孤兒核受體Nr6a1的生物學(xué)功能與表達(dá)調(diào)控機(jī)制

劉曉雯，劉華偉，王偉龍，李 丹

(湖南大學(xué)生物學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410082)

1994年，F(xiàn)ang Chen和Austin J Cooney等人[1]從小鼠中克隆出一個(gè)核受體亞家族稀有成員-孤兒核受體亞家族6成員1(nuclear receptor subfamily 6 group member1，Nr6a1)，也稱(chēng)為生殖細(xì)胞核因子(germ cell nuclear factor，GCNF)，或維甲酸相關(guān)受體睪丸相關(guān)受體(retinoic acid receptor-related testis-associated receptor，RTR)，后來(lái)又陸續(xù)從人、斑馬魚(yú)以及非洲爪蟾等物種中克隆出其cDNA序列[2]。人Nr6a1定位于9號(hào)染色體，小鼠Nr6a1定位于2號(hào)染色體。在不同物種間Nr6a1的同源性很高，因而在功能上也具高度保守性，其配體未知，屬于孤兒核受體。目前已知Nr6a1有三種轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本1大小為2.1 kb，其僅在睪丸中表達(dá)，體細(xì)胞中表達(dá)極低甚至沒(méi)有；轉(zhuǎn)錄本2大小為3.1 kb，在小鼠附睪中受雄激素負(fù)調(diào)控；轉(zhuǎn)錄本3大小為7.4 kb，其在睪丸組織和體細(xì)胞中均有表達(dá)，在小鼠附睪中也受到雄激素負(fù)調(diào)控，且在小鼠胚胎癌干細(xì)胞P19中受孕激素和雌激素正調(diào)控。其中轉(zhuǎn)錄本1和3擁有同樣的閱讀框，區(qū)別僅在于3′非編碼區(qū)和5′非編碼區(qū)域(untranslated region, UTR)序列：7.4 kb轉(zhuǎn)錄本的3′UTR有4 451個(gè)核苷酸；2.1 kb轉(zhuǎn)錄本的3′UTR僅有202個(gè)核苷酸。在睪丸發(fā)育階段，7.4 kb轉(zhuǎn)錄本比2.1 kb轉(zhuǎn)錄本表達(dá)更早。三個(gè)轉(zhuǎn)錄子編碼的蛋白大小一致，均為55 kD[3,4]。

Nr6a1的結(jié)構(gòu)與其它孤核受體結(jié)構(gòu)基本一致，如圖1，都包含N端區(qū)域(功能未知)、鉸鏈區(qū)(基因結(jié)合區(qū))、配體結(jié)合區(qū)域等[5-7]。大多數(shù)孤核受體的配體結(jié)合域末端都存在具有轉(zhuǎn)錄功能激活域2(auxiliary factor, AF-2)的結(jié)構(gòu)，用于核受體的激活，并且此區(qū)域以配體依賴(lài)的方式募集共激活子而發(fā)揮功能[8]。而Nr6a1第12螺旋處孤核受體保守的氨基酸殘基被賴(lài)氨酸所代替，因此不具有AF-2功能，它是以同源二聚體的形式發(fā)揮功能[4]。研究表明，Nr6a1能夠特異性與雌激素重復(fù)的半位點(diǎn)(5′-TCAAGGTCA-3′)直接結(jié)合，半位點(diǎn)之間是零堿基對(duì)或是單個(gè)半位點(diǎn)的延伸，這個(gè)半位點(diǎn)稱(chēng)為DR0元件[1,9]。Nr6a1與靶基因啟動(dòng)子上的DR0位點(diǎn)結(jié)合后發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的作用，并且它還可以抑制其它核受體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活作用[6]。

圖1 孤兒核受體Nr6a1和其他核受體蛋白結(jié)構(gòu)功能域示意圖(根據(jù)文獻(xiàn)[48]改編)Fig.1 Orphan nuclear receptor Nr6a1 and other nuclear receptor protein structure/functional domain schematicA/B：一個(gè)可變的N末端并且功能未知；C：DBD包含兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可以折疊成一個(gè)單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域，它們與核心序列5-TCAAGGTCA-3作為單體結(jié)合；D：一個(gè)可變的鉸鏈域；E：LBD是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控域，具有多重相互作用的表面，Nr6a1的LBD末端不具有AF-2；F：一個(gè)可變的C末端A/B：A variable N-terminal region and its function is unknown;C:DNA bind domain contains two zinc-binding modules that fold to form a single structural domain that they binding with the core sequence 5-TCAAGGTCA-3 as monomers;D:A variable hinge region;E:Ligand binding domain is a key regulatory domain with multiple interaction surfaces,Nr6a1 does not have a conserved AF2 domain at the C terminal end of the LBD;F:A variable C-terminal region

1 Nr6a1的組織表達(dá)譜特征

1.1 在正常組織中的表達(dá)

Nr6a1在發(fā)育中的胎盤(pán)、神經(jīng)系統(tǒng)以及成年人類(lèi)和動(dòng)物睪丸、卵巢中高表達(dá)。在成年動(dòng)物的前列腺、肝、脾、小腸、直腸、肺以及腦等器官中低表達(dá)。另外，Nr6a1在成年小鼠附睪中也能檢測(cè)到[1,2,10]。

在雄性生殖細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)Nr6a1在小鼠睪丸發(fā)育的第8天開(kāi)始表達(dá)，主要定位于B型精原細(xì)胞，表明Nr6a1參與了早期精子發(fā)生的過(guò)程。Nr6a1在早期精母細(xì)胞和支持細(xì)胞中不表達(dá)，卻在粗線(xiàn)期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的異染色質(zhì)區(qū)域中表達(dá)，提示Nr6a1在精子發(fā)生的特定階段發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[11]。在雌性中，Nr6a1在卵母細(xì)胞中有表達(dá)，在原始卵泡中表達(dá)缺失[12]，提示其在卵母細(xì)胞成熟中也發(fā)揮一定的功能。

1.2 在腫瘤組織中的表達(dá)

已有研究顯示，Nr6a1在精原細(xì)胞瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤、卵黃囊瘤、胚胎性癌、未成熟畸胎瘤中均有表達(dá)。在惡性程度較高的卵黃囊瘤或胚胎性癌中，Nr6a1呈中等或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；在惡性程度相對(duì)低一些的精原細(xì)胞瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤中，Nr6a1呈弱陽(yáng)性，結(jié)果表明Nr6a1的表達(dá)水平可能與腫瘤的惡性程度相關(guān)[13]。研究表明，Nr6a1在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞以及胚胎癌干細(xì)胞P19和NTera-2細(xì)胞中均有表達(dá)[14]，最近有報(bào)道，與正常乳腺組織相比，NR6A1在雌激素受體陽(yáng)性(estrogen receptor positive, ER+)乳腺癌和雌激素受體陰性(estrogen receptor negative, ER-)乳腺癌中表達(dá)量較低，然而在三陰性(triple negative, TN) 乳腺癌組織中表達(dá)量較高[15,16]。此外，相比于正常前列腺，NR6A1在前列腺癌中高表達(dá)[17]。

2 Nr6a1的生物學(xué)功能

迄今為止，對(duì)Nr6a1基因功能的研究主要集中在分化、發(fā)育、代謝和生殖等領(lǐng)域。

2.1 Nr6a1參與細(xì)胞的分化與發(fā)育

研究表明在卵母細(xì)胞中Nr6a1的突變導(dǎo)致女性生育能力下降。在胚發(fā)育階段Nr6a1表達(dá)對(duì)正常的胚胎形成是至關(guān)重要的，當(dāng)Nr6a1丟失會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育10.5天時(shí)期的胚胎死亡并造成多重缺陷，包括胎盤(pán)和心血管缺陷、后截?cái)嘁约捌茐恼＼|體形成和神經(jīng)管的形成[18]。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)的自我更新是通過(guò)一些重要轉(zhuǎn)錄因子維持的，如Oct4、Sox和Nanog，這些轉(zhuǎn)錄因子維持了ESC的多能性。在ESC分化時(shí)，這些多能性調(diào)節(jié)因子首先受到抑制[19]。例如，Oct4是ESC未分化狀態(tài)的標(biāo)志分子，Nr6a1能夠特異性募集甲基化的CpG結(jié)合域和甲基轉(zhuǎn)移酶到Oct4啟動(dòng)子上導(dǎo)致Oct4的表達(dá)抑制，進(jìn)而阻止ESC分化時(shí)的多能性表型[20,21]，由此調(diào)控整個(gè)胚胎發(fā)育的進(jìn)程。研究表明，在人胚胎癌干細(xì)胞中，Nr6a1均可通過(guò)直接與Oct4啟動(dòng)子上DR0元件結(jié)合抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)分化過(guò)程[7]。這提示我們Nr6a1對(duì)ESC的自我更新和發(fā)育進(jìn)程發(fā)揮重要作用。此外，在神經(jīng)干細(xì)胞中Nr6a1也能夠直接靶向并抑制Oct4的表達(dá)從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[22]。

研究顯示miR-302a在人ESC中高表達(dá)，Oct4和Sox與miR-302a啟動(dòng)子區(qū)直接結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活miR-302a的表達(dá)，并且miR-302a對(duì)ESC的增殖發(fā)揮重要的作用[23]。Hongran Wang等人[24]發(fā)現(xiàn)miR-302a啟動(dòng)子上有DR0元件，隨后通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)證明在ESC中Nr6a1能夠與miR-302a結(jié)合并抑制miR-302a的表達(dá)，同時(shí)miR-302a又能夠直接靶向降解CyclinD1。作者因此提出Nr6a1間接促進(jìn)CyclinD1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)ESC的增殖。

表皮生長(zhǎng)因子1(epidermal growth factor-like cripto1，CR-1)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化，同時(shí)也是神經(jīng)形成的負(fù)調(diào)節(jié)因子。在小鼠的成體組織中CR-1蛋白表達(dá)水平低，在胚胎早期發(fā)育階段廣泛表達(dá)，并發(fā)揮重要的調(diào)控功能，比如調(diào)節(jié)胚胎前后軸的形成和左右軀體的不對(duì)稱(chēng)性以及促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化[25]。最近研究證明在NTera-2細(xì)胞中，Nr6a1與核受體肝臟受體類(lèi)似物1(liver receptor homolog, LRH-1)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合到CR-1啟動(dòng)子DR0元件，Nr6a1發(fā)揮抑制CR-1表達(dá)的功能[14,26]，進(jìn)一步證明Nr6a1在胚胎分化與發(fā)育發(fā)揮重要作用。

2.2 Nr6a1參與細(xì)胞代謝

線(xiàn)粒體甘油-3-磷酸脫氫酶(mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenas，mGPDH)是甘油磷酸鹽穿梭機(jī)制的必要組成，將細(xì)胞質(zhì)中減少的物質(zhì)等量轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體內(nèi)。在mGPDH作用下，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化成二羥基丙酮磷酸鹽，從而使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的NADH氧化[27]。研究表明mGPDH促進(jìn)有氧代謝，在精子獲能過(guò)程中發(fā)揮作用；阻斷mGPDH的表達(dá)則導(dǎo)致男性生育能力下降。cAMP應(yīng)答元件調(diào)節(jié)因子τ(cAMP-response element modulator τ，CREMτ)是一種特異性睪丸轉(zhuǎn)錄激活因子，其也能夠與mGPDH啟動(dòng)子上的DR0元件結(jié)合，激活mGPDH表達(dá)。在精子獲能過(guò)程中，Nr6a1作為轉(zhuǎn)錄抑制因子與CREMτ競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合mGPDH啟動(dòng)子上的DR0元件調(diào)節(jié)mGPDH的表達(dá)[28,29]。由此可以知道在睪丸組織中Nr6a1通過(guò)與CREMτ相互作用共同調(diào)節(jié)mGPDH蛋白的表達(dá)從而影響精子獲能進(jìn)而影響雄性生殖力。

2015年WANG Y F等人[30]通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nr6a1直接與分泌性焦磷酸蛋白(secreted phosphoprotein, SPP1)啟動(dòng)子上結(jié)合，并證明Nr6a1通過(guò)CRE位點(diǎn)(cAMP response element，CRE)調(diào)節(jié)SPP1啟動(dòng)子活性，從而抑制SPP1蛋白在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄。

過(guò)氧化物酶體增生物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs)，是類(lèi)固醇類(lèi)受體亞家族的一員[31]，包含三種亞基：PPARα、PPARδ和PPARγ[32]。其中，PPARδ參與骨的形成、脂質(zhì)代謝以及表皮成熟。PPARδ缺失的小鼠會(huì)導(dǎo)致小鼠胚盤(pán)缺陷，妊娠中期死亡等[33]?，F(xiàn)已證明在睪丸組織內(nèi)，PPARδ是Nr6a1的靶基因，Nr6a1會(huì)抑制PPARδ的表達(dá)[34]，提示Nr6a1可能參與了調(diào)節(jié)PPARδ信號(hào)通路功能的一部分。

以上研究顯示，Nr6a1直接靶向mGPDH、SPP1和PPARδ等細(xì)胞代謝小分子，從而間接影響細(xì)胞的有氧代謝和脂質(zhì)代謝，表明Nr6a1可能通過(guò)影響睪丸細(xì)胞代謝進(jìn)而調(diào)控其發(fā)育進(jìn)程。

2.3 Nr6a1參與配子發(fā)生

精蛋白是精子形成的重要標(biāo)志之一。精蛋白是由高度保守的基因家族編碼的,兩種精蛋白Prm1和Prm2在精子形成和雄性配子的終端分化中發(fā)揮重要作用。Till P Schmitz等人[35]證明Nr6a1與Prm1和Prm2啟動(dòng)子上的DR0元件結(jié)合共同調(diào)節(jié)精蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控精子的發(fā)生。在雌性生殖發(fā)育中，Nr6a1還調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteinv15, BMP15)和生長(zhǎng)分化因子(growth differentiation factors 9, GDF-9)的表達(dá)而直接調(diào)控卵母細(xì)胞與體細(xì)胞之間的旁分泌通訊，進(jìn)而影響雌性生育能力[36]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在生長(zhǎng)21天和56天小鼠睪丸內(nèi)處于減數(shù)分裂前期精子發(fā)生的細(xì)胞中檢測(cè)到Nr6a1蛋白高表達(dá)，在卵巢中初級(jí)卵母細(xì)胞到排卵期卵母細(xì)胞均能檢測(cè)到Nr6a1蛋白質(zhì)表達(dá)，以及未受精的卵母細(xì)胞中也能檢測(cè)到Nr6a1蛋白質(zhì)的表達(dá)[37]。小鼠性腺中Nr6a1的存在表明Nr6a1在精子發(fā)生以及卵母細(xì)胞成熟中扮演一個(gè)重要角色。

3 Nr6a1的表達(dá)調(diào)控

Nr6a1作為轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其自身的表達(dá)也受到其他因子的調(diào)節(jié)。目前研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNAs)、激素以及全反式視黃酸(all-trans retinoic acid, RA)等信號(hào)分子參與了對(duì)Nr6a1的調(diào)控。

3.1 MicroRNAs

MicroRNAs(miRNAs)是一段長(zhǎng)約有22個(gè)寡核苷酸的小RNA，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)過(guò)程，包括有機(jī)體發(fā)育、增殖以及凋亡等。2008年，Peili Gu等人[38]通過(guò)微陣列篩選出一批能夠抑制Nr6a1表達(dá)的miRNAs，比如miR-10a, miR-138, miR-199a-3p，miR-181a等，這些miRNAs在胚胎干細(xì)胞的自我更新、增殖和分化中發(fā)揮重要作用，其中miR-181a被證實(shí)能夠直接靶向Nr6a13，UTR，從而抑制胚胎干細(xì)胞的增殖和分化。再如，let-7是一種高度保守的miRNAs，let-7過(guò)表達(dá)會(huì)抑制胚胎干細(xì)胞的多能性并促進(jìn)小鼠和非洲爪蟾蜍胚胎的中胚層和外胚層發(fā)育[39]。近年，Gurtan等人[40]通過(guò)高通量測(cè)序和染色質(zhì)免疫沉淀等方法證明let-7能夠直接靶向抑制Nr6a1，并且Nr6a1在胚胎發(fā)育8.5天時(shí)表達(dá)量最高，隨后在整個(gè)小鼠胚胎中與let-7呈負(fù)相關(guān)的下調(diào)，由此可以看出Nr6a1是let-7調(diào)控妊娠中期發(fā)育的一部分。

3.2 雄激素

已知睪丸和附睪大多數(shù)蛋白的表達(dá)受到雄激素的調(diào)控，并且雄激素影響圓形精子的數(shù)量，研究顯示Nr6a1 2.3 kb mRNA主要在圓形精子中表達(dá)[41]，提示其可受雄激素調(diào)控。此外，在減數(shù)分裂后的睪丸生殖細(xì)胞中，Nr6a1直接靶向促性腺激素調(diào)節(jié)的睪丸RNA解旋酶(gonadotropin-regulated testicular RNA helicase，GRTH)上DR0位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)其表達(dá)調(diào)控，而GRTH是睪丸特異性蛋白，主要參與精子發(fā)生過(guò)程，其在生殖細(xì)胞中響應(yīng)雄激素的刺激[42]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)證明小鼠附睪中雄激素能夠與7.4 kb Nr6a1和3.1 kb Nr6a1啟動(dòng)子結(jié)合從而抑制小鼠附睪中這兩種Nr6a1的表達(dá)[43]。Nr6a1在小鼠附睪的區(qū)域表達(dá)模式表明,它在調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，這可能是精子成熟的必要條件。

3.3 全反式視黃酸

大量研究表明Nr6a1的表達(dá)直接受到維甲酸(retinoic acid, RA)的調(diào)控，因此被稱(chēng)為視黃酸受體相關(guān)睪丸相關(guān)核受體。RA作用的受體都含有一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合區(qū)，一個(gè)連接鉸鏈區(qū)和一個(gè)配體結(jié)合區(qū)。大多數(shù)受體，以單體形式與DNA結(jié)合區(qū)結(jié)合，RA作用的受體都能特異性識(shí)別含有AGAACA和AGGTCA序列[44]。上個(gè)世紀(jì)末，研究發(fā)現(xiàn)胚胎瘤干細(xì)胞(PCC7-Mz1，NT-2，P19，F(xiàn)9)經(jīng)RA處理后能夠被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞，其中，Nr6a1的表達(dá)呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，并參與了促進(jìn)神經(jīng)和后腦發(fā)育進(jìn)程[45,46]。RA還能夠誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞早期發(fā)育時(shí)期Nr6a1的表達(dá)，此外，RA還能夠促進(jìn)精子發(fā)生[47]，因此RA對(duì)精子的發(fā)生與調(diào)控是否通過(guò)調(diào)節(jié)Nr6a1來(lái)實(shí)現(xiàn)尚是一個(gè)有待深入探討的重要生物學(xué)問(wèn)題。

4 展望和結(jié)語(yǔ)

自Nr6a1發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在其研究領(lǐng)域內(nèi)取得了一系列重要進(jìn)展。如圖2所示，鑒定了一批Nr6a1的靶基因，包括PPARβ、Oct4、Nanog、CR-1和miRNA302a等，其中Nr6a1對(duì)胚胎干細(xì)胞的分化、胚胎發(fā)育和生殖細(xì)胞形成等方面的研究較為深入。特別是研究發(fā)現(xiàn)Nr6a1在精子發(fā)生以及精子獲能方面發(fā)揮重要作用，提示Nr6a1很有可能是治療雄性不育的候選靶分子。 本課題組發(fā)現(xiàn)在小鼠精原細(xì)胞GC-1spg中，Nr6a1 受miR-181b-5p的靶向抑制參與了對(duì)GC-1spg細(xì)胞增殖與遷移的負(fù)調(diào)控[49]。另有一些研究探討了Nr6a1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，例如發(fā)現(xiàn)Nr6a1在胚胎癌干細(xì)胞中的高表達(dá)以及在腫瘤抑制中扮演一個(gè)十分重要的角色。最近本課題組研究發(fā)現(xiàn)Nr6a1能夠通過(guò)DR0位點(diǎn)抑制多個(gè)代謝酶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)胚胎癌干細(xì)胞的代謝，從而影響癌細(xì)胞的增殖與遷移(研究結(jié)果待發(fā)表)提示Nr6a1有可能作為腫瘤治療的候選靶點(diǎn)。但目前對(duì)Nr6a1互作蛋白的確定、新的靶基因的篩選以及其在腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制的了解還不是很透徹。因此，對(duì)Nr6a1在更廣泛的生物學(xué)過(guò)程中的功能探索方興未艾。

圖2 孤兒核受體Nr6a1對(duì)細(xì)胞分化、發(fā)育、代謝、生殖的影響Fig.2 The effects of Nr6a1 on cell development, differentiation, metabolism and reproduction