肉桂酸芐酯分子印跡膜電化學傳感器的制備

徐 慧， 張銀志， 孫秀蘭， 張入元

(1.寧波方太廚具有限公司，浙江寧波 315336；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122；3.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

肉桂酸芐酯(Benzyl cinnamate，3-Phenyl-2-propenoic acid phenylmethyl ester)是一種酯類合成香料，主要采用酯化法和縮合法進行合成，大多存在蘇合香脂、妥盧香脂和秘魯香脂等[1]，具有蘇合香膏香香氣[2]，主要用作東方型香精及人造古龍涎香的定香劑，也可用作香皂香料[3 - 4]。但是肉桂酸芐酯是一種香味過敏原[5]，能引起易過敏人群的化妝品皮膚病[6]，所以開發(fā)針對化妝品中痕量肉桂酸芐酯的分析檢測方法具有非常重要的現實意義。

目前對于化妝品中過敏原的檢測方法主要有斑貼試驗[7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜-質譜法[9]、高效液相色譜法[10]等。斑貼試驗是診斷化妝品過敏的重要手段。靳云霞通過斑貼試驗研究360例皮膚過敏患者皮炎和濕疹的過敏原因，結果顯示硫酸鎳、芳香物質、松香以及對苯二胺等致敏性較高即抗原陽性率較高[11]。香精香料等芳香物質過敏原主要是通過高效液相色譜法和氣-質聯(lián)用技術進行檢測。王超等[12]通過毛細管氣相色譜-質譜法測定了化妝品中16種香精香料，該方法樣品用量少，靈敏度和準確度高，前處理簡單，可同時測定化妝品中16種香精香料。

但是我國的化妝品質量檢測手段和安全性評價體系依然不夠完善[13]，檢測水平落后，化妝品質量安全保障相關技術能力有待提高。分子印跡電化學傳感器具備高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點，便于自動化和現場檢測使用，檢測成本低，已成為研究熱點[14 - 15]。本研究以對巰基苯胺為單體，肉桂酸芐酯為模板分子，采用電聚合法制備分子印跡聚合物膜，構建了基于對巰基苯胺-金納米粒子的肉桂酸芐酯分子印跡膜電化學傳感器檢測方法，實現了對化妝品樣品中痕量肉桂酸芐酯的定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

CH1760電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)；PB400-4型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KQ-100E超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；s-4800掃描電子顯微鏡(日本，日立公司)。

肉桂酸芐酯(Benzyl Cinnamate)、苯甲酸芐酯(Benzyl Benzoate)、水楊酸芐酯(Benzyl Salicylate)，購于百靈威科技有限公司；對巰基苯胺(p-ATP)、四丁基高氯酸銨(TBAP)，購于Sigma公司；HAuCl4、K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]、KCl，購于國藥集團；其他試劑均為分析純。實驗用水為自制超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1肉桂酸芐酯分子印跡電極的制備電極預處理：將Au電極(Φ=2 mm)置于新鮮配制的10 mL Prianha 溶液中浸泡15 min，超純水清洗，之后分別用0.3、0.05 μm Al2O3進行拋光處理，接著依次在無水乙醇和超純水中超聲清洗，氮氣吹干后，在2.5 mmol/L K3[Fe(CN)6]電解液中，于-0.2～0.6 V電位范圍內，以100 mV/s的速率進行循環(huán)伏安法掃描，最后在0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.4)中，以100 mV/s的速率在-0.2～0.6 V電位范圍內進行循環(huán)伏安法掃描對電極進行活化，以得到穩(wěn)定的電流響應。肉桂酸芐酯分子印跡膜制備過程：Au電極表面制備肉桂酸芐酯分子印跡聚合膜過程如圖1所示，分為以下幾步：(1)對巰基苯胺自組裝：將Au電極置于20 mmol/Lp-ATP乙醇溶液中，室溫浸泡24 h，之后用無水乙醇和超純水徹底清洗以去除未吸附的對巰基苯胺，氮氣吹干，備用。(2)肉桂酸芐酯的氫鍵吸附：將p-ATP自組裝后的Au電極浸入含有10 mmol/L肉桂酸芐酯的無水乙醇溶液中氫鍵吸附4 h，用無水乙醇和超純水清洗后，氮氣吹干，備用。(3)電化學聚合：將p-ATP和肉桂酸芐酯組裝后的電極浸入10 mL含2 mmol/L肉桂酸芐酯，5 mmol/L 對p-ATP，0.2 g/L HAuCl4，50 mmol/L TBAP的無水乙醇溶液中,采用循環(huán)伏安法掃描，掃描電位范圍為-0.3～1.0 V，掃描速度為50 mV/s，掃描次數為12次。(4)模板分子的去除：將電聚合后的電極用無水乙醇和超純水清洗后，浸入含0.2 mol/L HCl的乙醇-水(9∶1,V/V)的溶液中25 min以除去肉桂酸芐酯膜板分子，之后依次用無水乙醇和超純水進行清洗，氮氣吹干，備用。

圖1 Au電極表面肉桂酸芐酯分子印跡聚合膜的制備過程Fig.1 Preparation procedure for the benzyl cinamate-imprinted polymer film on a Au electrode

非分子印跡聚合物膜的制備過程除不加模板分子肉桂酸芐酯外，其他均與印跡聚合物膜的制備過程相同。

1.2.2電化學測定電化學工作站采用三電極工作體系，工作電極為自制的分子印跡膜電極，參比電極為甘汞電極，對電極為鉑絲電極，電解質溶液為含0.1 mmol/L KCl 的2.5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液。循環(huán)伏安(CV)測定條件：電位范圍為-0.2～0.6 V，掃描速度為100 mV/s，差分脈沖伏安(DPV)測定條件：初始電位0.6 V，終止電位-0.2 V，電位增量0.004 V，振幅0.05 V，脈沖寬度0.05 s，采樣寬度0.0167 s，脈沖周期0.2 s。交流阻抗(EIS)測定條件：初始電位0.2 V，高頻100 000 Hz，低頻1 Hz，振幅0.005 V，靜止時間2 s。

1.2.3分子印跡膜傳感器用于樣品測定以從無錫歐尚超市購買的多芬洗發(fā)水為樣品(液相色譜分析未檢出肉桂酸芐酯)，進行基質添加回收率試驗。準確稱取1.0 g樣品，添加濃度為10、100、1 000 pmol/L的肉桂酸芐酯，加入6 mL乙腈超聲提取15 min，5 000 r/min離心10 min，取上清過0.2 μm微孔薄膜過濾，濾液用氮氣吹干并用無水乙醇復溶，采用分子印跡膜傳感器進行電化學分析。

2 結果與討論

2.1 肉桂酸芐酯分子印跡膜傳感器制備方法及機理

本實驗采用自組裝和電聚合方法制備分子印跡聚合物膜，以含有-SH和-NH2的p-ATP為功能單體，p-ATP的-SH與Au電極表面通過Au-S鍵結合，從而形成一層穩(wěn)定的自組裝單體膜。肉桂酸芐酯模板分子中的-OH與p-ATP的-NH2通過氫鍵作用力相結合，模板分子的氫鍵吸附增加了有效結合位點的數量，提高了分子印跡傳感器的靈敏度。在電聚合的過程中，HAuCl4被還原成Au納米粒子，作為交聯(lián)劑與被氧化的p-ATP聚合，形成聚巰基苯胺-Au納米粒子復合導電膜。在肉桂酸芐酯模板分子的存在下，可以將模板分子固定在分子印跡膜中。通過物理或化學方法將被固定的模板分子除去，從而在聚合物中形成了與模板分子在空間和結合位點上相匹配的具有多重作用位點的空穴，這樣的空穴對模板分子具有特異性的選擇性。本研究利用乙醇和HCl去除固定的肉桂酸芐酯模板分子。

2.2 分子印跡膜的電聚合

肉桂酸芐酯分子印跡膜電聚合液由含有2 mmol/L的肉桂酸芐酯，5 mmol/Lp-ATP，0.2 g/L HAuCl4，50 mmol/L TBAP的無水乙醇溶液組成。分子印跡膜的電化學循環(huán)伏安聚合圖如圖2A所示。在第一圈循環(huán)伏安掃描過程中，在0.917 V電位處出現了一個氧化峰，并隨著掃描次數的增加逐漸減小并趨于穩(wěn)定。這說明p-ATP聚合物膜沉積在了電極表面，電子傳輸能力減弱，電流下降。圖3是分子印跡聚合物膜的掃描電鏡圖，電極表面上不規(guī)則的顆粒也從側面說明聚合物膜成功的沉積在了電極表面。

作為對照，在非分子印跡膜的電聚合過程中，其循環(huán)伏安掃描圖(圖2B)與印跡膜電聚合掃描圖幾乎相同，說明在選定的電聚合電勢范圍內，肉桂酸芐酯不存在電化學活性，不會影響其化學穩(wěn)定性，因而可以在電聚合過程中完整的固定于分子印跡膜中。

圖2 印跡膜(A)和非印跡膜(B)的電聚合循環(huán)伏安掃描圖Fig.2 Cyclic voltammograms of imprinted film (A) and non-imprinted film (B) obtained during electro-polymerizationpotential range:-0.3 - 1.0 V;scan rate:50 mV/s;scan cycles:12.

2.3 分子印跡膜電極的電化學表征

圖3 分子印跡聚合物的掃描電鏡(SEM)圖Fig.3 SEM image of molecular imprinted polymer

為了研究Au電極在修飾前后的變化，采用循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法、交流阻抗法，以[Fe(CN)6]3-/4-為探針進行電化學表征。實驗結果如圖4所示。裸Au電極(圖4A曲線a)與表面電化學沉積肉桂酸芐酯分子印跡聚合物膜Au電極(圖4A曲線c)的循環(huán)伏安曲線相比，在聚合后的電極上，觀察不到[Fe(CN)6]3-/4-的氧化還原峰。這說明聚合物膜沉積在了電極表面，使[Fe(CN)6]3-/4-無法擴散到Au電極表面。當洗脫去除肉桂酸芐酯模板分子后，出現了[Fe(CN)6]3-/4-的氧化還原峰(圖4A曲線b)。但是和裸電極相比，在洗脫后的電極上的氧化還原電位差增大并且峰電流減小。

在差分脈沖伏安圖(圖4B)中，[Fe(CN)6]3-/4-在裸Au電極上的氧化峰電流為64.8 μA。在修飾后的電極上，氧化峰電流幾乎為零。而當模板去除后，[Fe(CN)6]3-/4-的氧化峰電流增大到40.08 μA。這也說明電極表面沉積上分子印跡聚合物膜并且成功洗脫掉了模板分子。圖4C為裸電極以及印跡膜電極在洗脫前后的交流阻抗圖。在電極表面沉積上印記膜之后，阻抗值急劇增大(圖4C曲線c)。洗脫掉模板分子后，阻抗值明顯降低(圖4C曲線c)，但比裸電極(圖4C曲線a)的阻抗值大。這與圖4A和圖4B中峰電流值的變化相一致。

圖4 裸Au電極(a)、去除模板后(b)和去除模板前(c)的電極在[Fe(CN)6]3-/4-中的循環(huán)伏安(CV)圖(A)、差分脈沖伏安(DPV)圖(B)和交流阻抗(EIS)圖(C)Fig.4 (A) CVs,(B) DPVs and(C) EIS of [Fe(CN)6]3-/4- at(a) bare Au electrode,MIP sensor after(b) and before(c) template removal

作為對照，對于非印跡膜修飾電極，在相同條件下對其在[Fe(CN)6]3-/4-中的循環(huán)伏安、差分脈沖伏安、交流阻抗行為進行了電化學表征，如圖5所示。在裸Au電極圖(5A曲線a)上，[Fe(CN)6]3-/4-呈現出一對明顯的準可逆氧化還原峰。但是在非印跡膜沉積在電極圖(5A曲線c)表面后，氧化還原峰消失并且洗脫后的電極(5A曲線b)的循環(huán)伏安圖幾乎沒有變化。這是因為在肉桂酸芐酯不存在的條件下，在電極表面形成的非印跡膜沒有可以結合的位點，在洗脫過程中去除的沒有發(fā)生聚合反應的對p-ATP導致了可以忽略的峰電流的微小變化。這表明非印跡膜電極對肉桂酸芐酯沒有選擇識別性能力。

非印跡膜電極在洗脫前后的電流值(圖5B)和阻抗值(圖5C)幾乎沒有變化，這也證明了在印記膜的沉積過程中，模板分子被有效的固定于印跡膜中，并在洗脫后，形成了[Fe(CN)6]3-/4-電化學探針可以通過的通道。

圖5 裸Au電極(a)、去除模板后(b)和去除模板前(c)的非印跡膜電極在[Fe(CN)6]3-/4-中的循環(huán)伏安(CV)圖(A)、差分脈沖伏安(DPV)圖(B)和交流阻抗(EIS)圖(C)Fig.5 (A) CVs,(B) DPVs and(C) EIS of [Fe(CN)6]3-/4- at(a) bare Au electrode,NIP sensor after(b) and before(c) template removal

2.4 印跡膜電極對肉桂酸芐酯的響應能力

沉積在Au電極表面的肉桂酸芐酯分子印跡膜去除模板分子后，在表面或內部形成了可以與模板分子特異性結合的空穴。而電化學探針[Fe(CN)6]3-/4-可以通過這些空穴到達Au電極表面，發(fā)生氧化還原反應。當含有肉桂酸芐酯的溶液滴加到電極表面時，便會與這些空穴結合，阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-探針在底液和電極表面間的氧化還原反應，致使電極電流發(fā)生變化。根據分析物濃度和電流變化的關系，可以實現肉桂酸芐酯的定量分析檢測。

圖6 印跡膜電極在不同濃度的肉桂酸芐酯中孵育6 min后的差分脈沖伏安(DPV)響應Fig.6 DPV response of the imprinted electrode incubated in different concentrations of benzyl cinnamate for 6 minc(a-g):1.0×10-11 - 1.0×10-8 mol/L,inset:the calibration curve.

在優(yōu)化的實驗條件下，將不同濃度的肉桂酸芐酯標準溶液滴加到電極表面，孵育6 min，然后于含有2.5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L PBS中進行差分脈沖伏安掃描，結果如圖6所示。隨著肉桂酸芐酯濃度的增加，DPV響應逐漸降低，即電流逐漸減小(圖6A)，并且DPV響應和肉桂酸芐酯在1.0×10-11～1.0×10-8mol/L濃度范圍內呈線性關系(圖6B)，線性方程為:Ip=-9.5452lgc-68.776(Ip：μA,c:mol/L)，其線性相關系數R2為0.9915。由曲線斜率可求得當信噪比為3時，該方法的檢測限為2.9 pmol/L。

2.5 分子印跡膜電極的選擇識別能力

圖7 分子印跡傳感器的選擇性Fig.7 Selectivity of the molecularly imprinted sensorDPV response of the imprinted electrode in control,1.0×10-8 mol/L benzyl cinnamate,benzyl benzoate and benzyl salicylate.

實驗選擇肉桂酸芐酯的結構類似物，以及常見共存芳香類過敏原苯甲酸芐酯和水楊酸芐酯作為競爭結合底物，用以評價分子印跡膜電極的特異性選擇識別能力。將相同濃度(1.0×10-8mol/L)的肉桂酸芐酯、苯甲酸芐酯、水楊酸芐酯分別滴加到印跡膜電極上孵育6 min，觀察其在[Fe(CN)6]3-/4-中的DPV響應，結果如圖7所示。在空白溶液中，印跡膜電極的DPV響應為39.1 μA。而在肉桂酸芐酯溶液中孵育6 min后，DPV響應顯著降低，電流減小到7.12 μA。但是在苯甲酸芐酯、水楊酸芐酯溶液中，DPV電流降低很小，電流值分別為38.52 μA和38.1 μA。說明印跡膜電極不能識別苯甲酸芐酯和水楊酸芐酯。

2.6 印跡膜電極的再生性和穩(wěn)定性評價

將5根印跡膜電極在1.0×10-8mol/L的肉桂酸芐酯溶液中孵育6 min后，其DPV電流值的相對標準偏差(RSD)為3.21%。當同一根印跡膜電極在10-8mol/L 的肉桂酸芐酯溶液中孵育和洗脫20次后，依舊有良好的電流響應(RSD=2.97%)。這說明印跡膜電極有很好的再生性和可逆性。

當修飾電極在室溫下放置一周后，其峰電流幾乎沒有變化。放置一個月后，其峰電流值降低到原來的74.8%。這些結果說明印跡膜電極具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 印跡膜電極在洗發(fā)水實際樣品中的應用能力評價

以當地超市購買的洗發(fā)水樣品考察印跡膜電極的實際應用可行性。樣品經液相色譜分析未檢出肉桂酸芐酯。樣品中肉桂酸芐酯的添加濃度為10、100、1 000 pmol/L，經處理后進行電化學分析。其添加回收率范圍為97.4%～99.84%，RSD為2.92%～3.51%，表明該分子印跡傳感器具有良好的實際樣品應用檢測能力，可以準確地對復雜樣品中的痕量肉桂酸芐酯進行定量分析。

3 結論

通過自組裝和電沉積的方法在Au電極表面制備了能夠特異性結合肉桂酸芐酯的分子印跡膜電化學傳感器，構建了一種以[Fe(CN)6]3-/4-為電化學探針，采用差分脈沖伏安法間接測定化妝品中過敏原肉桂酸芐酯的檢測新方法。該印跡膜電極具有較高的選擇性識別、良好的再生性和穩(wěn)定性，并且實現了洗發(fā)水樣品中痕量肉桂酸芐酯的檢測。