1,4,5,8-萘四甲酸二酰亞胺納米熒光探針的制備及應(yīng)用

張海容， 高登輝， 劉 佳， 陳金娥

(山西省忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州 03400)

三聚氰胺的含氮量高達(dá)66.6%，因此，將其違法摻入蛋白性飼料或食品中以提高蛋白質(zhì)含量，降低生產(chǎn)成本[1]時(shí)有發(fā)生。我國(guó)頒布了數(shù)項(xiàng)三聚氰胺檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[2 - 4],規(guī)定了高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為三聚氰胺的檢測(cè)方法，其定量限分別為2.0×10-3、5.0×10-5和1.0×10-5g/L。目前,三聚氰胺的檢測(cè)方法主要包括質(zhì)譜法[5 - 7]、高效液相色譜法[8]、中和近紅外光譜[9]、聚二乙炔脂質(zhì)體的相互作用[10]、離子交換色譜法[11]、酶聯(lián)免疫吸附法[12]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[13]等。這些方法一般需要通過大型儀器測(cè)定，成本昂貴，不適合快速、簡(jiǎn)便分析。目前，用納米熒光探針對(duì)三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)鮮有報(bào)道[14],但未見用1,4,5,8-萘四甲酸二酰亞胺(1,4,5,8-Naphthaleneteracarbox-diimide，NTCD)納米熒光探針檢測(cè)乳制品中三聚氰胺的報(bào)道。

本文通過真空氣相沉積-分子自組裝法[15 - 19]合成了NTCD納/微米線，進(jìn)一步研究其光電性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)NTCD納米材料是優(yōu)良的傳感器轉(zhuǎn)導(dǎo)材料，據(jù)此建立了NTCD納米熒光探針檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的分析方法。方法處理過程簡(jiǎn)便，檢出限低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的液相色譜法，適合于各類乳品、食品分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑和材料

F-4600型熒光光度計(jì)(日本，日立公司);UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司);傅立葉變換紅外光譜儀(日本，島津公司)；AB-204N電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；JEOL-2000EX型透射電子顯微鏡(日本，電子公司);JSM-6700F型掃描電子顯微鏡(日本，電子公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1,4,5,8-萘四甲酸二酰亞胺(Fluka，>97%);無水乙醇(分析純);三聚氰胺(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

奶粉樣品Ⅰ(批次：134141.60，古城牌嬰幼兒配方奶粉,山西古城乳業(yè)有限公司,山西山陰縣)，奶粉樣品Ⅱ(批次：4226.30、4279.17，雅士利牌嬰幼兒配方奶粉,山西雅士利乳業(yè)有限責(zé)任公司,應(yīng)縣雅士利工業(yè)園),均購(gòu)自本地團(tuán)結(jié)超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1納米材料的制備在真空條件下，干態(tài)有機(jī)分子在沸點(diǎn)附近十分容易蒸發(fā)[15]，將粉末狀的原材料加熱到沸點(diǎn)以上，固態(tài)有機(jī)分子直接升華為氣體分子，由于處于真空環(huán)境，高溫條件下NTCD分子不會(huì)被氧化，分子通過分子間的范德華力自組裝形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的聚集體，沉積到玻璃基質(zhì)上，形成納米結(jié)構(gòu)[18]，有關(guān)與基質(zhì)的作用機(jī)理尚不清楚。通過控制實(shí)驗(yàn)操作條件(如溫度、時(shí)間)，有機(jī)納米材料的制備簡(jiǎn)便易行。將裝有5 mg NTCD的粉末和載玻片放入真空封口的試管后，置于馬弗爐中，使用P型8步斜坡PID溫度程控器設(shè)置程序加熱，開始斜坡升溫的溫度設(shè)置為35 ℃，相對(duì)功率修正系數(shù)為1，最大相對(duì)功率70%,移相步幅上限10%，升溫速度5 ℃/min，600 ℃恒溫加熱1 h。

1.2.2納米材料的表征待馬弗爐程序加熱結(jié)束后，在玻璃管中取出載玻片，室溫冷卻，進(jìn)行電子顯微鏡掃描；從載玻片上刮下納米材料，用干燥的KBr壓片，進(jìn)行傅立葉變換紅外光譜掃描，掃描范圍是500～4 000 cm-1；刮下納米材料后，用超聲乙醇溶解，儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用F-4 600型熒光光度計(jì)、狹縫寬度10/10 nm測(cè)定其熒光強(qiáng)度；用12.5 mm厚度石英比色皿在UV-1 800紫外-可見分光光度計(jì)掃描紫外光譜。

1.2.3不同物質(zhì)對(duì)NTCD納米材料的熒光猝滅掃描將納米材料從玻璃片刮下,與少量乙醇混合后,超聲溶解直至溶液透明,乙醇定容至100 mL,NTCD濃度為0.28 μg/mL。移取1 mL 0.28 μg/mL NTCD,置于10 mL比色管中，依次分別加入1.0×10-5mol/L的金屬離子Ca2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Co2+、Fe3+和葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、蘇丹Ⅲ、溶菌酶、牛血清蛋白、咖啡因、三聚氰胺、三聚氰酸、茶多酚等化合物溶液1 mL，2 mL 的pH=5.27三酸緩沖溶液，用乙醇定容至刻度，在F-4600型熒光光度計(jì)上、用1 cm熒光比色皿、狹縫寬度10/10 nm，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為λex/λem=389/498 nm測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化值ΔF(ΔF=F0-F)。

1.2.4樣品處理按文獻(xiàn)方法[13]略有改進(jìn)：稱取0.2 g奶粉樣品于比色管中，依次加入5.0 mL 1%三氯乙酸和2.0 mL乙睛，超聲30 min，使蛋白質(zhì)沉淀，溶液以9 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，收集濾液于25 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，樣品待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米材料掃描電鏡和透射電鏡圖

由圖1、圖2對(duì)比可知，掃描電鏡(SEM)顯示NTCD原料呈塊狀結(jié)構(gòu)，納米材料主要形成帶狀結(jié)構(gòu)，直徑約在80～200 nm左右，長(zhǎng)度大約為5～10 μm。納米材料的透射電鏡圖見圖3。

圖1 NTCD原料掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM image of NTCD raw materialsConditions:thermal vacuum vapor deposition;heating temperature and time:600 ℃,1 hour.

圖2 NTCD納米材料的掃描電鏡圖Fig.2 SEM image of NTCD nanomaterialsConditions:thermal vacuum vapor deposition;heating temperature and time:600 ℃,1 hour.

2.2 納米材料紅外光譜

紅外光譜測(cè)定顯示，形成納米結(jié)構(gòu)后，NTCD中C=C鍵伸展和C-H彎曲振動(dòng)減弱。原料及納米材料的C=O的吸收峰均在1 652 cm-1處，形成納米結(jié)構(gòu)后，由于NTCD分子的N—H和C=O形成了分子間氫鍵，吸收峰變?nèi)?，?qiáng)度降低。NTCD分子是平面分子，分子中游離的π電子與相鄰分子π-π鍵疊加，氫鍵網(wǎng)絡(luò)的形成使得二酰亞胺聚集，在真空條件下蒸發(fā)沉積而形成了納米帶。

2.3 熒光光譜與紫外光譜分析

測(cè)定NTCD原料溶液激發(fā)與發(fā)射熒光光譜，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為λex/λem=336/375 nm、397 nm,形成納米結(jié)構(gòu)后激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)有較大的變化，分別為λex/λem=389/498 nm,如圖4所示。納米溶液的熒光激發(fā)、發(fā)射光譜顯著紅移，這可能與NTCD形成納米結(jié)構(gòu)后，其分子間氫鍵作用、π-π重疊導(dǎo)致電子云活動(dòng)范圍增大，熒光發(fā)射增強(qiáng)。紫外吸收測(cè)定(圖略)表明，納米材料與原料比較，不僅紫外吸收明顯增強(qiáng),且最大吸收波長(zhǎng)由原料342 nm藍(lán)移至291 nm。納米結(jié)構(gòu)的典型特征就是量子尺寸效應(yīng)，當(dāng)粒子尺度下降到某一數(shù)值時(shí)，費(fèi)米能級(jí)附近的電子能級(jí)由準(zhǔn)連續(xù)變?yōu)殡x散能級(jí)或者能隙變寬的現(xiàn)象，它的直接表現(xiàn)就是在紫外吸收光譜中吸收藍(lán)移。

圖3 NTCD納米材料的透射電鏡(TEM)圖Fig.3 TEM of NTCD nanomaterialsConditions:thermalvacuum vapor deposition;heating temperature and time:600 ℃,1 hour.

圖4 NTCD 原料與納米材料的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of NTCD raw and nanomaterials 1,2:Fluorescence excitation and emission of NTCD raw materials;3,4:Fluorescence excitation and emission of NTCD nanomaterials;Measurement conditions:NTCD concentration of 0.28 μg/mL;pH=5.27;slits:10/10 nm；1 cm quartz cell.

2.4 NTCD納米熒光探針的傳感應(yīng)用

研究NTCD納米熒光探針對(duì)Ca2+、Mg2+、AI3+、Zn2+、Co2+、Fe3+等金屬離子和葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、蘇丹Ⅲ、溶菌酶、牛血清蛋白、咖啡因、三聚氰胺、三聚氰酸、茶多酚等化合物的識(shí)別作用，結(jié)果如圖5所示。納米探針對(duì)三聚氰胺具有極高的選擇性和靈敏度，而對(duì)其它金屬離子及其化合物響應(yīng)較弱(F為加入不同猝滅劑的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為NTCD納米材料的熒光強(qiáng)度)。

2.5 pH對(duì)NTCD熒光探針的影響

取NTCD納米材料溶液1 mL，分別定量加入1.0×10-5mol/L三聚氰胺溶液與pH為2.33、4.06、6.61、8.20、10.30的緩沖溶液2 mL，定容到10 mL。研究其熒光強(qiáng)度變化值ΔF(ΔF=F0-F)，結(jié)果如圖6所示?？梢娂尤脞鐒┤矍璋?，pH在酸性范圍內(nèi)ΔF有增大趨勢(shì)且較穩(wěn)定，故選用pH值為5.27三酸緩沖液控制體系pH。

圖5 納米熒光探針對(duì)測(cè)定對(duì)象的選擇性Fig.5 Selectivity of fluorescence nanoprobe to determined target Measurement conditions:1 mL 0.28 μg/mL NTCD;pH=5.27;added volume and concentration of metal ions and others:1 mL 1.0×10-5 mol/L,respectively.λex/λem=389/498 nm,slits:10/10 nm，1 cm quartz cell.

圖6 不同pH對(duì)納米探針熒光猝滅影響Fig.6 Fluorescence quenching effect of nano probe at different pHMeasurement conditions:1 mL 0.28 μg/mL NTCD and 1 mL 1.0×10-5 mol/L melamine.λex/λem=389/498 nm,slits:10/10 nm，1 cm quartz cell.

2.6 測(cè)定時(shí)間的影響

取NTCD溶液1 mL，分別加入1.0×10-5mol/L三聚氰胺1 mL，定容至10 mL,然后分別放置0、30、60、90、120 min，研究測(cè)定時(shí)間的影響。結(jié)果表明，放置時(shí)間對(duì)ΔF影響較小，說明NTCD納米材料隨時(shí)間變化較比較穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)選擇30 min為測(cè)量時(shí)間。

2.7 干擾試驗(yàn)

在前述實(shí)驗(yàn)條件下，結(jié)合2.4節(jié)實(shí)驗(yàn)，不同金屬離子、有機(jī)物質(zhì)分子對(duì)測(cè)定三聚氰胺的干擾測(cè)定。結(jié)果表明，各種共存物質(zhì)允許量(倍量，相對(duì)誤差為≤±5%)如下：葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸(50)；金屬離子Ca2+、Mg2+、AI3+、Zn2+、Sn2+(30)；Cl-、Ac-(30);Co2+(15)；三聚氰酸、茶多酚(15)；Fe3+(10)；溶菌酶、牛血清蛋白、咖啡因(10)。

圖7 三聚氰胺對(duì)NTCD納米探針熒光猝滅光譜Fig.7 Fluorescence quenching spectra of NTCD 1→10:8.0×10-7,1.0×10-6,2.0×10-6,4.0×10-6,6.0×10-6,8.0×10-6,1.0×10-5,2.0×10-5,4.0×10-5,6.0×10-5 mol/L,respectively.

2.8 工作曲線及精密度測(cè)定

按照實(shí)驗(yàn)方法，加入不同濃度三聚氰胺溶液進(jìn)行測(cè)定，熒光猝滅光譜見圖7。結(jié)果表明，三聚氰胺濃度在8.0×10-7～4.0×10-5mol/L范圍內(nèi)-lgc與熒光強(qiáng)度變化的lgΔF呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：lgΔF=-0.087lgc+2.67，相關(guān)系數(shù)：R2=0.994，檢出限為1.33×10-8mol/L(相當(dāng)于1.67×10-6g/L),方法優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中色譜法與質(zhì)譜法的檢出限。按實(shí)驗(yàn)方法，取10份含1.0×10-6mol/L三聚氰胺溶液測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.51%。

2.9 樣品分析

采用前述1.2.4樣品處理方法，分別對(duì)市售的兩種奶粉樣品按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行前處理，然后進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種奶粉中均含有三聚氰胺。實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果及加標(biāo)回收率結(jié)果如表1所示。樣品回收率在96%～104.5%之間，表明該分析方法具有較好的重現(xiàn)性和可靠性。

表1 樣品中三聚氰胺的測(cè)定結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了一種NTCD納米材料熒光猝滅法快速測(cè)定奶粉中三聚氰胺含量的新方法。三聚氰胺在8.0×10-7～4.0×10-5mol/L的線性范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度變化呈良好的線性關(guān)系，檢出限為1.33×10-8mol/L，RSD為2.51%。該方法簡(jiǎn)便、快速，對(duì)食品中三聚氰胺的檢測(cè)具有一定的參考價(jià)值。