改進QuEChERS-濃H2SO4凈化-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用檢測貝類中多溴聯(lián)苯醚

孫曉杰， 周明瑩， 丁海燕， 盧立娜， 邢麗紅， 李兆新*, 劉 瑩， 吳 薇， 翟毓秀

(1.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室,中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點開放實驗室, 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；3.青島市海洋科技成果推廣中心，山東青島 266071)

多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers,PBDEs)是一種溴系阻燃劑，廣泛用于電子產(chǎn)品、紡織等工業(yè)領(lǐng)域[1]。PBDEs在生產(chǎn)、使用過程中易通過蒸發(fā)、滲漏等途徑進入環(huán)境，因具有親脂性、持久性和生物累積性，在環(huán)境中難降解，屬于持久性有機污染物[2]。其中2,4,4′-三溴聯(lián)苯醚(BDE-28)、2,2′,4,4′-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)、2,2′,4,4′,5-五溴聯(lián)苯醚(BDE-99)、2,2′,4,4′,6-五溴聯(lián)苯醚(BDE-100)、2,2′,4,4′,5,5′-六溴聯(lián)苯醚(BDE-153)、2,2′,4,4′,5,6′-六溴聯(lián)苯醚(BDE-154)、2,2′,3,4,4′,5′,6-七溴聯(lián)苯醚(BDE-183)和十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)8種PBDEs在食品中的污染問題最為嚴重，稱為指示性單體。研究表明，PBDEs 可通過食物鏈富集，對生物體具有潛在毒性，會導致動物肝臟腫大,影響腦部、生殖器官和神經(jīng)行為的發(fā)育等，另外可能具有內(nèi)分泌干擾作用[3-4]，受到國內(nèi)外科學研究者廣泛關(guān)注[5-6]。因此,建立有效檢測食品中PBDEs的方法，對食品安全和人體健康風險評估具有重要意義[7]。

目前針對PBDEs的前處理方法主要有索氏提取法、液-液萃取法等傳統(tǒng)方法，以及加速溶劑萃取法和超聲波輔助提取法等新型提取方法。但由于生物體等基質(zhì)復雜，需要結(jié)合中性氧化鋁，中性硅膠，堿性硅膠，酸性硅膠等多層凈化材料或填充柱，才能實現(xiàn)提取液的較好凈化[8-10]。本研究選擇8種指示性多溴聯(lián)苯醚BDE-28、BDE-47、BDE-99、BDE-100、BDE-153、BDE-154、BDE-183和BDE-209作為研究對象，采用正己烷-丙酮混合有機溶劑提取，無水Na2SO4干燥、新型油脂凈化粉等改進QuEChERS技術(shù)，并結(jié)合H2SO4氧化凈化技術(shù)，實現(xiàn)了貝類樣品中多溴聯(lián)苯醚的高效前處理。選用薄液膜、短柱長的DB-5MS毛細管柱(15 m×0.25 mm×0.10 μm)，結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)技術(shù)，實現(xiàn)了貝類樣品中低溴代及高溴代聯(lián)苯醚的同時快速定性和定量分析，該方法各組分峰分離度大、峰形較好，靈敏度高。方法已應(yīng)用于我國實際海水養(yǎng)殖區(qū)貝類中多溴聯(lián)苯醚的風險監(jiān)測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

6890-5973氣/質(zhì)聯(lián)用儀(美國，安捷倫公司);Talboys型旋渦混合器(上海安譜科學儀器有限公司)；BT224S分析天平(法國，Sartorius公司)；N-EVAPTM112型氮氣吹掃儀(美國，Organomation公司)。

PBDEs混合標準溶液(溶劑為異辛烷)，包括美國環(huán)境保護署(EPA)1614草案中優(yōu)先關(guān)注的8種BDE單體：BDE-28、BDE-47、BDE-100、BDE-99、BDE-154、BDE-153、BDE-183和BDE-209。其中BDE-209質(zhì)量濃度為200 μg/mL，其余單體的質(zhì)量濃度均為20 μg/mL?；旌蠘藴适褂靡海簻蚀_吸取一定量BDE混合標準溶液，用異辛烷稀釋配成1 μg/mL(BDE-209為10 μg/mL)的混合溶液，避光4 ℃ 冷藏保存。內(nèi)標物：2,2′,3,3′,4,4′,5,5′,6,6′-十氯聯(lián)苯(PCB209)，用異辛烷配制成100 ng/mL。以上藥品均購于美國AccuStandard 公司。正己烷、丙酮(色譜純，Merk公司)，其他試劑皆為分析純。EMR-Lipid 凈化粉(Agilent公司)；層析硅膠(60～200目，上海安譜科學儀器有限公司)；酸化硅膠粉(將層析硅膠與濃H2SO4以質(zhì)量比2∶1混合均勻，攪拌無塊后使用)；中性氧化鋁粉(100～200目，美國Sigma-Aldrich公司)。實驗用水由Milli-Q純水儀(美國Millipore公司制備)。

1.2 樣品處理

1.2.1制樣貝類去殼，取可食部分，切為不大于0.5×0.5×0.5 cm小塊后，均質(zhì)混勻，置于-18 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2提取將貝類樣品取可食部分勻漿，冷凍干燥后用研缽研碎，稱取試樣5 g(精確到0.01 g)，置于50 mL具塞離心管中，加入內(nèi)標標準工作液100 μL；同時加入10 mL水，2 g NaCl，20 mL正己烷-丙酮溶液(1∶1)渦旋萃取10 min，4 000 r/min離心5 min，將提取液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管。再加入10 mL正己烷-丙酮溶液(1∶1，V/V)重復提取一次，合并提取液于同一離心管中。

1.2.3凈化(1)分散固相萃取凈化:向上述提取液中加入5 g無水Na2SO4，2 g EMR-Lipid 凈化粉。渦旋2 min后,4 000 r/min離心5 min，上清液氮氣吹干(40 ℃以內(nèi))。(2)H2SO4凈化：將上述產(chǎn)品進一步凈化，1 mL正己烷溶解后轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，加入200 μL濃H2SO4，渦旋離心后(8 000 r/min,5 min)，取上清液至另一5 mL離心管中，加入1 mL2%Na2SO4溶液清洗至無色，取上清液氮氣吹干后，0.5 mL正己烷定容，待測。

1.3 儀器條件

GC條件：DB-5MS 色譜柱(15 m×0.25 mm×0.10 μm)；進樣口溫度：280 ℃；載氣：He氣，流速1.0 mL/min；升溫程序：90 ℃保持1 min，10 ℃/min速率升溫至330 ℃，保持5 min；進樣量：1 μL。

MS條件：電子轟擊源(EI)，選擇離子掃描模式(SIM)監(jiān)測；電離能量為70 eV；接口溫度為300 ℃，離子源溫度為230 ℃，溶劑延遲時間5 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1提取方式優(yōu)化PBDEs類化合物極性較小，實驗分別考察了正己烷、丙酮、乙腈以及正己烷-丙酮(1∶1，V/V)四種溶劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙腈對目標物的提取率較高，但引入雜質(zhì)干擾較大；正己烷對極性較大的多溴聯(lián)苯醚提取率不理想；而正己烷-丙酮(1∶1，V/V)對整體提取率最好。采用該混合有機溶劑兩次提取，8種多溴聯(lián)苯醚類的提取效率都達到了80%以上。

2.1.2凈化方式優(yōu)化對于水產(chǎn)樣品，需要去除類脂質(zhì)等雜質(zhì)。本研究通過有機溶劑提取后，經(jīng)過分散固相萃取和新型油脂吸附劑(EMR-Lipid)凈化等QuEChERS技術(shù)，結(jié)合濃H2SO4氧化凈化，能夠更好的降低基質(zhì)干擾。在分散固相萃取過程，先加入無水Na2SO4除去提取液中的水分，然后對比使用酸性硅膠粉、硅膠粉和中性氧化鋁粉等復合凈化材料與EMR-Lipid 凈化粉的效果，發(fā)現(xiàn)EMR-Lipid 凈化粉效果優(yōu)于復合凈化材料，且不需要提前制備，操作簡單。對于雜質(zhì)較多的樣品基質(zhì)，繼續(xù)將上述產(chǎn)品用正己烷溶解后，進一步用濃H2SO4氧化除雜，再加入Na2SO4溶液清洗過量的H2SO4，上清液氮氣吹干后定容，供氣/質(zhì)聯(lián)用儀測定。

圖1 PBDEs標準溶液的選擇離子(SIM)色譜圖Fig.1 SIM chromatogram of PBDEs standard solution(BDE-209 concentration was 1.0 μg/mL,the others were 100 ng/mL)

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1色譜條件優(yōu)化由于8種多溴聯(lián)苯醚中存在兩組同分異構(gòu)體(BDE-100和BDE-99,BDE-154和BDE-153),它們的定量和定性離子均相同，對于這類異構(gòu)體要求在色譜上完全分離，否則會影響定量的準確性。為了使目標化合物峰在最短的時間內(nèi)完全分開，需使用程序升溫。此外，高溴代化合物BDE-209等在色譜柱內(nèi)保留較強，儀器響應(yīng)較低，通過改變程序升溫和進樣口、檢測器的溫度可以調(diào)節(jié)其響應(yīng)值。考慮儀器和色譜柱的最大耐受溫度，最終設(shè)定進樣口溫度為280 ℃，質(zhì)譜接口溫度為300 ℃。并優(yōu)化確定了程序升溫條件，8種PBDEs得到較好的分離，且峰形對稱好。PBDEs標準溶液的選擇離子色譜圖見圖1。

2.2.2質(zhì)譜條件優(yōu)化通過全掃描方式(SCAN)在m/z400～1000范圍內(nèi)分析PBDEs 標準溶液，在質(zhì)譜庫中進行定性檢索，確定PBDEs各組分的保留時間和分子離子，查看標準質(zhì)譜圖，選擇豐度相對較高、相對分子質(zhì)量較大和干擾較少的碎片離子作為定性和定量的特征目標離子(表1)。8種多溴聯(lián)苯醚類皆以PCB-209為內(nèi)標物質(zhì)，以定量目標離子的峰面積比較，采用內(nèi)標法定量。

表1 多溴聯(lián)苯醚相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)

*Quntification ion.

2.3 檢出限、回收率和精密度

在優(yōu)化實驗條件下，用異辛烷配制系列濃度的標準溶液。以每種目標物定量離子的峰面積與其質(zhì)量濃度作標準曲線。從表2可以看出，8種多溴聯(lián)苯醚類在對應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。本文采用向空白貝類樣品中添加標準溶液的方法，得到方法對8種多溴聯(lián)苯醚類的檢出限(LOD，S/N>3)，除BDE-209為1.0 μg/kg，其余為0.1 μg/kg，定量限(LOQ，S/N>10)，除BDE-209為3.0 μg/kg，其余為0.3 μg/kg，回收率在90.0%～120%之間，相對標準偏差(RSD)皆小于10%。說明方法的準確度和靈敏度較高，重現(xiàn)性好，適合于貝類樣品中多溴聯(lián)苯醚類殘留的同時檢測。

空白和加標樣品的選擇離子色譜圖見圖2。

2.4 樣品測定

采用本方法分析了來自膠州灣海域的20多個貝類樣品。結(jié)果表明，樣品中皆有不同含量的BDE28、BDE-47、BDE-183被檢出，總量范圍為0.222～2.46 μg/kg，含量較低，表明此海域受到輕度污染。

表2 貝類樣品中多溴聯(lián)苯醚類添加回收實驗(n=6)

圖2 空白和貝類加標樣品的選擇離子(SIM)色譜圖 Fig.2 SIM chromatograms of blank(A) and PBDEs spiked shellfish samples(B)BDE-209 concentraion was 50 μg/kg,others were 5.0 μg/kg.

3 結(jié)論

本方法實現(xiàn)了貝類樣品中低溴代及高溴代聯(lián)苯醚的同時快速定性和定量分析。樣品加標回收率在90.0%～120%之間，相對標準偏差皆小于10%，說明方法的準確性和靈敏度較高，重現(xiàn)性好，且方法操作簡便、高效、易于普及，適合于貝類樣品中多溴聯(lián)苯醚類殘留的同時檢測以及不同海水養(yǎng)殖區(qū)貝類中多溴聯(lián)苯醚類的風險監(jiān)測。