miR—493在骨肉瘤組織中表達及其臨床意義

曹平

【摘要】 目的：探討miR-493在骨肉瘤組織中表達情況及其表達與患者各臨床參數(shù)之間的關(guān)系。方法：回顧性分析本院2012年1月-2016年7月的32例骨肉瘤組織標(biāo)本和41例骨軟骨瘤組織標(biāo)本，骨軟骨瘤標(biāo)本作為對照，采用RT-PCR法檢測標(biāo)本中miR-493相對表達量。分析骨肉瘤標(biāo)本及骨軟骨瘤標(biāo)本，分析轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組，復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組標(biāo)本miR-493表達差異。以中位數(shù)為界分為miR-493高表達組與miR-493低表達組，分析骨肉瘤臨床特征與miR-493表達的關(guān)系。結(jié)果：miR-493在骨肉瘤標(biāo)本組中表達量低于骨軟骨瘤組織（1.025±0.122 vs 2.369±0.255，P<0.05），轉(zhuǎn)移組表達量低于未轉(zhuǎn)移組（0.768±0.132 vs 1.033±0.136，P<0.05），惡性程度高組中表達量低于惡性程度低組（0.642±0.102 vs 0.967±0.0.095，P<0.05）。32例骨肉瘤組織miR-493表達量中位數(shù)為0.728（0.213，1.548），患者年齡、性別和腫瘤侵襲部位與miR-493表達水平無相關(guān)性（P>0.05）。腫瘤越大、惡性程度越高、復(fù)發(fā)和發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤標(biāo)本miR-493表達相對較低。結(jié)論：miR-493在骨肉瘤組織呈現(xiàn)低表達，miR-493與骨肉瘤腫瘤越大、惡性程度越高、復(fù)發(fā)和發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 骨肉瘤； 微小RNA； 腫瘤復(fù)發(fā)

The Expression and Clinical Significance of miR-493 in Osteosarcoma/CAO Ping.//Medical Innovation of China，2018，15（16）：0-065

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of miR-493 in osteosarcoma and the relationship between the expression and clinical parameters of osteosarcoma.Method：A total of 32 cases osteosarcoma specimens and 41 cases osteochondroma specimens in our hospital from January 2012 to July 2016 were analyzed retrospectively，osteochondroma specimens was control group.The expression of miR-493 was detected by RT-PCR analysis of specimens.ThemiR-493 expression differencees were analyzed between metastasis group and non-metastasis group，recurrence group and non-recurrence group of osteosarcoma specimens and osteochondroma specimens.The miR-493 high expression group and miR-493 low expression were analyzed the relationship between the expression of miR-493 and clinical features of osteosarcoma specimens.Result：The expression of miR-493 in osteosarcoma specimens group was lower than bone tissue chondroma （1.025±0.122 vs 2.369±0.255，P<0.05）， expression was lower than for the transfer of cases transferred group （0.768±0.132 vs 1.033±0.136）， the expression of high malignancy group was lower than that of low malignant group （0.642±0.102 vs 0.967±0.0.095，P<0.05）.The median expression of miR-493 in 32 cases of osteosarcoma was 0.728 （0.213，1.548）.There was no correlation between the age， sex and the location of tumor invasion and the expression level of miR-493（P>0.05）.The higher the degree of malignancy，the higher the degree of malignancy，the higher the recurrence and metastasis of osteosarcoma，the lower the expression of miR-493.Conclusion：miR-493 is low expression in osteosarcoma，and miR-493 is closely related to bigger tumor size，higher the degree of malignancy，recurrence and metastasis of osteosarcoma.

【Key words】 Osteosarcoma； miRNA； Tumor recurrence

First-authors address：Tianyou Hospital Affiliated to Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430064，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.16.018

骨肉瘤是常見的骨腫瘤之一，主要發(fā)生于10～20歲青少年的肢體骨干骺端，骨肉瘤起源于間質(zhì)組織，細(xì)胞呈梭形，是一種惡性腫瘤[1-2]。骨肉瘤惡性程度高、侵襲性強、局部復(fù)發(fā)率高以及進展快，嚴(yán)重危害了青少年的身體健康?，F(xiàn)代腫瘤分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展為骨肉瘤的治療提供了新方法，包括基因治療、分子靶向治療和基因預(yù)后評估等[3]。研究表明，骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展與原癌基因的異常激活或抑癌基因的異常失活密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)記基因?qū)侨饬龅脑缙谠\斷和預(yù)后具有非常重要的意義[4]。

miRNA是屬于小分子非編碼RNA，與mRNA的3端非編碼區(qū)域結(jié)合而調(diào)控下游基因[5]。miRNA參與了骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及發(fā)生發(fā)展等多個生理過程。研究表明，miR-493在肺癌、肝癌、胃癌等腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達，可能是一種抑癌基因[6-10]。然而，miR-493在骨肉瘤組織中的表達及其作用仍不明確，本研究擬分析miR-493在骨肉瘤組織中的表達情況，并分析其表達與臨床特征之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 32例骨肉瘤組織標(biāo)本和41例骨軟骨瘤組織標(biāo)本均來自本院2012年1月-2016年7月的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有骨肉瘤和骨軟骨瘤良性腫瘤患者都經(jīng)病理、X線及CT掃描明確診斷，包括股骨下段、脛骨上段、橈骨遠(yuǎn)端常見部位及其他短骨和扁平骨不常見部位的骨肉瘤或骨軟骨瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除復(fù)發(fā)患者，合并嚴(yán)重心腦血管疾病患者，不愿意資源參加項目研究的患者。統(tǒng)計分析所有患者臨床資料，包括年齡、性別、是否轉(zhuǎn)移、惡性程度等。所有標(biāo)本在離體后迅速放入液氮中，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存。本研究通過了本院倫理委員會審核，簽署患者知情同意書并遵循臨床相關(guān)研究倫理規(guī)定。

1.2 熒光定量PCR檢測組織標(biāo)本 （1）Trizol法提取組織標(biāo)本的總RNA：取適當(dāng)質(zhì)量的待檢組織，加入Trizol（Invitrogen），充分勻漿，按照Trizol法提取總RNA。通過紫外光譜法檢測總RNA濃度和純度。（2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：經(jīng)3段 poly（A）加尾處理后，將RNA中加入0.5 μg寡核苷酸，75 ℃變性5 min，稀釋成12.5 μL。冰浴30 s，加入RNA酶抑制劑、10 nmol的dNTP混合物和第一鏈緩沖液，42 ℃下孵育5 min；加入逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen）反應(yīng)50 min。最后置于70 ℃下15 min，終止反應(yīng)。（3）PCR過程：引物設(shè)計合成由廣州銳博完成，5-TGTGATTGGAATGGAAATTTAATTT-3；反向引物5-ACTATCCTACACTCC CCTACCCTAC-3，采用2-△△方法進行定量分析，以U6作為內(nèi)參，正向引物5-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3，反向引物5-GGAACGCTTCACGAATTTG-3。RT-PCR

反應(yīng)體系為：5.0 μL的cDNA，0.75 μL正向引物，

0.75 μL反向引物，12.5 μL的SYBR Green熒光染料（上海閃晶分子生物）和6.0 μL DEPC水。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 45 s，45循環(huán)；65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組之間比較采用t檢驗，多組間比較用方差分析；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較 骨肉瘤組織標(biāo)本組年齡14～28歲，平均（17.6±4.8）歲；男20例，女12例；轉(zhuǎn)移16例，未轉(zhuǎn)移16例；惡性程度高18例，低14例，所取得標(biāo)本術(shù)前未接受放療或化療。骨軟骨瘤組年齡24～38歲，平均（31.7±5.9）歲。

2.2 兩組miR-493表達水平比較 miR-493在骨肉瘤標(biāo)本組中表達量為（1.025±0.122）低于骨軟骨瘤組（2.369±0.255），出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病例組表達量（0.768±0.132）低于未轉(zhuǎn)移組（1.033±0.136），惡性程度高組中表達量（0.642±0.102）低于惡性程度低組（0.967±0.095），比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 miR-493表達水平與骨肉瘤的臨床指標(biāo)間的關(guān)系 32例骨肉瘤組織miR-493表達量中位數(shù)為0.728（0.213，1.548），以中位數(shù)為界限將骨肉瘤患者分為miR-493高表達組與miR-493低表達組，進一步分析miR-493表達水平與骨肉瘤臨床指標(biāo)間的關(guān)系，患者年齡、性別和腫瘤侵襲部位與miR-493表達水平無相關(guān)性（P>0.05）。見表1。

3 討論

復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響骨肉瘤治療的兩個關(guān)鍵因素，有學(xué)者提出，幾乎所有骨肉瘤患者在門診或住院確診時已經(jīng)出現(xiàn)了微轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞進入血液循環(huán)[11]。因此輔助化療對惡性程度高的骨肉瘤患者是必要的治療手段，經(jīng)過輔助化療將腫瘤初步控制在原位之后，再行手術(shù)治療，則優(yōu)于單純手術(shù)治療的療效[12]。盡管如此，骨肉瘤遠(yuǎn)期生成率仍較低，多數(shù)患者在經(jīng)過反復(fù)化療之后仍然出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等，因此，骨肉瘤（尤其是已經(jīng)明確有轉(zhuǎn)移的骨肉瘤）仍缺乏有效的早期診斷和治療措施[13]。骨肉瘤對化療藥物的耐藥作用是骨肉瘤化療失敗的常見原因之一，此外，患者不能耐受化療藥物的副作用、經(jīng)濟條件限制及基層醫(yī)院缺乏規(guī)范的治療策略，可能影響骨肉瘤的治療療效。

miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能，miRNA在腫瘤診斷和治療領(lǐng)域的作用備受關(guān)注[14-15]。本實驗研究表明，miR-493在骨肉瘤標(biāo)本組中表達量低于骨軟骨瘤組織，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病例組表達量低于為轉(zhuǎn)移組，惡性程度高組中表達量低于惡性程度低組，并且卡方檢驗表明，miR-493與骨肉瘤患者臨床特征如惡性程度越高、復(fù)發(fā)和發(fā)生轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性?；趍iR-493在骨肉瘤患者組織中的表達特點，miR-493相對表達量較高的骨肉瘤惡性程度越低、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險越低，因此，可以初步推斷，miR-493可能抑制了骨肉瘤發(fā)生發(fā)展。不同miRNA在骨肉瘤組織或血液中有高表達和低表達的現(xiàn)象并不少見，已經(jīng)被許多骨肉瘤組織的基因芯片檢測所證實。高表達或低表達的miRNA在骨肉瘤中的關(guān)鍵作用則有待進一步研究，一般來說，高表達miRNA可能作為骨肉瘤的診斷標(biāo)志物，是一種癌基因，而低表達的miRNA則肯能起到抑癌基因的作用，將來可能作為抗腫瘤的新的靶點之一。研究表明，多種miRNA在骨肉瘤標(biāo)本中呈現(xiàn)低表達，且在骨肉瘤細(xì)胞系中也低表達，人們認(rèn)為，這些下調(diào)的基因可能起到抑制骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用[16]。陳翔等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-140在樣本中的表達明顯低于其在周圍正常組織中的表達，白馬恒等[18]研究表明，miR-194與骨肉瘤患者各臨床參數(shù)如年齡、腫瘤臨床分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和生存率等存在顯著相關(guān)性。還有報道表明，miR-493通過調(diào)控靶基因抑制肺癌、肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究基于臨床標(biāo)本和患者臨床數(shù)據(jù)表明，miR-493在骨肉瘤中低表達，可能起到抑癌基因作用，miR-493在骨肉瘤細(xì)胞中的作用機制有待進一步的細(xì)胞和動物實驗研究。本研究的不足之處在于，骨肉瘤的樣本量仍偏少，且僅限于分析了本院近幾年收治的患者范圍。因此本研究將進一步擴大樣本量及納入的地區(qū)范圍，增加統(tǒng)計分析的可信度。此外，本研究將從細(xì)胞和動物實驗水平深入探討miR-493對骨肉瘤增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及侵襲轉(zhuǎn)移等生物活性的影響。

綜上所述，miR-493在骨肉瘤組織呈現(xiàn)低表達，miR-493與骨肉瘤腫瘤越大、惡性程度越高、復(fù)發(fā)和發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

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（收稿日期：2017-11-06） （本文編輯：周亞杰）