一個(gè)新的薄皮甜瓜葉色突變體的生理特性及超微結(jié)構(gòu)分析

賴 艷，付秋實(shí)，呂建春，周夢迪，何 茂，許煒萍，王懷松，黃 志*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3.農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

甜瓜（Cucumis melo L.），葫蘆科甜瓜屬作物，具有多種變異類型，其中葉色變異是最為常見的變異之一。在自然或人工誘變的條件下，葉綠素的合成與降解途徑異常、葉綠體結(jié)構(gòu)受到影響均可導(dǎo)致葉色突變體的產(chǎn)生[1-2]。葉色突變體是植物光合系統(tǒng)、抗病機(jī)制及激素生理等代謝過程的重要研究材料，同時(shí)也是分析鑒定基因功能和創(chuàng)造優(yōu)異種質(zhì)資源的理想材料[3-6]。目前，關(guān)于葉色突變體的生理特性研究方面已有相關(guān)報(bào)道，但不同的突變體研究結(jié)果不盡相同。相對(duì)于大田作物而言，葫蘆科作物變異類型較少，突變機(jī)理仍不明確。

本試驗(yàn)以薄皮甜瓜自然黃化轉(zhuǎn)綠突變體 MT、非突變體親本W(wǎng)T及F1（MT×WT），rF1（WT×MT）為研究材料，調(diào)查各處理不同時(shí)期的主要農(nóng)藝性狀，測定其光合指標(biāo)、光合色素含量、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）及丙二醛（MDA）含量等并進(jìn)行比較分析，初步探討了該突變體與非突變體親本及其子代的生理生化差異，分析了其突變機(jī)理，豐富了葫蘆科植物光合作用機(jī)制的理論基礎(chǔ)，為后續(xù)研究突變基因精細(xì)定位與挖掘提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供，正常葉色甜瓜WT為薄皮甜瓜材料。葉色黃化轉(zhuǎn)綠突變體MT是從甜瓜高代自交系WT田間栽培中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)自然黃化轉(zhuǎn)綠突變體（圖1），葉色黃化性狀能夠穩(wěn)定遺傳。

MT、WT、F1（MT×WT），rF1（WT×MT）于2016年3月—7月種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗(yàn)農(nóng)場塑料大棚內(nèi)，吊蔓種植，常規(guī)田間管理。

圖1 黃化轉(zhuǎn)綠突變體的表型性狀Figure1 Phenotypes of MT and WT

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

測量WT、MT以及F1、rF1的各個(gè)時(shí)期的主要形態(tài)指標(biāo)（子葉期、幼苗期、開花期、結(jié)果期），用刻度尺測量株高、葉面積（葉片長×葉片寬）；用游標(biāo)卡尺測量莖粗；用便攜式葉綠素儀SPAD-502測定SPAD值，開花期和結(jié)果期選取植株正常發(fā)育的功能葉片。

1.3 果實(shí)性狀測定

從果實(shí)授粉當(dāng)天直到果實(shí)成熟采摘時(shí)，每隔7 d用游標(biāo)卡尺對(duì)果實(shí)縱橫徑進(jìn)行一次測定，并計(jì)算果形指數(shù)。

1.4 光合特性及抗氧化酶活性的測定

1.4.1 光合參數(shù)的測定

在成株期用 LI-6400XT便攜式光合儀于晴天上午9:00—11:00分別對(duì) WT、MT完全展開的功能葉片測定凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（GS）、蒸騰速率（Tr），胞間 CO2濃度（Ci）進(jìn)行測定[7]。

1.4.2 光合色素含量測定

隨機(jī)選取WT、MT以及 F1、rF1子葉期，幼苗期（4葉期），開花期（植株頂部向下數(shù)第5片葉）、結(jié)果期（植株頂部向下數(shù)第 5片葉）的新鮮葉片，采用UV1102型紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行光合色素測定，含量以 mg/g（鮮葉）表示[8]。

1.4.3 酶活性以及丙二醛（MDA）含量的測定

分別在幼苗期、開花期、結(jié)果期，取 WT、MT以及F1、rF1相同功能部位的葉片測定抗氧化酶活性。其中采用氮藍(lán)四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈創(chuàng)木酚法采用過氧化物酶（POD）活性；采用紫外分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）[8]。

1.5 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

在幼苗期，選取WT和MT植株中完全展開的功能葉，在葉片中部主脈兩側(cè)切取大小1～2 mm見方小塊，用4%戊二醛前固定，pH7.2磷酸緩沖液沖洗，1%鋨酸后固定，梯度乙醇逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂812滲透并包埋，利用ULPRACUT-E型超薄切片機(jī)切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，H-7650型透射電鏡觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)、形態(tài)和分布,測量大小并拍照[9]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用 Excel2010、SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期甜瓜MT與WT及其子代的形態(tài)特征差異

由表1可知，在植株生長發(fā)育整個(gè)階段中，WT與MT及其F1、rF1的主要形態(tài)指標(biāo)差異較為明顯。其中，從幼苗期到結(jié)果期，株高、莖粗、葉面積、SPAD值都出現(xiàn)升高趨勢；在結(jié)果期，與WT相比，MT的株高、莖粗、葉面積、SPAD值分別降低9.45%、3.03%、7.75%、6.44%。株高、莖粗在幼苗期差異不顯著，葉面積、SPAD值基本上在全生育期中均達(dá)到顯著差異。F1、rF1的莖粗與WT差異不顯著，而株高、葉面積在全生育期中都高于WT；在結(jié)果期，F(xiàn)1、rF1的株高分別提高了15.55%、5.86%，葉面積分別提高了41.67%、13.24%，而SPAD值沒有一致的變化規(guī)律，除開花期低于WT外，其他生育期均高于WT。

表1 不同時(shí)期甜瓜MT與WT及其子代的形態(tài)特征差異Table1 The morphological differences in MT，WT and F1during different stages

2.2 果實(shí)外觀特性分析

由表2可知，從授粉當(dāng)天到果實(shí)成熟，各個(gè)處理植株的果實(shí)縱徑和橫徑均逐漸增大，而果形指數(shù)則降低。與果實(shí)授粉當(dāng)天相比，果實(shí)成熟時(shí)的果形指數(shù)分別下降了33.70%、35.42%、28.66%、30.29%，從而使得果實(shí)生長趨于長圓形變化。在果實(shí)采摘時(shí)，與WT相比，MT橫的果實(shí)縱徑、 徑分別降低了3.22%、0.99%，而果形指數(shù)則降低了0.22%；F1的果實(shí)縱徑、橫徑分別提高了26.52%、13.43%，其果形指數(shù)提高了11.57%；rF1分別提高了26.16%、13.43%，其果形指數(shù)提高了11.23%。

2.3 MT植株子葉及第1真葉葉綠素含量的變化分析

前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，MT的子葉為黃色，WT為綠色，隨著苗齡的延長，突變體子葉顏色開始轉(zhuǎn)綠。由表3可知，MT第1真葉的葉綠素含量與WT的變化有所差異，MT中的葉綠素含量先上升后下降，而WT中的則是逐漸下降，但整個(gè)測定周期中，MT中葉綠素含量始終低于WT。其中，在各個(gè)時(shí)期MT第1真葉的葉綠素含量較WT的分別降低了38.98%、23.25%、6.15%、13.15%。在MT第1真葉完全展平時(shí)，植株黃化性狀較WT區(qū)別尤為明顯，WT植株為綠色，MT植株為金黃色，但葉脈為綠色。

2.4 不同時(shí)期甜瓜MT與WT及其子代光合色素含量的變化分析

如圖 2 所示，WT、MT、F1、rF1的光合色素含量在整個(gè)生育期中都出現(xiàn)升高趨勢。與WT相比，MT的葉綠素及類胡蘿卜素含量在結(jié)果期分別降低25.69%、21.26%；MT的葉綠素a與葉綠素b的比值在開花期達(dá)到最大值，提高了1.88%；而MT的類胡蘿卜素與葉綠素的比值先升高后降低，且在幼苗期達(dá)到最大值，提高了2.44%。在結(jié)果期，與WT相比，F(xiàn)1、rF1的葉綠素含量分別降低了19.01%、8.16%；類胡蘿卜素含量分別降低了17.30%、2.58%。

表2 不同時(shí)期甜瓜MT與WT及F1代果實(shí)大小的變化趨勢Table2 The change trend of MT，WT and F1in different stages

表3 MT與WT子葉及第1真葉葉綠素含量的變化Table3 The chlorophyll content in cotyledon and first true leaf of MT and WT

圖2 不同時(shí)期甜瓜MT與WT及F1代光合色素含量的變化Figure2 Photosynthetic pigment content change of MT,WT and F1in different stages

2.5 成株期MT與WT的光合特性差異

由表4可知，MT與WT的光合作用在成株期時(shí)存在差異，MT植株的氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率差異顯著，較WT分別提高了47.95%、12.80%、31.87%，但凈光合速率差異不顯著。

2.6 不同時(shí)期甜瓜MT與WT及其子代抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量分析

由圖3可以看出，WT、MT以及F1、rF1在整個(gè)生長階段中的抗氧化酶活性及丙二醛含量差異較為明顯且變化規(guī)律不一致。SOD酶活性在整個(gè)生長階段中出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，POD酶活性則一直處于升高的趨勢，而CAT酶活性則是一直下降的趨勢。在結(jié)果期，與WT相比，SOD酶活性達(dá)到顯著差異，且SOD、POD、CAT酶活性分別提高了65.45%、13.91%、3.23%。F1、rF1的酶活性含量與 WT差異不顯著，F(xiàn)1分別提高了 1.47%、13.88%、4.09%，rF1分別提高了2.05%、14.88%、1.88%。MDA含量從子葉期到結(jié)果期出現(xiàn)升高的趨勢。在結(jié)果期，與WT相比，MT的MDA含量提高了15.14%，而F1、rF1的MDA含量與WT差異不顯著，分別降低了1.29%、2.45%。

表4 成株期MT與WT的光合特性差異Table4 Photosynthetic characteristics difference of MT and WT in adult stage

圖3 不同時(shí)期甜瓜MT與WT及其子代SOD、POD、CAT活性及MDA含量的變化Figure3 The changes of Superoxide dismutase,peroxidase,catalase activity and malondialdehyde content of MT，WT and F1in different stages

2.7 甜瓜MT與WT幼苗期葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

由表5、圖4可知，甜瓜MT與WT幼苗期葉綠體結(jié)構(gòu)存在著顯著差異。MT的葉綠體結(jié)構(gòu)較WT簡單，葉綠體發(fā)育不完整。其表現(xiàn)為葉綠體輪廓不清，無明顯的膜結(jié)構(gòu)，淀粉粒少，基粒排列不整齊，形狀呈不規(guī)則的線條狀，基粒片層堆疊數(shù)少，間距大，排列疏松，內(nèi)含物混濁，透明度較差，嗜鋨體較少。而WT葉綠體發(fā)育正常，基粒片層有規(guī)律的緊密排列，結(jié)構(gòu)發(fā)育正常，淀粉粒較多，膜結(jié)構(gòu)清晰可見。與WT相比，MT的葉綠體數(shù)、淀粉粒數(shù)較少，光合產(chǎn)物積累較少；其中MT的葉綠體細(xì)胞減少了37.50%，淀粉粒細(xì)胞減少了55.55%。

3 討論與結(jié)論

近年來，葉色突變體已在多種植物中被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行了研究，其關(guān)注度也越來越高。由于葉色突變體自然突變發(fā)生頻率較低，因此對(duì)甜瓜葉色突變體的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)中，MT的黃化性狀在一葉期時(shí)，葉色區(qū)別尤為明顯，隨著植株的生長發(fā)育，葉片顏色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色，每一片新生的葉片表現(xiàn)黃化，但葉脈仍為綠色，后期由葉尖向基部逐漸轉(zhuǎn)綠。這與李音音等[10]報(bào)道的甜瓜MT在整個(gè)生育期內(nèi)都呈現(xiàn)黃化有所差異，與國艷梅等[11]報(bào)道的出現(xiàn)早衰現(xiàn)象的MT也有所區(qū)別，是一個(gè)新的甜瓜葉色黃化突變體。

葉色變異的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，其與葉綠體發(fā)育、光合色素含量有著直接的關(guān)系[12]。本試驗(yàn)中不同時(shí)期MT的葉色SPAD值、總?cè)~綠素含量、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量都顯著低于WT，這是葉片表現(xiàn)出黃化性狀的重要原因。這與邵勤等[13]、李音音等[10]、王聰田等[14]的研究的結(jié)果一致。葉綠素和類胡蘿卜素含量減少，葉綠素a/b的值增大，說明葉綠素b的降低幅度大于葉綠素a，推測葉色黃化突變體可能是葉綠素b缺失類型，突變引起葉綠素a向葉綠素b的轉(zhuǎn)化，使得葉綠素b的降低幅度大于葉綠素a。這與茹廣欣等[15]在泡桐的葉色研究結(jié)果基本一致。類胡蘿卜素與葉綠素的比值先上升后下降，與MT有黃轉(zhuǎn)黃綠的趨勢一致，但胡蘿卜素差異變化是否決定葉片黃化還有待進(jìn)一步研究。

表5 MT與WT葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較Table5 The difference of chloroplast ultrastructure between MT and WT

圖4 MT與WT葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較Figure4 Comparison of chloroplast ultrastructure between MT and WT

本試驗(yàn)中MT的光合效率在成株期時(shí)與WT無顯著差異，葉綠素含量與凈光合效率沒有相關(guān)性，這與林鈺瓊等在水稻的研究結(jié)果相似[16]。雖然MT的葉綠素與類胡蘿卜素的含量均低于WT，但類胡蘿卜素與葉綠素的比值卻高于WT，說明類胡蘿卜素有可能作為輔助捕光色素，擴(kuò)大吸收光的范圍，從而提高光合效率，這與曹莉等對(duì)小麥的研究結(jié)果一致[17]。同時(shí)，MT與WT苗期的葉綠體結(jié)構(gòu)也存在顯著差異。MT的葉綠體結(jié)構(gòu)較WT簡單，其葉綠體輪廓模糊，內(nèi)含物混濁、淀粉粒少，基粒片層垛疊數(shù)較少，此結(jié)果與涂政軍等[18]、肖華貴等[19]的研究結(jié)果一致。從葉綠體結(jié)構(gòu)差異上分析，葉綠素存在于類囊體膜上，由于葉綠體發(fā)育異常，使得葉綠體數(shù)目和基粒片層數(shù)少，導(dǎo)致MT的葉綠素含量下降，表現(xiàn)出黃化性狀。

葉色突變體可激活植株體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，避免葉綠體受到活性氧的損害，防止膜脂過氧化加劇，提高突變體的抗逆性[7，20]。本試驗(yàn)中，MT的抗氧化酶活性、MDA含量顯著高于WT，可能是由于MT激活了機(jī)體內(nèi)自身的保護(hù)酶系統(tǒng)，減少了葉色突變帶來生理層面的不良影響，緩解細(xì)胞受損傷的程度，提高抗逆性，從而維持植株的正常生長。但是MT的結(jié)構(gòu)異常使得其一直處于逆境生長中，MDA不斷積累，使得MT植株在整個(gè)生長期長勢較弱，并在生后期出現(xiàn)一定的早衰現(xiàn)象。而F1、rF1的酶活性與WT差異不明顯，說明雜交后代已不具備MT的獨(dú)有特征。通過MT與WT構(gòu)建的遺傳群體發(fā)現(xiàn)F1、rF1都表現(xiàn)正常的葉色（綠色），推斷MT屬于細(xì)胞核基因控制的隱性突變[21-24]。

綜上所述，本試驗(yàn)從生理水平與葉綠體結(jié)構(gòu)上初步探究了葉色突變的機(jī)理，推測本試驗(yàn)材料葉片黃化的主要原因是葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育不完善引起的葉綠素含量的降低，為細(xì)胞核基因控制的隱性突變。但黃化突變機(jī)制極為復(fù)雜，其分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究。繼續(xù)挖掘影響葉色變黃的因素對(duì)于甜瓜新品種的培育極為重要，同時(shí)也為今后開展對(duì)突變體的基因定位及克隆等研究工作奠定基礎(chǔ)。