基于低場核磁共振技術(shù)的小鼠體成分無損分析方法開發(fā)

譚明乾， 林竹一， 李晨陽， 王偲琦

(1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連 116034；2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116034)

體成分包括體液、脂肪和瘦肉等含量，它可直接反映人體的健康狀況。目前評估肥胖的方法有稱量體重或體質(zhì)指數(shù)(BMI)計算法，但不足以準確實時地反映體成分的動態(tài)變化情況[1]。因此，急需一種快速、準確可實時動態(tài)監(jiān)測體成分變化的測量方法。在哺乳類實驗動物中，由于小鼠飼養(yǎng)管理方便，易于控制，生產(chǎn)繁殖快，有明確的質(zhì)量控制標準，因此利用小鼠為實驗動物模型，開發(fā)一種小鼠體成分動態(tài)變化的快速無損檢測方法，對于評價人類食品功能組分對體成分的影響具有非常重要的研究意義

目前，動物體成分的測定方法是全身化學分析法，它是衡量身體組成的金標準，但該方法耗時費力、沒有重現(xiàn)性、需要殺死小鼠、不能動態(tài)監(jiān)測[2]。測量體成分技術(shù)還有生物電阻抗法(BIA)、雙能X射線吸收光譜法(DEXA)、同位素稀釋法、皮膚褶皺和近紅外(NIR)等[3 - 5]。上述方法存在測量結(jié)果準確性低、誤差大、適用范圍小、易受影響、動物死亡率大等缺點[6 - 7]，因此探索一種新型小鼠體成分測定方法是我們現(xiàn)今所急需的。低場核磁共振(LF-NMR)具有快速無損等優(yōu)點，成為現(xiàn)今很有發(fā)展?jié)摿Φ臒o損分析技術(shù)，且已應(yīng)用于食物成分(脂質(zhì)，水分，蛋白質(zhì))的分析[8 - 9]。例如，Prestes等采用1H橫向弛豫時間(T2)選擇完整油籽測定改性脂肪酸的分布[10]；Geng等使用LF-NMR分析干海參的復水過程[11]。此外將偏最小二乘回歸分析法(PLSR)和主成分回歸分析法(PCR)運用在近紅外、NMR分析中，可以提取出反映數(shù)據(jù)變異的最大信息，系統(tǒng)全面的分析問題[12 - 14]。Rios等使用NMR結(jié)合PLSR技術(shù)成功預測巖石滲透率[15]；Gaston等運用PLSR和PCR算法對蘑菇雙孢蘑菇多酚氧化酶活性進行預測[16]；Shao等使用PLSR結(jié)合LF-NMR預測煮甜玉米中未凍水含量[17]。目前LF-NMR結(jié)合PLSR在食品加工中進行分類和定量測量方面有很大發(fā)展[18]。然而，基于LF-NMR小鼠體成分的無損快速分析方法仍然未見報道。

本研究采用全身化學分析方法的結(jié)果作為參考值，建立基于LF-NMR技術(shù)的小鼠體液、脂肪和瘦肉含量快速預測模型。利用體液，脂肪和瘦肉質(zhì)量響應(yīng)于不同靜態(tài)磁場下的各種射頻脈沖產(chǎn)生不同的信號[19]，通過NMR測量CPMG脈沖序列，通過PLSR和LF-NMR結(jié)合全身化學法的測定值，建立小鼠體成分預測模型來分析小鼠體液、脂肪和瘦肉含量，實現(xiàn)在小鼠清醒狀態(tài)下對小鼠體成分的快速、無損分析(圖1)。

圖1 小鼠體液、脂肪和瘦肉含量的低場核磁共振檢測示意圖Fig.1 Scheme of body fluid,fat and lean mass in mice detected by LF-NMR

1 實驗部分

1.1 儀器與實驗動物

NMI20-030H-I核磁共振成像分析儀(永磁體場強0.5 T)(蘇州紐邁分析儀器股份有限公司)；SZF-06A粗脂肪測定儀(上海新嘉電子有限公司)；PH070A型培養(yǎng)箱/干燥箱(上海一恒科技有限公司)；KDN-103F定氮儀(上海纖檢儀器有限公司)；HYP-1020消化爐(上海纖檢儀器有限公司)；SX2-4-10馬弗爐(龍口市先科儀器有限公司)；AS5150A超聲波清洗機(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；AB204-N電子分析天平、ME140電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

BALB/C小鼠，6～10周齡，體重18～32 g，均為雄性，清潔級(大連醫(yī)科大學實驗動物中心)。實驗開始之前，BALB/C小鼠飼養(yǎng)于室溫～20 ℃空調(diào)實驗室內(nèi)，測試前為保證實驗順利進行，對小鼠禁食、禁水2 h處理。

1.2 實驗方法

1.2.1低場核磁信號采集通過由聚四氟乙烯(內(nèi)徑：2.3 cm，外徑：3.0 cm)制成的小鼠體成分測定專用籠具，固定移動的小鼠，并保證在測試過程中小鼠可以自由呼吸。將鼠籠放置在核磁共振成像分析儀的射頻線圈的中心，在32 ℃條件下采用CPMG序列，測定20只體質(zhì)量不同小鼠的橫向弛豫信息。測試參數(shù)：P1(s)=15，P2(s)=29，SW(kHz)=200，TW(ms)=3 000，NECH=5 000，NS=8，DL1(ms)=0.100。

1.2.2全身化學法分析小鼠體成分20只BALB/C小鼠經(jīng)過低場核磁掃描后，立即通過斷頸方式處死，進行全身化學法分析。首先，將小鼠在105 ℃烘箱中烘大約56 h，中間用天平檢查小鼠的體重，直到烘至恒重，參照國家標準(GB 50093-2010)《食品中水分的測定》，確定體液含量。由索氏提取法測定脂肪含量，參照國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局(GB/T 9695.2-2008)《食品中脂肪的測定》，將烘干小鼠粉碎后的殘渣用濾紙包好，放入抽提器中，向圓底燒瓶中加入60 mL石油醚，接好抽提器的冷凝水，65 ℃恒溫水浴下抽提6.5 h。抽提結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去石油醚，將圓底燒瓶置于105 ℃干燥2 h，使其徹底揮發(fā)，稱量燒瓶重量，計算所抽提的小鼠脂肪含量。瘦肉含量定義為體液、蛋白質(zhì)和灰分含量的總和，其中凱氏定氮法是蛋白質(zhì)含量測定最常見的方法[20 - 21]，參照國家衛(wèi)生部標準(GB 50094-2010)《食品中灰分的測定》，采用凱氏定氮法，標定0.1 mol/L HCl，稱量小鼠樣品，加入0.2 g CuSO4，6 g K2SO4，再加20 mL濃H2SO4，200 ℃加熱消化，再升溫至420 ℃，液體呈藍綠色且澄清透明，用半凱氏定氮儀蒸餾至中性，用HCl滴定至溶液呈淡紫色，記錄其消耗量V1，空白實驗HCl消耗量V2=0.02 mL。蛋白質(zhì)含量(%)=(V1-V2)×0.1×0.014×6.25/m0×100%。m0為小鼠的質(zhì)量，同時進行空白實驗。

灰分含量參照國家標準(GB 50095-2010)《食品中蛋白質(zhì)的測定》，取索氏提取脂肪后的1/2樣品烘干稱重，置于坩堝中在馬弗爐中550 ℃灼燒8 h，冷卻后稱重得灰分重量，計算得到灰分含量，小鼠瘦肉含量=蛋白質(zhì)含量+灰分含量+體液含量。

1.3 小鼠體成分預測模型建立及檢驗

利用LF-NMR測試結(jié)果與化學測試結(jié)果建立相關(guān)模型。本文選擇16只小鼠用于小鼠體成分預測模型的建立，4只小鼠用于驗證模型的準確性。首先建立預測模型，利用每只小鼠的所有NMR測試數(shù)據(jù)，即5 000個CPMG數(shù)據(jù)，以及化學測試指標包括體液、脂肪、瘦肉數(shù)據(jù)的結(jié)果，列在16×5 003矩陣。簡而言之，化學方法測定的結(jié)果作為參考值，獨立變量的矩陣是振幅強度(X)，數(shù)據(jù)矩陣X的每行給出了其中一個小鼠樣本的振幅強度。因變量是相應(yīng)的體成分含量(Y)。采用Unscramble 9.7 數(shù)據(jù)處理軟件，建立PLSR預測模型和PCR預測模型，采用Origin 8.5進行圖形繪制。將建立好的PLSR和PCR預測模型分別運用于待測小鼠進行體成分預測，得到小鼠體液、脂肪和瘦肉含量的模型預測值，并與化學方法獲得的小鼠體液、脂肪和瘦肉含量數(shù)據(jù)進行比較驗證分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 橫向弛豫結(jié)果分析

NMR方法對實驗動物沒有X射線輻射損傷，通過測定能反映氫核狀態(tài)的橫向弛豫時間T2等核磁共振參數(shù)，獲得待測樣品的內(nèi)部1H質(zhì)子信息。圖2為建立預測模型的16只小鼠的CPMG回波衰減曲線(圖2A)和未參與建模的4只小鼠的回波衰減曲線(圖2B)。小鼠所含氫質(zhì)子所處不同的物理化學性質(zhì)與衰減曲線的趨勢密切相關(guān)，所以不同的衰減曲線與小鼠中不同的體成分組成有關(guān)，小鼠橫向弛豫曲線有可能反映小鼠體成分存在的這部分差異。用肉眼觀察，整個趨勢看起來很相似，從圖2A在100～300 ms的放大截圖，可以觀察到由于不同的小鼠樣本體液、脂肪、瘦肉含量有所差異，CPMG回波峰的曲率和信號強度存在一定差異，但是很難區(qū)分，需要結(jié)合化學計量學方法用原始衰減數(shù)據(jù)建立預測模型用于測定小鼠樣品的體液，脂肪和瘦肉含量。即利用不同體成分小鼠對儀器的響應(yīng)特性不同，LF-NMR技術(shù)可以快速檢測小鼠的體液，脂肪和瘦肉含量。

圖2 建立預測模型的16只小鼠的回波衰減曲線(A)和用來驗證的小鼠的回波衰減曲線(B)Fig.2 CPMG decay curves recorded for 16 mice to establish prediction model(A) and the other mice for testing(B)The numbers in the figures represent the serial numbers of the mice.

2.2 全身化學分析法測定小鼠體成分的結(jié)果

全身化學分析法是確定體成分含量的傳統(tǒng)方法。表1列出了用于建立預測模型的1～16號小鼠體質(zhì)量、體液、脂肪、瘦肉的全身化學分析法的測定結(jié)果以及16只小鼠體液、脂肪、瘦肉含量的最大值、最小值、平均值、標準偏差?？梢钥闯鲂∈髽悠返捏w質(zhì)量在22.77 g和31.18 g之間，體液量在14.29 g和18.57 g之間，脂肪量在2.28 g和5.62 g之間，瘦肉量在16.05 g和20.99 g之間，且體質(zhì)量、體液、脂肪、瘦肉含量的平均值±標準偏差分別為26.89±2.39 g、16.75±1.46 g、3.97±1.02 g和18.71±1.64 g。小鼠樣品的體液含量在57.16%和66.73%之間，脂肪含量在8.76%和20.46%之間，瘦肉含量在63.66%和75.49%之間，且水分、脂肪、瘦肉含量的平均值加減標準偏差分別為62.35±2.67%、14.67±3.22%和69.65±3.04%。通過與全身化學分析法測定小鼠體成分結(jié)果進行關(guān)聯(lián)，有望建立一種基于LF-NMR技術(shù)的無損快速小鼠體成分分析檢測方法。

表1 全身化學法測定用于建立預測模型的16只小鼠體成分信息

2.3 模型參數(shù)評價

由圖3A可以看出，PLSR方法建立預測模型，通過小鼠體液、脂肪和瘦肉含量殘余方差分析得到體液、脂肪和瘦肉的最佳因子數(shù)分別為7、5和7，選擇最佳因子數(shù)進而得到小鼠體液，脂肪和瘦肉的LF-NMR技術(shù)預測模型的校正集和驗證集的預測值與實際值的相關(guān)圖(圖3B～3D)。觀察小鼠的體液、脂肪和瘦肉含量的校正集和驗證集的散點分布圖，發(fā)現(xiàn)點均勻的分布在擬合線的兩側(cè)，說明預測值與實際值具有良好的相關(guān)性，PLSR模型具有良好的穩(wěn)定性。經(jīng)過方程回歸后，我們可以得到線性方程：Y=QX+E。X軸分別為小鼠體液，脂肪和瘦肉的參考含量，Y軸是小鼠體成分含量的預測值。良好的預測模型應(yīng)該具有較高的R2值和較低的RMSEC和RMSECV[24]，模型的線性關(guān)系可以顯示模型是否可以提供準確的量化，作為其擬合度評價的可靠指標[25]，如果R2>0.90表明模型的預測效果很好，此外剩余預測偏差(RPD)值，即標準差(SD)與預測均方根誤差的比值也被用于評估預測結(jié)果的準確性，若RPD>3，R2≥ 0.9表明預測結(jié)果很好。

圖3 PLSR預測模型殘余方差和與因子數(shù)關(guān)系(A)、體液PLSR預測模型(B)、脂肪PLSR預測模型(C)和瘦肉PLSR預測模型(D)的預測值與實際值的相關(guān)圖Fig.3 Residual validation versus number of principal components(A) and the predicted and reference plots of the PLSR models for body fluid(B),body fat(C) and lean mass(D)and the actual and estimated values of the relevant figure

然而用PCR方法建立預測模型時，小鼠體液、脂肪和瘦肉含量模型的最佳因子數(shù)分別為6、6和6(圖4A)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)點并不是均勻地分布在擬合線的兩側(cè)，說明預測值與實際值的相關(guān)性不是很佳，見圖4B～4D。

圖4 PCR預測模型殘余方差和與因子數(shù)關(guān)系(A)、體液PCR預測模型(B)、脂肪PCR預測模型(C)和瘦肉PCR預測模型(D)的預測值與實際值的相關(guān)圖Fig.4 Residual validation versus number of principal components(PCs)(A) and the predicted and reference plots of the PCR models for body fluid(B),body fat(C) and lean mass(D)and the actual and estimated values of the relevant figure

PLSR與PCR預測模型參數(shù)均列入表2，由表2可見，PCR體液和脂肪模型的RPD大于3，但瘦肉模型的RPD小于3，說明PCR體液和脂肪的預測較準確，但瘦肉模型的預測較不合理。PCR預測模型與PLSR預測模型相比，R2較小且均方根誤差較大，RPD較小。該結(jié)果表明，PLSR預測模型的準確性和穩(wěn)定性高于PCR預測模型。

表2 小鼠體液、脂肪和瘦肉含量PLSR和PCR模型參數(shù)

Note:RPD,residual predictive deviation.

如上所述，使用PLSR和PCR算法建立了用于小鼠體成分含量預測的模型，包括校準方程和驗證方程，這些結(jié)果清楚地表明了PLSR和PCR模型的線性回歸參數(shù)。通過觀察發(fā)現(xiàn)PLSR模型的點都均勻的分布在擬合線的兩側(cè)，說明預測值與實際值具有良好的相關(guān)性，而PCR模型的點相對分布不均，說明PLSR預測模型具有更好的穩(wěn)定性。

2.4 模型應(yīng)用評價

表3列出了用于驗證預測模型性能的小鼠全身化學分析法測得的體成分信息以及這4只小鼠體質(zhì)量、體液、脂肪和瘦肉含量的最大值、最小值、平均值和標準偏差。從表3可見小鼠樣品的體質(zhì)量含量在23.76 g和32.79 g之間，體液量在13.99 g和19.49 g之間，脂肪量在3.53 g和6.03 g之間，瘦肉量在15.67 g和21.61 g之間。小鼠體質(zhì)量、體液、脂肪和瘦肉含量的平均值和標準偏差分別為27.72±3.79 g，16.94±2.35 g、4.51±1.10 g和18.89±2.55 g。經(jīng)過換算，體液含量在58.87%和64.36%之間，脂肪含量在12.66%和19.24%之間，瘦肉含量在65.89%和71.93%之間。小鼠體液、脂肪和瘦肉含量的平均值和標準偏差分別為61.11±2.51%、16.24±3.10%和68.17±2.87%。通過以上參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)用于評價的小鼠脂肪含量差異較大。

表3 全身化學法測定用于驗證預測模型的4只小鼠體成分信息

Note:RPD,residual predictive deviation.

表4列出了通過全身化學分析法和采用小鼠體成分PLSR預測模型預測得的小鼠體液、脂肪、瘦肉含量。結(jié)果說明PLSR預測模型得到的體液含量與全身化學分析法測定得到的小鼠體液含量的相對誤差為0.71%和1.15%之間，PLSR預測模型得到的脂肪含量與全身化學分析法測定得到的小鼠脂肪含量的相對誤差為0.31%和1.43%之間，PLSR預測模型得到的瘦肉含量與全身化學分析法測定得到的小鼠瘦肉含量的相對誤差為0.14%和1.12%之間。通過4只小鼠體成分的預測值，三個PLSR模型的相對誤差均低于1.5%，其中脂肪PLSR模型的相對誤差較高，說明體液PLSR模型和瘦肉PLSR模型具有較高的準確性，脂肪PLSR模型的準確性較差，可能原因是小鼠體內(nèi)脂肪含量低，導致預測效果較差。

表5列出了通過全身化學分析法和采用小鼠體成分PCR預測模型預測得到的小鼠體液、脂肪、瘦肉含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠體成分PCR預測模型得到的體液含量與全身化學分析法測定得到的小鼠體液、脂肪、瘦肉含量的相對誤差分別為0.59%和1.14%之間，0.38%和1.36%之間，0.15%和1.46%之間。瘦肉PCR預測模型的準確性最高，其次是體液PCR預測模型，準確性最差的是脂肪PCR預測模型。PCR模型的預測結(jié)果與PLSR預測模型相似。

表4 PLSR預測模型和全身化學法得到的體液含量、脂肪含量、瘦肉含量對比

Note:SD,standard deviation;E1-4:experiment 1-4.

表5 PCR預測模型和全身化學法得到的體液含量對比

Note:SD,standard deviation;E1-4:experiment 1-4.

3 結(jié)論

本文建立了基于LF-NMR技術(shù)的小鼠體成分無損分析方法。通過CPMG序列獲得的馳豫數(shù)據(jù)與化學計量學數(shù)據(jù)處理方法相結(jié)合，分別利用PLSR法和PCR法建立小鼠體液、脂肪、瘦肉含量的預測模型。與PCR預測模型相比，PLSR預測模型具有更高的穩(wěn)定性和預測準確性，PLSR模型的性能優(yōu)于PCR模型。結(jié)果顯示PLSR和PCR的預測結(jié)果很相似，均表現(xiàn)為體液、脂肪和瘦肉的預測相對誤差小于1.5%，平均相對誤差均在1%以內(nèi)，預測效果很好。本實驗結(jié)果可以反映出LF-NMR結(jié)合PLSR和PCR方法，可以開發(fā)出用于小鼠的體液、脂肪和瘦肉含量的快速無損分析方法。