苷酸多樣度分析，結(jié)果顯示四川唐家河中蜂的平均核苷酸差異數(shù)（K）為2.640，核苷酸多樣度（Pi）為 0.030 34，單倍型多樣性（Hd）為 0.839。

表2 唐家河中蜂的單倍型在NCBI上對應(yīng)的登錄號Table2 The Apis cerana cerana haplotypes in the NCBI with the Tangjiahe

2.3 單倍型分析

2.3.1 單倍型分布

由表4可知，單倍型TJH1出現(xiàn)在4個樣本中，占總樣本數(shù)的10.81%；單倍型TJH2出現(xiàn)在11個樣本中，占總樣本數(shù)的29.73%；單倍型TJH3出現(xiàn)在2個樣本中，占總樣本數(shù)的5.41%；單倍型TJH4出現(xiàn)在10個樣本中，占總樣本數(shù)的27.03%；其余單倍型的樣本數(shù)均為1個，分別占總樣本數(shù)的2.70%。由此可見，單倍型TJH2和TJH4出現(xiàn)的頻率最高，為唐家河中蜂的主體單倍型。統(tǒng)計各采樣點的單倍型分布發(fā)現(xiàn)：雞公埡、水池坪、太陽坪、陰壩等地的單倍型類型較多且分布均勻，而且同一地點的不同樣本其mtDNA序列也存在差異，如雞公埡的4個樣本中共發(fā)現(xiàn)3種單倍型，陰壩的4個樣本中發(fā)現(xiàn)3種單倍型等。此外，4種新的單倍型分別來自蔣家灣、半邊街、洪石壩、油庫；單倍型TJH4分布最為廣泛，蔡家壩保護站周圍地區(qū)的單倍型最多，遺傳多樣性也最高。

2.3.2 單倍型聚類分析

以西方蜜蜂為外群（NCBI登錄號HQ337457.1），利用NJ法對唐家河地區(qū)14個單倍型進行聚類分析。由圖1可知，主體單倍型TJH4和TJH3聚類為一支，分布的地點有雞公埡、蔣家灣、摩天嶺入口、陰壩等地；主體單倍型TJH2和TJH12聚類為一支，分布的地點有水池坪、四角灣、松克梁、太陽坪等地；單倍型TJH6和TJH11聚類為一支，分布的地點有油庫、大灣河等地。

2.3.3 單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖分析

由圖2可以看出，TJH2和TJH4為唐家河2個主體單倍型，其中TJH2和TJH4出現(xiàn)的頻率最高，TJH2包含的地區(qū)最多，為主要共有單倍型。其中9個單倍型起源于TJH2，TJH6和TJH18與其他單倍型表現(xiàn)出分離。比較唐家河和廣元蒼溪、綿陽平武的中華蜜蜂單倍型發(fā)現(xiàn)，它們之間存在共有單倍型，并沒有出現(xiàn)分離；相反，比較唐家河和成都溫江的中華蜜蜂單倍型發(fā)現(xiàn)，它們之間的單倍型表現(xiàn)出分離。

表3 14個單倍型的序列變異位點Table3 Variation of nucleotide sites of 14 haplotypes

表4 唐家河中華蜜蜂14個單倍型的分布情況Table4 Distributions of 14 haplotypes for honeybees(Apis cerana cerana)in Tangjiahe

3 討論

本研究中37群中華蜜蜂核苷酸多樣度（Pi）為0.030 34，平均核苷酸差異數(shù)（K）為2.640，這與徐國威等[15]研究結(jié)果相符。該研究利用mtDNA COⅠ～COⅡ分析了四川省中華蜜蜂的遺傳多樣性，結(jié)果顯示四川省內(nèi)的中華蜜蜂具有豐富的遺傳多樣性，在廣元青川地區(qū)檢測到較多的獨有單倍型。谷瑛等[12，22]利用相同基因序列分析了重慶地區(qū)中蜂的遺傳多樣性，得到核苷酸多樣度（Pi）分別為0.017 92和0.018 19，說明唐家河中蜂的平均核苷酸多樣度高于重慶地區(qū)。與國內(nèi)其余地方，如浙江、福建、海南和吉林長白山等地[11，23-25]比較，唐家河地區(qū)的核苷酸多樣度或平均核苷酸差異數(shù)也相對較高，這可能與唐家河位于甘肅、陜西和四川三省交界這一特殊的地理環(huán)境有關(guān)。

圖1 基于NJ法的各個單倍型聚類分析Figure1 Cluster analysis of haplotypes based on neighbor-joining（NJ）method

唐家河地區(qū)中峰豐富的單倍型說明該區(qū)域具有豐富種質(zhì)遺傳資源，擁有很大的保種價值。根據(jù)mtDNA非編碼區(qū)序列和聚類分析結(jié)果可以看出，唐家河地區(qū)單倍型的劃分與其氣候、植物和特殊的地理環(huán)境等因素有很大關(guān)系，促進了保護區(qū)內(nèi)中蜂的分化。單倍型TJH7來源于距離較遠的洪石壩，其余采樣點都未出現(xiàn)，推測可能與洪石壩的地理位置較遠、海拔較高、人為干擾較少等因素有關(guān)。此外，唐家河不同地方中蜂mtDNA的遺傳結(jié)構(gòu)差異不大，且與周邊地區(qū)（綿陽平武和廣元蒼溪等）的中華蜜蜂也相似。由此可見，地理環(huán)境造成的差異并不是引起唐家河中華蜜蜂遺傳多樣性的決定因素，唐家河中華蜜蜂遺傳結(jié)構(gòu)差異不明顯。根據(jù)單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖可以看出，綿陽平武、廣元蒼溪都有與唐家河相同的單倍型，可能是因為平武和蒼溪距離唐家河地理位置較近，但也不排除近年來當?shù)匾M外來蜂造成的原因。由于蜜蜂特殊的繁殖方式，外來蜂一旦適應(yīng)了本地的氣候，很容易與本地蜂產(chǎn)生基因交流，破壞種質(zhì)遺傳資源。因此，在大力發(fā)展養(yǎng)蜂產(chǎn)業(yè)的同時，也要嚴格控制外來引進蜂的數(shù)量，保護唐家河當?shù)胤浞N的遺傳多樣性。

圖2 唐家河地區(qū)中華蜜蜂非編碼區(qū)單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖Figure2 The median-joining networks of Tangjiahe Apis cerana cerana populations based on non-coding region of mitochondrial tRNAleu～COⅡ fragment