膽紅素的光學檢測方法研究進展

付 笛，張子建，徐亭晚，鄧小峰，陳 丹，刑 揚，姚興旺，李雅湘，苗雄鷹，李清龍，文 宇*，熊 力*

(1.中南大學湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙 410012； 2.中南大學湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙 410011；3.中南大學湘雅醫(yī)學院，湖南 長沙 410012； 4.珠海市人民醫(yī)院，廣東 珠海 519000)

血液中衰老的紅細胞經(jīng)由單核巨噬細胞系統(tǒng)破壞，釋放出血紅蛋白，血紅蛋白分解產(chǎn)生膽紅素，這是膽紅素產(chǎn)生的主要方式。正常人每天可生成250-350 mg膽紅素，當血清膽紅素含量超過17.1 μmol/L稱為高膽紅素血癥。膽紅素為橙黃色物質，過量膽紅素可擴散進入組織造成皮膚、黏膜、鞏膜黃染，這一體征稱為黃疸[1]。2009年中國住院新生兒流行病學調查顯示，黃疸是住院新生兒中發(fā)病率最高的疾病[2]，嚴重者可發(fā)展為膽紅素腦病(核黃疸)，因為未結合膽紅素具有親脂性，可進入新生兒的神經(jīng)細胞并造成不可逆的損傷。一項全國性調查共報告膽紅素腦病348例，約占收治患兒總數(shù)的4.8%。多中心調查顯示，隨訪的223例病例中，42.2%有嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，2.7%在院內(nèi)死亡，13.5%出院后死亡[3]。在成年人中，黃疸也是一種常見的癥狀與體征，可分為溶血性黃疸、肝細胞性黃疸、膽汁淤積性黃疸和先天性非溶血性黃疸。目前檢測膽紅素的方法有四種[4,5]：1)采血自動生化檢測，可測定總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素的含量；2)微量血膽紅素儀測定；3)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)；4)使用特殊儀器檢測。

特殊儀器檢測目前僅應用于新生兒，包括經(jīng)皮膽紅素測定儀檢測和拍照檢測。由于成年人中存在如胡蘿卜素等多種干擾，在成人中的無創(chuàng)檢查還有待研究。下面介紹幾種經(jīng)皮膽紅素測定儀和手機拍照檢測膽紅素以及它們的工作原理和優(yōu)缺點。

1 經(jīng)皮膽紅素測定儀的理論依據(jù)和測定原理

血清膽紅素皮膚、黏膜和鞏膜處沉積，出現(xiàn)黃染，臨床上稱為黃疸。經(jīng)皮膽紅素測定儀發(fā)出特定波長的光，經(jīng)皮膚與皮下組織的折射，其散射光進入經(jīng)皮膽紅素測定儀，經(jīng)儀器運算后可得到膽紅素的值。膽紅素的吸收波長在460 nm處，血液中膽紅素的濃度越高，反射回來的460 nm的光就越少，故可通過反射值的多少來測定血清膽紅素的濃度。人體內(nèi)還存在一些物質如黑色素、血紅蛋白以及真皮厚度會干擾測定結果，通過一些方法排除干擾物質的影響即可得到較為精確的血清膽紅素的值。下面介紹三種經(jīng)皮膽紅素測定儀的原理和優(yōu)缺點。

1.1 國產(chǎn)QL1200經(jīng)皮黃疸儀的原理及優(yōu)缺點[6]

1.1.1 工作原理

圖1 QL1200經(jīng)皮黃疸儀工作原理[6]Fig.1 The working principle of QL1200 percutaneous jaundice instrument

工作電源為鎳氫電池，加上穩(wěn)壓電路，為單片機提供穩(wěn)定的電壓。進行測定時，儀器在內(nèi)部單片機(即計算機)的控制下，經(jīng)氙閃光電路改變電壓值，使之符合氙閃光管的需要。氙閃光管發(fā)出強光，照射到患兒的皮膚和皮下組織，散射光返回光學系統(tǒng)。經(jīng)過藍、綠兩種濾光片后，反射光只留下藍(中心波長450 nm)、綠(中心波長550 nm)兩種不同波長的光。再經(jīng)過硅電池的作用，光信號轉變?yōu)殡娦盘枺俳?jīng)由單片機(計算機)處理，處理的值最后在顯示屏上顯示。

1.1.2 QL1200的優(yōu)缺點

血紅蛋白在460 nm有較強的吸收峰，對膽紅素的測量造成干擾。但巧合的是，血紅蛋白在550 nm處的吸收峰與460 nm處的吸收峰相同。所以QL1200通過檢測到的藍光(中心波長450 nm)和綠光(中心波長550 nm)的差值即可得到較精確的膽紅素的值。但是沒有排除黑色素和真皮厚度的影響。

QL1200的測量范圍是0-427.5 μmol/L。經(jīng)皮膽紅素測定儀早在上世紀80年代即在臨床上開始應用，QL1200代表了早期的應用原理。經(jīng)過不斷的改進，如今市場上常用的經(jīng)皮膽紅素測定儀有JM-103和Bilichek。它們從不同方面對傳統(tǒng)方法進行了改進，使得膽紅素的測量變得更加精確。

1.2 JM-103的工作原理及優(yōu)缺點

1.2.1 JM-103工作原理

黃疸儀JM-103也是通過測量藍光(波長為450 nm)和綠光(波長為550 nm)的光學濃度差來確定皮下組織的膽紅素的含量。

測量探測器有兩個光程(見圖2)。工作時氙弧燈發(fā)出的光會照射到皮膚表面，經(jīng)皮膚及皮下組織的反射和折射后最終回到傳感器中。傳感器由玻璃纖維制造。在返回到玻璃纖維的光中，從皮下組織的淺區(qū)反射的部分最終返回到玻璃纖維的內(nèi)核(短光程)，從皮下組織的深區(qū)反射的部分會穿過玻璃纖維的外核(長光程)，隨后這兩部分會到達光電二極管。通過計算著兩部分的光學濃度從即可得到膽紅素的值。

圖2 JM-103工作原理圖[7]Fig.2 The working principle of JM-103

1.2.2 JM-103的優(yōu)缺點

皮膚分為三層，表皮、真皮和皮下組織。黑色素存在于表皮；真皮中存在豐富的血管和血紅蛋白；由于可見光波長的原因，皮下組織可視為無限厚[8]。JM-103通過計算皮膚深部與淺部的光學濃度差，減少了黑色素的影響，同時應用藍綠兩種波長的光，排除血紅蛋白的影響，故結果與傳統(tǒng)方法相比更為精確。

1.3 Bilichek的工作原理和優(yōu)缺點

1.3.1 Bilichek的工作原理

儀器通過鹵鎢光源發(fā)光，經(jīng)紅外、紫外濾光片后得到白光。白光照射到新生兒的皮膚表面，經(jīng)折射散射后返回微型光譜儀。然后對反射光的100多個波段進行光譜分析，并將反射光的強度轉化為吸收度單位光密度(OD)。繪制總量、膽紅素、黑色素、血紅蛋白和真皮的OD曲線，然后經(jīng)過專門的算法得出血清膽紅素的OD值(OD 膽紅素=OD總量-OD黑色素-OD血紅蛋白-OD真皮)。

1.3.2 Bilichek的優(yōu)點

JM-103和Bilichek是目前市場上最常用的兩種經(jīng)皮膽紅素測定儀。有多位學者對它們進行過比較。Pratesi S等人發(fā)現(xiàn)[9]，Bilichek 和JM-103經(jīng)皮膽紅素測定儀相關性良好，但是與JM-103相比，Bilichek 在膽紅素輕或中度升高時會高估膽紅素的值，在膽紅素重度升高時會低估膽紅素的值；通過對133名早產(chǎn)兒的研究，Ebbesen F等人發(fā)現(xiàn)[10]，JM-103的測量值比Bilichek的測量值低得多，當膽紅素濃度增加時，JM-103測量值增加的程度卻被過低估計。在對630名新生兒進行研究后，Costantino等人發(fā)現(xiàn)[11]，JM-103相較于Bilichek在精確度上略有優(yōu)勢，但是在高膽紅素水平的情況下的應用還有待進一步研究。

下面(表1)是三種經(jīng)皮膽紅素測定儀的性能比較：

由于實際檢測中人體內(nèi)影響機制不夠明確，方法構建的理論假設比較理想化，還有干擾物的影響，市場上經(jīng)皮膽紅素監(jiān)測儀雖然與血液中總膽紅素TSB相關性良好，但是普遍精度不高。并且是否接受光療、測定部位、年齡、種族、性別、身體狀況(是否貧血等)都會對膽紅素的測量造成影響[12]。

1.4 經(jīng)皮膽紅素儀的臨床應用

因為膚色對QL-1200影響較大，實際監(jiān)測結果較總血清膽紅素(total serum bilirubin, TSB)誤差顯著，目前基本被淘汰，故不再過多贅述。JM-103、Bilichek以及一些其他品牌型號的經(jīng)皮膽紅素儀占據(jù)目前主流市場，較新的臨床統(tǒng)計研究也多以此類膽紅素儀為基礎。首先，Yvonne M等人報道經(jīng)皮膽紅素值(transcutaneous bilirubin, TcB)與TSB具有良好的相關性[13]，P值均小于0.0001，JM-103和Bilichek的相關系數(shù)分別為0.70和0.88，其他文獻也認為Bilichek比JM-103具有更好的預測效果[14,15]。國內(nèi)雖然沒有直接關于JM-103和Bilichek比較的文獻，但是TcB和TSB相關性亦較好，甚至還要優(yōu)于國外報道(相關系數(shù)最高達0.909，最低為0.795)[16]。其次，因為新生兒肝功能尚不完全，由自體肝臟產(chǎn)生的結合膽紅素極少，故陳麗等人對TcB和間接膽紅素的擬合度及TcB和TSB的擬合度分別進行了統(tǒng)計分析，結果表明間接膽紅素與TcB的相關程度(r=0.995)比TSB的相關程度(r=0.891)更高，P均小于0.001，說明TcB更能反應間接膽紅素并以此評估黃疸輕重[17]。但是，TcB的檢測仍有不可忽視的局限性存在，金霞等人的研究中，在輕度高膽紅素血癥時，TcB與TSB的相關系數(shù)為0.909，但在中重度高膽紅素血癥的新生兒中，TcB與TSB的相關系數(shù)將顯著下降，僅為0.639，意味著單純TcB檢測可能會延誤中重度高膽紅素血癥患兒病情或者過度治療[18]。

此外，還有學者通過研究利用手機拍照來測定新生兒黃疸。在2014年GREEF L D等人研發(fā)了一個新的、可以檢測新生兒黃疸的軟件，Bilicam[19]。

表1 三種經(jīng)皮膽紅素測定儀性能比較Tab.1 Performance comparison of three kinds of percutaneous bilirubin analyzer

2 拍照檢測膽紅素

2.1 Bilicam的工作原理

將顏色校準卡置于新生兒的胸骨處，然后用手機進行拍照，最后對圖像進行處理得到相應的膽紅素的值。顏色校準卡可以平衡圖像顏色，因為在不同的光照條件下采集到的圖像可能會有很大的區(qū)別。通過機器學習(圖3)來估計膽紅素水平，Bilicam所得的結果與金標準TSB所得的結果線性相關系數(shù)為0.85[20]。

胸骨處的皮膚無法排除黑色素、血紅蛋白和真皮厚度的影響，而鞏膜為瓷白色，不含黑色素，血管也極少。2015年，Terence S Leung等人提出了用數(shù)字攝影技術檢查新生兒鞏膜黃疸[21],他們在對新生兒鞏膜拍照后得到相應的圖像，利用matlab軟件對這些圖像進行了分析。然后基于測量的TSB水平和數(shù)據(jù)庫中的顏色指標建立一個多變量模型，再用matlab及其統(tǒng)計資料和機器學習工具箱進行多元線性回歸。最后可以得到估計膽紅素水平的模型，此方法的線性相關系數(shù)為0.75。

2.2 拍照檢測膽紅素類軟件的應用

Bilicam是華盛頓大學的研究者基于100名新生兒出生后2-5天的TSB和帶有校準卡的胸部照片數(shù)據(jù)開發(fā)的主要用于院外黃疸檢測篩查的手機APP，Bilicam一重要優(yōu)勢在于獲取更多的新生兒數(shù)據(jù)后，可以進一步優(yōu)化算法，提高檢測準確性[20]。2017年，華盛頓大學James等人基于530例樣本進一步更新Bilicam后，和TSB相比總相關系數(shù)已經(jīng)高達0.91，白人、非裔、西班牙裔、亞裔膚色相關系數(shù)分別為0.92、0.90、0.91和0.88，兩種截斷值的診斷靈敏度為84.6%和100%，特異度為75.1%和76.4%，其診斷準確程度已經(jīng)不亞于經(jīng)皮膽紅素儀測定的結果[22]。

圖3 新生兒黃疸檢測系統(tǒng)原理[18]Fig.3 Principle of neonatal jaundice detection system

3 總結和展望

綜上所述，目前臨床上常用的膽紅素無創(chuàng)篩查工具為經(jīng)皮膽紅素測定儀，最廣泛用于新生兒黃疸的篩查，其中最普及的兩種經(jīng)皮膽紅素測定儀為JM-103和Bilichek，它們都是利用光對人體組織進行檢測，處理方法有所不同，在一定范圍內(nèi)較為精確，在膽紅素過高或較低時不太準確。由于經(jīng)皮膽紅素測定儀的成本太高，僅限于有條件的醫(yī)院使用，為了在家庭里也能方便快捷地測量膽紅素，研究人員開始著手于開發(fā)相應的手機拍照軟件對胸骨或者鞏膜進行膽紅素的測量，經(jīng)過不斷的軟件優(yōu)化更新，拍照膽紅素測定與金標準TSB的偏差正在迅速縮小。雖然目前無創(chuàng)的膽紅素光學檢測方法多應用于新生兒，但是現(xiàn)有的研究已經(jīng)證明上述無創(chuàng)方法的精確度正逐步提高，且與游離膽紅素有更好的擬合程度[17]，因此可以預見，經(jīng)過改良更新后經(jīng)皮膽紅素檢測儀或拍照膽紅素檢測軟件極有希望應用于更廣泛人群的膽紅素初篩當中，具有巨大的前景。