利用DNA免疫技術(shù)制備ASB11蛋白的多克隆抗體

蔡英桂，尹麗陽(yáng)，王宏波，陳 宇，曾 蓉，吳秀山，葉湘漓*

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013； 2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院心臟發(fā)育研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410081；3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410011)

ASB家族(ankyrin repeat and SOCS box containing protein family，含錨蛋白重復(fù)序列-細(xì)胞因子信號(hào)抑制物盒蛋白家族)因在其氨基端和羧基端分別含有多個(gè)串聯(lián)重復(fù)的ankyrin repeat結(jié)構(gòu)域和一個(gè)SOCS(suppressor of cytokine signaling)box結(jié)構(gòu)域而得名。ASB的ankyrin repeat結(jié)構(gòu)域最先是在酵母的細(xì)胞周期基因Swi/Cdc10和果蠅的Notch基因中發(fā)現(xiàn)的，可以與特異性的靶蛋白結(jié)合，介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用；該結(jié)構(gòu)域在蛋白中的重復(fù)次數(shù)最高可達(dá)33次，不過(guò)多數(shù)為6個(gè)以下[1,2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ASB家族成員共有18個(gè)，分別命名為ASB1-ASB18；其中ASB5、ASB9、ASB11、ASB13 和ASB15蛋白的主要序列相似，且都含有6個(gè)重復(fù)的ankyrin repeat結(jié)構(gòu)域，該特征與ASB家族的其它成員存在明顯區(qū)別。不同ASB蛋白在其ankyrin repeat結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象以及重復(fù)次數(shù)等方面的差異性提示其可能通過(guò)與不同的靶蛋白相結(jié)合而參與不同的生理過(guò)程[3-5]。

斑馬魚的Asb11與人類的ASB11高度同源。已有的研究表明，斑馬魚的Asb11基因位于第9號(hào)染色體上，含7個(gè)外顯子，cDNA全長(zhǎng)為882 bp，編碼293個(gè)氨基酸，分子量約為32 kD；人類的ASB11基因位于Xp22.31上，由7個(gè)外顯子構(gòu)成，亞細(xì)胞定位顯示ASB11蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)。斑馬魚的Asb11是體內(nèi)經(jīng)典Notch信號(hào)傳導(dǎo)的正調(diào)節(jié)因子，參與泛素化過(guò)程，影響胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞的發(fā)育，該過(guò)程依賴于Asb11蛋白的SOCS box[6,7]。SOCS box是ECS型E3泛素連接酶復(fù)合物的底物識(shí)別模塊，SOCS box域分為BC框和Cul框基序，Asb11的Cul5框是正確表達(dá)Notch靶基因的前提，缺乏Cul5框的斑馬魚突變體在Notch信號(hào)傳導(dǎo)方面存在明顯缺陷[8]。此外，Asb11是胚胎和成體再生性肌發(fā)生的主要調(diào)節(jié)者，也是腫瘤發(fā)生的候選基因之一[9-11]。ASB11可能參與了心臟和肌肉組織的發(fā)育過(guò)程，有關(guān)ASB11的研究對(duì)于揭示心臟發(fā)育中的相關(guān)信號(hào)通路和分子調(diào)控機(jī)理具有重要的意義。

DNA免疫是將包含目標(biāo)蛋白DNA或者cDNA的重組真核表達(dá)載體直接注射到動(dòng)物的肌肉、皮下或者腹腔等部位，利用宿主的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成外源目標(biāo)蛋白抗原，并激活宿主的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的發(fā)生[12-14]。DNA免疫的應(yīng)答強(qiáng)弱與其表達(dá)載體表達(dá)抗原的能力以及免疫接種的途徑有關(guān)，其中,表達(dá)載體的表達(dá)能力主要取決于載體上的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的強(qiáng)弱，而不同的免疫途徑產(chǎn)生免疫應(yīng)答的機(jī)制和效果也不同。肌肉注射是最常見(jiàn)的DNA導(dǎo)入方式，具有操作簡(jiǎn)便、免疫接種容量大、引起免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)[15,16]。真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-P7是DNA免疫研究中最常用的質(zhì)粒載體之一，含有雞的β-actin真核啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子，可使下游插入基因能在哺乳動(dòng)物中高效表達(dá)，從而增強(qiáng)免疫效果[17,18]；而多個(gè)酶切位點(diǎn)利于目標(biāo)片段的插入，Poly A可保證目標(biāo)mRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性。

本研究將帶有斑馬魚ASB11 cDNA的pCAGGS-P7/ASB11重組表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)肌肉注射到小鼠中，使其在小鼠體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，經(jīng)過(guò)多次免疫后，提取相應(yīng)的血清進(jìn)行Western Blot和免疫熒光，檢測(cè)制備的多克隆抗體的免疫效果，以期為后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞和主要試劑

DH5α感受態(tài)細(xì)胞、真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-P7以及人肺癌A549細(xì)胞為湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育中心保存；BALB/c小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；高保真酶試劑盒、一步克隆試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物公司；鼠二抗購(gòu)自CST公司。限制性內(nèi)切酶KpnI、XhoI(Takara公司，日本)；常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；10%新生牛血清FBS(Invitrogen公司，美國(guó))；10 mmol/L Hepes(北京索萊寶科技有限公司)，用于細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

在NCBI網(wǎng)站上搜索斑馬魚Asb11基因的cDNA序列，并以該序列為模板，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物P1、P2。在P1、P2引物前均加入同源臂序列，同源臂序列中分別引入限制性內(nèi)切酶KpnI、XhoI識(shí)別位點(diǎn)。引物由上海生物工程公司合成，序列如下(下劃線序列為內(nèi)切酶KpnI、XhoI的識(shí)別位點(diǎn))：P1(pCAGGS-P7-Asb11-F)：CTATAGGGCGAATTGGGTA CCTTTAGTTTAGAGATGGCCGTGG；P2(pCAGGS-P7-Asb11-R)：ATCGATACCGTCGACCTCGAGGTGACACT TGACAATGTTTATCGG。

1.3 pCAGGS-P7/ASB11表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

首先，用Trizol從發(fā)育至24 h的AB品系斑馬魚胚胎中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后以cDNA為模板，用上述P1、P2引物進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出長(zhǎng)度為964 bp的Asb11基因片段。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，56 ℃復(fù)性15 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸30 s，4 ℃保存。獲得的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳后，用DNA純化回收試劑盒回收目的片段。最后與用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI雙酶切pCAGGS-P7質(zhì)粒回收的約5 000 bp片段，用T4 DNA連接酶4℃連接過(guò)夜。

1.4 轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的鑒定

將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后，挑取陽(yáng)性單克隆至氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng)14 h。以P1、P2為引物進(jìn)行菌液擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后初步確定重組質(zhì)粒pCAGGGS-P7/ASB11陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 DNA免疫技術(shù)制備小鼠抗ASB11抗體

用pCAGGGS-P7/ASB11重組質(zhì)粒免疫6～8周齡的小鼠：電擊處理5只小鼠后，在其肢股四頭肌部位注射濃度為700 ng/μL的重組質(zhì)粒，每只小鼠注射40 μL。同時(shí)用未插入片段的pCAGGGS-P7空載質(zhì)粒DNA等量注射5只小鼠作為對(duì)照組。注射時(shí)間段為0 d、21 d、28 d，共重復(fù)注射三次，于第35 d取血并分離血清，分裝后的血清于-80 ℃冰箱保存。

1.6 Western-blot檢測(cè)ASB11多克隆抗體效價(jià)

將發(fā)育至24 h的AB型斑馬魚胚胎收集于1.5 mL的EP管中，加入裂解試劑(RIPA)和蛋白酶抑制劑后充分研磨，在4 ℃搖床靜置30 min后，沸水煮10 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，離心5 min；取上清，加入5×的蛋白上樣Loading，12 000 r/min，離心2 min。然后取30 μL的樣品，SDS-PAGE凝膠電泳2 h，凝膠半干轉(zhuǎn)膜15 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入DNA免疫產(chǎn)生的ASB11抗血清作一抗，用免疫前血清做陰性對(duì)照，37 ℃搖床孵育2 h。最后，用TBST洗滌3次后加入1∶1 000抗小鼠的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后顯影觀察。

1.7 免疫熒光檢測(cè)ASB11多克隆抗體效價(jià)

將人肺癌A549細(xì)胞以合適的密度接種于玻底培養(yǎng)皿培養(yǎng)48 h，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，3 min/次；用4%多聚甲醛室溫固定20-30 min，PBS洗3次，5 min/次；然后用0.2%的Triton-X-100室溫通透20 min，PBS清洗3次，5 min/次；加入5%BSA封閉液，室溫封閉30 min后，吸掉封閉液。

實(shí)驗(yàn)組用DNA免疫產(chǎn)生的ASB11抗血清1∶50稀釋，室溫孵育2 h，對(duì)照組則用等體積的免疫前血清孵育。在避光條件下，用0.1%的PBST洗3次后，滴加稀釋好的熒光二抗，室溫孵育2 h，PBST浸洗3次，5 min/次。滴加DAPI孵育10 min(DAPI按1∶1 000稀釋)，PBST洗3次，5 min/次，在共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-P7/ASB11的構(gòu)建及鑒定

以P1、P2引物PCR擴(kuò)增后得到約964 bp的目標(biāo)條帶，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化(圖1)。然后將目標(biāo)片段連接到pCAGGGS-P7質(zhì)粒的KpnI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGGS-P7/ASB11(圖2)。將重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化后獲得單克隆菌液，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切初步驗(yàn)證(圖3)，并將質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步確定重組質(zhì)粒序列的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明pCAGGGS-P7/ASB11重組質(zhì)粒的序列與NCBI上ASB11序列一致，pCAGGS-P7/ASB11重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Asb11基因的PCR產(chǎn)物純化回收電泳圖Fig.1 Electropherogram of purification and recovery of Asb11 PCR productsM：DNA marker； 1，2：Asb11基因PCR產(chǎn)物純化回收電泳條帶M:DNA marker;1, 2: Asb11 gene PCR product purification and recovery of electrophoretic bands

圖2 pCAGGGS-P7/ASB11重組質(zhì)粒示意圖Fig.2 Construction of pCAGGGS-P7/ASB11 recombinant plasmid

圖3 pCAGGGS-P7/ASB11重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證圖Fig.3 Verification of pCAGGGS-P7/ASB11 recombinant plasmid digestionM：DNA Marker；1-9：Kpn I、Xho I酶切質(zhì)粒結(jié)果；2、3、5、7、8、9號(hào)泳帶為與預(yù)期目的條帶大小相近的條帶M:DNA marker;1-9: Plasmid digestion results: the bands 2, 3, 5, 7, 8, and 9 are similar to the size of the intended destination band

2.2 ASB11多克隆抗體的Western-blot鑒定

提取發(fā)育至24 h的AB型斑馬魚胚胎總蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。將制備的ASB11多克隆抗體作為一抗，分別以1∶100和1∶400的稀釋比進(jìn)行孵育，結(jié)果顯示免疫后血清在32 kD處有一條特異的雜交帶出現(xiàn)，并且稀釋比為1∶400時(shí)雜交信號(hào)仍然非常明顯(圖4)。這些結(jié)果說(shuō)明免疫后的小鼠血清中產(chǎn)生了ASB11蛋白的特異性抗體，該抗體的特異性和敏感性良好，可以滿足后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的需要。

圖4 ASB11多克隆抗體Western blot鑒定Fig.4 Western-blotting of ASB11 polyclonal antibody1：免疫前血清； 2：抗體稀釋比為1∶100； 3：抗體稀釋比為1∶4001:Control;2:The antibody dilution ratio: 1∶100;3:The antibody dilution ratio: 1∶400

2.3 ASB11多克隆抗體免疫熒光鑒定

免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，DNA免疫制備的ASB11抗血清檢測(cè)人肺癌A549細(xì)胞中有較強(qiáng)特異性熒光，而陰性對(duì)照無(wú)明顯的特異性熒光(圖5)，即DNA免疫產(chǎn)生的ASB11多克隆抗體能夠識(shí)別自然狀態(tài)下的ASB11蛋白。

圖5 免疫熒光檢測(cè)多克隆抗體的特異性Fig.5 Detection of polyclonal antibodies specificity by immunofluorescenceA：免疫前血清免疫的細(xì)胞核染色；B：免疫前血清免疫的ASB11蛋白；C：免疫前血清免疫的merge圖；D：ASB11多克隆抗體免疫的細(xì)胞核染色；E：ASB11多克隆抗體免疫的ASB11蛋白的表達(dá)；F：ASB11多克隆抗體免疫的merge圖A: Nuclear staining of serum immunization before immunization;B: Expression of ASB11 protein in serum before immunization;C: Merge diagram of serum immunization before immunization;D: Nuclear staining immunized with ASB11 polyclonal antibodies;E: Expression of ASB11 protein immunized with ASB11 polyclonal antibody;F: Merge diagram immunized with ASB11 polyclonal antibody

3 討論

Asb11在脊椎動(dòng)物中高度保守，研究表明，Asb11在多能和神經(jīng)定向祖細(xì)胞系中的過(guò)度表達(dá)將抑制末梢神經(jīng)元的分化；目前Asb11在胚胎發(fā)生和成體中的功能仍未得到充分的闡明。值得注意是，斑馬魚的Asb11不僅與人類的ASB11具有同源性，而且與哺乳動(dòng)物中ASB家族的其它成員也高度同源，尤其是與ASB9高度同源。ASB9在結(jié)直腸癌中高度表達(dá)，是癌細(xì)胞檢測(cè)中的重要指標(biāo)[20]，ASB11與ASB9高度同源，暗示ASB11可能參與了腫瘤的發(fā)生；泛素-蛋白酶體途徑是惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵因子，在ASB11過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系中，P53、P21的表達(dá)明顯上調(diào)[10]，由此推測(cè)ASB11可能與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。有關(guān)ASB11的功能研究將有助于闡明胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞的發(fā)育、再生性肌發(fā)生、泛素化以及腫瘤的發(fā)生機(jī)理，具有重要的意義。

Wolf等人[19]第一次將DNA質(zhì)粒注射到肌肉中，誘發(fā)免疫應(yīng)答產(chǎn)生特異性抗體，開(kāi)啟了DNA免疫的新篇章。作為近三十年發(fā)展起來(lái)的新興免疫技術(shù)，DNA免疫技術(shù)能很好的模擬天然條件下宿主機(jī)體感染病原體產(chǎn)生抗體的過(guò)程。劉麗梅[18]等人利用DNA免疫技術(shù)，通過(guò)將含有雞的β-actin真核啟動(dòng)子和SV40雙啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pCAGGS-P7/NV2B免疫小鼠，使下游插入的基因能在小鼠體內(nèi)高效表達(dá)，制備了抗登革熱病毒2型NS2B蛋白的多克隆抗體;姜永萍[17]等人利用表達(dá)載體pCAGGS顯著增強(qiáng)了禽流感DNA疫苗的免疫保護(hù)效果;證明DNA免疫反應(yīng)持久，可持續(xù)表達(dá)低水平的蛋白抗原。此外，DNA免疫可以直接免疫小鼠，其操作過(guò)程簡(jiǎn)單、用時(shí)短、無(wú)需純化蛋白，故較傳統(tǒng)的免疫方式而言具有很大的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)然DNA免疫亦存在一定的缺陷，如免疫應(yīng)答不夠強(qiáng)烈，所獲得的抗體效價(jià)也偏低等?？傮w來(lái)說(shuō)，DNA免疫是一種簡(jiǎn)單易行的抗體制備方法，尤其適用于分子質(zhì)量小、不易純化的蛋白的抗體制備。

本研究通過(guò)反轉(zhuǎn)錄的方式獲得了斑馬魚ASB11的cDNA，將其克隆至改造過(guò)的含有雞β-actin啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子的pCAGGS-P7真核表達(dá)載體上，構(gòu)建pCAGGS-P7/ASB11重組表達(dá)質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)表明，該重組質(zhì)?？梢栽谛∈篌w內(nèi)高效表達(dá)，肌肉注射較其他注射方法而言更為簡(jiǎn)便，能誘導(dǎo)CTL特異反應(yīng)。通過(guò)DNA免疫技術(shù)成功制備了斑馬魚Asb11基因的多克隆抗體，利用Western-blot以及免疫熒光檢測(cè)了ASB11多克隆抗體的有效性。在前期成功構(gòu)建了斑馬魚Asb11基因突變品系的基礎(chǔ)上，為后續(xù)ASB11基因的功能研究和作用機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。